吡咯伯克霍爾德氏菌Burkholderia puraquae新型磷脂酶C催化特性及其應用研究

李科娜,吳楠,楊旭,孫永威,段晨陽,張志平,宋麗麗,張靖楠,魏濤

(鄭州輕工業大學 食品與生物工程學院,河南 鄭州,450002)

毛油中磷脂成分是影響植物成品油氣味、口感、外觀及保質期的重要因素之一,因此油脂精煉過程脫膠效果直接影響油脂精煉的效率和最終產品質量[1-4]。傳統脫膠工藝存在污水排放量大、中性油脂消耗大、殘磷量高等問題,因此會增加后續油脂精煉的工藝步驟[5-6]。酶法脫膠是一種植物油脂脫膠的綠色新工藝,與傳統脫膠工藝相比,酶法脫膠具有脫膠完全、用水量和廢水排放少、耗能低、精煉得率高等優點,因此備受世界各國油脂加工工業的關注[7-9]。磷脂酶是應用于植物油脂酶法脫膠的重要工業酶,根據作用磷脂位點不同,可以分為磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶B和磷脂酶C,其中磷脂酶A1和磷脂酶A2是目前酶法脫膠中應用最多的磷脂酶[10-13]。

磷脂酶C(phospholipse C, PLC)是一種水解甘油磷脂Sn-3位點甘油磷酸酯鍵的脂類水解酶,水解產物為甘油二酯及有機磷酸酯(磷酸膽堿、磷酸乙醇胺或磷酸肌醇等)[14-15]。PLC廣泛存在于原核生物和真核生物中,相關基因已在動物、植物、酵母、細菌等多種生物中鑒定與分析[16]。PLC作用于磷脂分子的酯鍵,生成易溶于水的磷酸酯等而被脫除,同時生成甘油二酯進而增加中性油的得率,因此PLC是油脂精煉得率最高的酶法脫膠方式。目前已報道PLC存在催化活性低、穩定性不高、微生物來源酶不易分離純化和重組酶多以包涵體表達等問題,因此亟需尋找適用于油脂酶法脫膠的新型酶源[17-20]。本研究利用分子克隆方法從吡咯伯克霍爾德氏菌(Burkholderiapuraquae)克隆表達新型PLC基因plc_bp,利用大腸桿菌表達系統實現可溶性表達,通過熱處理、鎳柱親和層析和分子篩層析獲得純化重組酶,詳細研究重組酶酶學性質、結構與功能以及油脂脫膠效果,為植物油脂酶法脫膠提供新的酶源,為酶法脫膠的工業化應用提供理論和應用基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要菌株與質粒

吡咯伯克霍爾德氏菌B.puraquae、大腸桿菌EscherichiacoliDH5α、E.coliBL21-CodonPlus(DE3)-RIL和質粒pET28a,本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑與原料

PfuDNA聚合酶、限制性內切酶NdeⅠ和SalⅠ、DNA連接試劑盒,寶生物工程(大連)有限公司;磷脂酰膽堿(phosphatidyl cholines, PC)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine, PE)、磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol, PG),美國Avanti公司;對硝基苯基磷酰膽堿(p-nitrophenylphosphorylcholine, NPPC)、PCR引物、卡那霉素、異丙基-那霉素、異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside, IPTG)等,生工生物工程(上海)股份有限公司;大豆油、花生油毛油,金太陽糧油股份有限公司;葵花籽油、粗菜籽油毛油,河南省淇花食用油有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組酶PLC_BP生物信息學分析

利用NCBI網站BLASTp和Clustal X 2.0軟件,對B.puraquae重組磷脂酶PLC_BP及其同源蛋白氨基酸序列進行比對分析。利用同源建模軟件SWISS-MODEL和Pymol對PLC_BP三維結構進行預測和分析。

1.2.2 PLC_BP基因克隆

根據B.puraquae重組磷脂酶PLC_BP基因核苷酸序列,設計并合成引物。上游引物:5′-CAGCCATATGGGCCAGAAAACGTCTGCGACC-3′;下游引物:5′-TCGCGGATCCTCAGGCAGTGGCCTTGGCC-3′。在上下游引物5′端分別設計NdeⅠ與BamH Ⅰ酶切位點(劃線部分表示),由上海生工公司合成。100 μL PCR反應體系:模板DNA 1.0 μL(20 ng),dNTP 1.0 μL(25 mmol/L),引物(100 μmol/L)各1.0 μL,10×緩沖液10 μL,PfuDNA聚合酶(5 U/μL)1.0 μL,超純水43.0 μL。PCR反應條件:94 ℃ 5 min、94 ℃ 45 s、58 ℃ 60 s、72 ℃ 1.5 min,30個循環。PCR產物經雙酶切后連接到pET28a上,轉化大腸桿菌E.coliDH5α并篩選重組質粒,經NdeⅠ與BamH Ⅰ雙酶切及上海生工測序驗證后將其命名為pET28a-PLC_BP。

