DHA甘油酯中增塑劑DBP含量的HPLC-MS/MS定性定量分析

＊譚新 陳迪 彭小雨 潘麗娜 李威 汪家琦

（1.湖南萬全裕湘生物科技有限公司 湖南 411300 2.澳優乳業（中國）有限公司 湖南 410000）

DHA甘油酯中增塑劑鄰苯二甲酸二正丁酯（DBP）的含量，是一個重要的控制指標，DBP具有影響生殖、阻止發育等毒性[1]，由于DBP等增塑劑不會與聚合物發生化學結合，而是以自由移動和可浸出相的形式存在，因此，DBP可能會被浸出或從封閉的材料遷移到食品和飲料中。

目前對食品中鄰苯二甲酸酯增塑劑的測定采用的是氣相色譜-質譜聯用（GC-MS），第一法是在試樣中加入氘代鄰苯二甲酸酯作為內標物，各類食品經提取、凈化后進行GC-MS測定，采用特征選擇離子監測掃描模式（SIM），同位素內標法定量，第二法是采用外標法定量；以及彭琪等[2]報道的氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）法沙刺籽油中塑化劑DBP含量的測定和祝偉霞等[3]采用大氣壓化學電離-液相色譜串聯質譜法測定油基食品中的18種鄰苯二甲酸酯類化合物等。

本文建立了電噴霧電離-HPLC-MS/MS定性定量分析DHA甘油酯中DBP的方法，并對DHA甘油酯生產中的各種介質和材料中DBP的含量進行了定量分析，探究了引起產品DHA甘油酯DBP含量升高的主要原因。

1.實驗部分

（1）儀器與試劑。本實驗所使用的主要儀器：UFLC-MS8045超高效液相色譜-串聯質譜儀，AP124Y電子天平，日本島津公司；明杰Smart-S15UV超純水儀，湖南啟沁環保科技有限公司；KM5200FB超聲波清洗儀，昆山美美超聲儀器有限公司；TG16K-11高速離心機，長沙市東旺實驗儀器有限公司；HJ-5多功能磁力攪拌器，金壇市科析儀器有限公司；DRZ-4馬弗爐，長沙實驗電爐廠；SHB-IV循環水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司。

實驗所使用的主要試劑和玻璃器皿：

鄰苯二甲酸二正丁酯，99.81%，Stanford Analysis Chemicals；甲醇、乙腈，GR，天津市科密歐化學試劑有限公司；乙醇，AR，湖南匯虹試劑有限公司；金龍魚油（1:1:1）1.8L，益海嘉里（岳陽）糧油工業有限公司；DHA甘油酯和工藝材料等實驗樣品，湖南萬全裕湘生物科技有限公司。

實驗研究中用到的容量瓶、玻璃滴管、玻璃具塞離心管、燒杯、量筒、玻璃移液管等玻璃器皿，均經過無水乙醇清洗后，置于馬弗爐中450℃焙燒4h，消除來自實驗、溶劑等殘留的DBP干擾。

（2）標準溶液的配制。使用玻璃滴管精確稱量0.0212g DBP標準品于10mL燒杯中，加入乙腈溶解后轉移至500mL容量瓶中，多次使用乙腈洗滌燒杯，將溶液轉移至500mL容量瓶中，使用乙腈稀釋，定容，配制成42.4mg/L的DBP母液，超聲10min，待用。

使用玻璃移液管移取一定體積的DBP母液，配制成濃度為21.6μg/L、43.2μg/L、86.4μg/L、216μg/L、432μg/L、648μg/L、1080μg/L、1296μg/L、1728 μg/L、2160μg/L的標準溶液，進行HPLC-MS/MS分析。

（3）樣品制備。使用玻璃滴管稱取約1.00g樣品于10mL玻璃離心管，加入2mL乙腈，渦旋1min，超聲提取20min，在離心機中以4000r/min的轉速離心4min，收集上清液于10mL容量瓶中。底液中加入2mL乙腈，重復提取4次，乙腈定容至刻度線，待HPLC-MS/MS分析。

（4）工藝材料處理。對DHA甘油酯生產工藝過程中所用到的材料，用金龍魚魚油作模擬介質，進行處理后得到分析樣品，以考察增塑劑DBP的帶入可能性。

①金龍魚魚油空白處理。量取6mL金龍魚油于10mL具塞玻璃離心管中，將離心管置于80℃水浴中，水浴4h。

②包裝用鋁瓶、生產過程中用到的膠管、濾布、墊圈、白土、溶液和酯化酶的預處理。

分別稱取一定的量，用一定量的金龍魚油浸，置于80℃水浴中，水浴4h。

③液液萃取。稱取1.00g上述處理后的魚油于10mL玻璃離心管中，加入2mL乙腈，渦旋1min，超聲提取20min，4000r/min離心4min，收集上清液。殘液中再加入2mL乙腈重復提取4次，合并上清液。將萃取溶液置于真空干燥箱，60℃濃縮至干，加入乙腈定容至2mL，待HPLC-MS/MS分析。

（5）液相色譜串聯質譜條件。液相色譜條件：Shimadzu UFLC-MS8045，配二極管陣列檢測器（DAD）；色譜柱：Shimadzu Shim-pack GIST C18（150mm×2.1mm，5μm）；流動相：水（A）：乙腈（B），梯度洗脫程序；柱溫：40℃；流速：0.3mL/min；檢測波長：224nm；進樣量：10μL。