1.2.3 重組蛋白的表達與純化

挑取平板上生長的菌落于含有50 μg/mL卡那霉素的30 mL LB液體培養基中,37 ℃、200 r/min過夜培養。按照體積分數2%接種量進行擴大培養,轉接于含有50 μg/mL卡那霉素的600 mL LB液體培養基,培養至OD600 nm為0.6～0.8,加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG于30 ℃繼續培養8 h,4 ℃、8 000×g離心20 min。向所得菌體中添加破壁buffer(50 mmol/L Tris-HCl,pH 7.9,50 mmol/L NaCl),懸浮菌體后于冰上進行超聲波破碎10 min。按照破壁buffer的0.1%體積分數添加Triton X-100,于4 ℃、75 r/min振蕩2.5 h,取1 mL留樣為全蛋白。超聲波破碎菌體后60 ℃熱處理30 min,4 ℃、8 000×g離心20 min,上清液即為粗酶液。采用鎳柱親和層析方法進行目的蛋白的純化,以20～500 mmol/L的線性咪唑(流速1 mL/min)梯度洗脫重組酶。利用Superdex 200(16/60)凝膠過濾柱進一步純化蛋白,以緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl,pH 7.4,200 mmol/L NaCl)洗脫目的蛋白。SDS-PAGE來檢測純化效果,蛋白質濃度用考馬斯亮藍比色Bradford方法測定。

1.2.4 重組酶PLC_BP活性的檢測

在96孔板中測定PLC_BP活性,具體酶活性反應體系:1 mmol/L NPPC底物、1 μmol/L純化酶蛋白、60%(體積分數)山梨醇、1 mmol/L MnCl2和反應緩沖液50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.5),60 ℃反應30 min,并在405 nm下測定吸光度。酶活力單位定義:每分鐘生成1 mmol對硝基苯酚所需的酶量為1個酶活力單位。

1.2.5 重組酶PLC_BP酶學性質研究

1.2.5.1 底物特異性

分別以PC、PE和PG為反應底物,于標準反應體系中測定酶活力,測定重組酶PLC_BP的底物特異性。

1.2.5.2 最適反應溫度與熱穩定性

最適反應溫度:以1 mmol/L NPPC作為反應底物,緩沖體系為50 mmol/L的Tris-HCl(pH 8.5),反應時間30 min,在25～80 ℃,每隔5 ℃測酶活力。酶的熱穩定性:取相同濃度的酶置于不同溫度(50、60、70 ℃)下,分別保溫0～8 h后,在標準體系下檢測酶活力。

1.2.5.3 最適反應pH

在不同pH(6.0～11.0)的緩沖液下測酶活力。所用緩沖液為50 mmol/L的磷酸鈉緩沖液(pH 6.0～7.5)、Tris-HCl緩沖液(pH 7.5～9.5)和3-環己氨基丙磺酸緩沖液(pH 9.5～11.0),反應溫度60 ℃,底物為NPPC,對照不加酶,以相應pH的緩沖液代替。

1.2.5.4 金屬離子對酶活性的影響

研究不同金屬離子對PLC_BP活力的影響。在標準反應體系中分別加入不同的金屬離子溶液(Zn2+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+、Ni2+和Cu2+)至終濃度為5 mmol/L,室溫放置60 min,以NPPC為底物,以不加任何金屬離子的酶促反應物為對照,60 ℃反應測酶活力。

1.2.6 酶法脫膠

參照YANG等[21]的方法稍作改進,用PLC_BP對油菜籽油、大豆油、花生油及向日葵籽油進行酶法脫膠工藝研究。100 g毛油加入0.1 mL檸檬酸溶液(450 g/L),置于可以密封的錐形瓶,10 000 r/min均質1 min,于75 ℃、500 r/min孵育20 min。將混合液10 000×g離心10 min。向上清混合液中加入一定量檸檬酸溶液(0.1 mmol/L)調節pH。加入2 mg純化后的PLC_BP(250 U/mg),并加入2 mL去離子水,5 000 r/min均質1 min進行乳化,酶脫膠過程在65 ℃、500 r/min條件下進行。反應結束后,進行磷含量和脂肪酸分析。磷含量分析方法:油乳樣品10 mL,80 ℃水浴加熱10 min,10 000×g離心10 min,取5 g上清油,使用GB/T 5537—2008《糧油檢驗 磷脂含量的測定》中的鉬藍比色法進行磷含量分析。游離脂肪酸含量根據AOCS Ca 5a-40《Free Fatty Acids》中的方法進行測定。

2 結果與討論

2.1 PLC_BP氨基酸序列分析

NCBI網站中BLAST分析PLC_BP的同源序列,發現在Burkholderialata和Burkholderiacepacia等中存在同源蛋白,相似性在95%以上;PLC193蛋白來自海洋細菌Phaeobactersp.strain MED 193,是課題組前期已經報道的具有水解NPPC和磷脂的PLC;來自Haemophilusinfluenza的HiLpxH(UDP-2,3-二酰基葡萄糖胺水解酶,PDB:5K8K)是PLC_BP同源建模的模板蛋白。利用軟件Clustal X 2.0比對PLC_BP的同源序列,結果如圖1所示,PLC_BP及其同源蛋白具有5個保守結構域[11,15],分別為SDIHL、GDI、GNHD、HGD和GHIH,根據文獻報道預測D93和H169與金屬離子Mn2+存在相互作用關系。

圖1 PLC_BC與同源蛋白氨基酸序列比對Fig.1 PLC_BC alignment with amino acid sequences of congeners注:右邊序號代表氨基酸的位置;陰影部分為保守序列;“*”和“:”分別代表保守的和半保守氨基酸位點;5個保守結構域(SDIHL、GDI、GNHD、HGD和GHIH)已經表示標識;PLC_BP:B.puraquae(WP085042045.1);PLC_BL:B.lata(ABB09191.1);PLC_BC:B.cepacia(WP059531150.1);PLC193:Phaeobacter sp.strain MED 193(EAQ46983.1);HiLpxH:H.influenza(BBF08221.1)。

2.2 重組酶PLC_BP表達及純化

重組質粒pET28a-PLC_BP在E.coliBL21中誘導表達,經熱處理、鎳柱親和層析及分子篩Superdex 200層析純化,得到純化重組酶PLC_BP,分子質量是38.0 kDa。點突變體D93A和H169A表達純化步驟與PLC_BP野生型酶相同,結果如圖2所示。

1-Marker;2-全蛋白;3-粗蛋白;4-鎳柱親核層析純化的酶;5-分子篩Superdex 200層析純化的酶;6-純化后突變體D93A;7-純化后突變體H169A

2.3 最適反應溫度、熱穩定性與反應pH

重組酶PLC_BP的最適溫度為60 ℃,在45～65 ℃時酶活力能保持最大活力的一半以上(圖3-a)。熱穩定性實驗表明,60 ℃處理8 h,重組酶仍然保持50%左右的活力(圖3-b),結果表明重組酶PLC_BP是具有較好的熱穩定性。重組酶最適pH為8.5,pH 7.5～9.5時酶活力能保持最大活力的50%以上(圖3-c)。

a-最適反應溫度;b-熱穩定性;c-最適反應pH

2.4 金屬離子對PLC_BP活力的影響

如圖4所示,Mn2+具有明顯的激活作用,這與文獻報道部分PLC需要Mn2+作為輔助因子是一致的[10-11,15]。分別以Zn2+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Ni2+和Cu2+作為酶反應輔助因子,PLC_BP的活性分別下降到33.1%、15.3%、23.1%、8.3%、11.6%和3.5%,因此PLC_BP是Mn2+依賴性PLC,與氨基酸序列同源性和蛋白同源建模分析結果相一致。

圖4 金屬離子對酶活力的影響Fig.4 Effects of metal ions on enzyme activity

2.5 PLC_BP對天然磷脂的水解特異性

由表1可知, PLC_BP對不同磷脂的kcat/Km值依次為PC[7.3 s-1·(mmol/L)-1]>PE[5.7 s-1·(mmol/L)-1]>PG[1.5 s-1·(mmol/L)-1],表明PC是PLC的最佳底物,PC和PE在植物油中是含量最高的2種磷脂, PLC對PC、PE水解效果好,也為后續油脂脫膠打下了較好基礎。

表1 PLC_BP對不同天然磷脂底物的動力學參數Table 1 Kinetic parameters of PLC_BP on natural phospholipid

2.6 PLC結構的預測

以來自H.influenza的HiLpxH為模板(PDB:5K8K,相似性16%)建立PLC_BP的蛋白結構,如圖5所示。

a-PLC_BP預測三維結構的雙核錳離子結合位點;b-PLC_BP催化關鍵位點

預測PLC_BP蛋白結構具有雙核錳離子結合位點(圖5-a),其中處于保守結構域(SDIHL、GDI、GNHD、HGD和GHIH)的殘基D63、H65、D93、N133、H134、H169、H253、H255與酶催化活性關鍵位點,其中D93和H169與金屬離子Mn2+結合存在相互作用(圖5-b)[10-11,15]。通過定點突變構建Mn2+結合關鍵位點D93A和H169A,對比分析野生型和突變體動力學(表2),發現D93A和H169A的Km為468.4和382.6 mmol/L,大于野生型酶的Km值(214.2 mmol/L),突變體酶與底物NPPC的結合能力低于野生型酶;對比分析催化效率,突變體酶D93A和H169A的kcat/Km為8.1和6.5 s-1·(mmol/L)-1,遠低于野生型酶的kcat/Km值(253.5 mmol/L),突變體酶催化效率也低于野生型酶,以上結果表明氨基酸位點D93和H169與金屬離子Mn2+結合有關。

表2 PLC_BP與突變體對NPPC底物的動力學參數Table 2 Kinetic parameters of wild-type and site-directed mutants of PLC_BP and on NPCC substrate

2.7 PLC脫膠效果

脫膠油中磷含量降低(<10 mg/kg)滿足了油脂工業精煉的要求。向檸檬酸處理后的油樣中加入PLC_BP,反應5 h,菜籽油、大豆油和葵花籽油的殘磷量均降至10 mg/kg內(圖6)。酶脫膠反應6 h后,菜籽油、大豆油、花生油和葵花籽油的殘磷量分別為3.5、4.2、2.8和3.4 mg/kg。

圖6 反應時間對PLC_BP脫膠效果的影響Fig.6 Effect of reaction time on degumming of PLC_BP

用PLC_BP進行毛油脫膠會使游離脂肪酸的含量略有增加。如表3所示,PLC_BP對菜籽油、大豆籽油、花生籽油和葵花籽油進行酶法脫膠后(6 h),游離脂肪酸質量分數增加了0.04%～0.08%。據報道,在酶脫膠反應過程中,殘磷含量降低至100 mg/kg時,游離脂肪酸質量分數將增加約0.2%[22]。因此,本實驗中發現游離脂肪酸含量的增加與磷含量的下降(29.5～46.7 mg/kg)基本一致,說明游離脂肪酸濃度增加是磷脂被酶水解的結果。以上結果表明,PLC_BP具有較好的植物油脫膠活性,是一種具有油脂工業應用前景的植物油酶法脫膠的工具酶。

表3 PLC_BP脫膠不同植物油的脂肪酸含量 單位:%

3 結論

本文成功構建吡咯伯克霍爾德氏菌B.puraquae新型PLC原核表達載體pET28a-PLC_BP,將重組質粒轉入大腸桿菌實現可溶性表達。經60 ℃熱處理、鎳柱親和層析和分子篩層析純化,得到純化的重組磷脂酶PLC_BP,SDS-PAGE檢測該酶分子質量是38.0 kDa。酶學性質研究表明,該酶的最適溫度與pH分別為60 ℃與pH 8.5,在最適反應溫度60 ℃處理8 h,酶活力穩定在50%以上。通過氨基酸序列同源性和蛋白質同源建模分析,發現PLC_BP具有5個保守結構域(SDIHL、GDI、GNHD、HGD和GHIH)和2個Mn2+結合關鍵位點(D93A和H169A)。PLC_BP可有效降低不同來源毛油中的磷脂,經過脫膠后菜籽油、大豆油、花生油和葵花籽油的殘磷量分別為3.5、4.2、2.8和3.4 mg/kg,滿足后續油脂精煉要求,為植物油脂酶法脫膠提供新的酶源,為酶法脫膠的工業化應用提供理論和應用基礎。