質譜條件：三重四級桿質譜儀，配電噴霧電離源（ESI），正離子多反應監測掃描（MRM）；霧化氣流量：3L/min；加熱器流量：10L/min；接口溫度：300℃；DL溫度：250℃；加熱塊溫度：400℃；干燥器流量：10L/min；檢測時間：0～15min；保留時間、離子對、碰撞能量見表1。

表1 質譜保留時間、離子對、碰撞能量數據表

2.結果與討論

(1)樣品制備方法優化

①萃取溶劑的選擇

食品中DBP的提取溶劑通常是乙腈、甲醇、正己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醚、丙酮等。考慮到流動相體系，并不進行凈化、濃縮等步驟，本實驗考察甲醇和乙腈作為溶劑對DHA甘油酯中DBP的提取率，結果如表2所示。乙腈的提取率遠高于甲醇，本實驗選擇乙腈作為提取溶劑。

表2 甲醇和乙腈對DHA甘油酯中DBP的提取效率

②乙腈溶劑的干擾

有機溶劑中通常會存在一定量的DBP。本實驗室考察了乙腈空白中DBP含量的影響，乙腈和濃度為4.24μg/L的DBP標準溶液的MRM質譜圖如圖1所示，峰面積分別為82973和257582。因此，乙腈溶劑中DBP會對樣品中DBP的定量造成一定的干擾，本實驗為了降低空白DBP的干擾，僅做最低限度的樣品處理，并控制所有樣品和標準品進樣體積為10μL，穩定空白值。

圖1 乙腈空白和DBP標準溶液的MRM色譜圖

圖2 塑料移液管的干擾

③萃取次數的選擇

液液萃取是利用物質在兩種互不相溶或微溶的溶劑中溶解度或分配系數不同，是物質從一種溶劑轉移至另外一種溶劑中。經過多次萃取，將大部分物質提取出來。本實驗考察了乙腈不同萃取次數對低DBP含量（A3）和高DBP含量（A4）的DHA甘油酯的影響，結果如圖3所示。經過3次萃取，DHA甘油酯樣品中大部分DBP被萃取出來，低含量的樣品中DBP被完全萃取。考慮到有高含量的樣品存在，為提高數據可靠性，本實驗選擇乙腈液液萃取5次。

圖3 乙腈萃取次數對DBP萃取率的影響

（2）標準曲線、線性范圍和檢出限。本方法采用外標法定量，依據檢測樣品響應值，配制一系列DBP標準樣品，按照優化后色譜-質譜條件進行MRM檢測，以DBP標準品濃度（x，μg/L）對DBP響應峰面積（y）繪制標準曲線如圖4。取DBP標準樣品逐級稀釋，按照3倍信噪比（S/N）和10倍信噪比，測定方法的DBP定性限和定量限。方法的線性方程、相關系數、線性范圍、定性限和定量限見表3。

圖4 DBP的標準曲線

表3 方法的線性方程、相關系數、線性范圍、定性限和定量限

（3）加標回收率和方法精密度。量取一定體積的DBP母液稀釋成5.0880mg/L的DBP標準溶液，作為加標回收實驗的標準溶液。精確稱取3份1.0000g已知DBP濃度的DHA甘油酯樣品于10mL玻璃離心管中，向3份樣品中分別加入5.0880mg/L的DBP標準溶液0.05mL、0.10mL、0.15mL，根據樣品制備步驟和HPLCMS/MS方法測定DBP含量，每個添加水平重復6次進樣檢測，計算加標回收率和相對標準偏差（RSD）。

（4）樣品中DBP的測定。根據實驗優化樣品制備方法和工藝材料處理方法和色譜-質譜條件，對2個工藝中間樣品、2個酯化物樣品、7個DHA甘油酯樣品進行DBP檢測。在排查和處理引起DBP遷移的材料，最終DHA甘油酯產品的DBP含量降至0.11mg/kg以下，低于我國食品中DBP允許最大殘留量為0.3mg/kg的規定。

通過模擬實驗，對工藝材料進行DBP遷移率探究，找到了引起DHA甘油酯樣品中DBP含量升高的主要原因。

3.結論

（1）建立了DHA甘油酯中增塑劑鄰苯二甲酸二正丁酯（DBP）的RP-HPLC-MS/MS定性定量分析方法。使用乙腈液液萃取提取樣品中的DBP，經液相色譜分離，正離子模式下多反應監測掃描（MRM）檢測，外標法定量。液相色譜條件如下：ShimadzuUFLC-MS8045，配二極管陣列檢測器（DAD）；色譜柱：ShimadzuGISTC18（140mm×2.1mm，5μm）；流動相：水（A）：乙腈（B），梯度洗脫；柱溫：40℃；流速：0.3mL/min；檢測波長：224nm；進樣量：10μL。MRM質譜條件如下：三重四級桿質譜儀，配ESI電離源，正離子多反應檢測掃描（MRM）；霧化氣流量：3L/min；加熱器流量：10L/min；接口溫度：300℃；DL溫度：250℃；加熱塊溫度：400℃；干燥器流量：10L/min；檢測時間：0～15min。該方法建立的標準曲線，線性范圍為21.6～2160μg/L，線性相關系數為0.9994，定性限為0.18μg/L，定量限為0.59μg/L，標準加標回收率為86.31%～114.08%，RSD為1.70%～6.10%，滿足本實驗的DBP定量分析需求。

（2）使用本分析方法對10種樣品和29種工藝材料中DBP進行定量分析，發現了引起產品DBP升高的原因，經過改進工藝，使最終DHA甘油酯產品中DBP含量低于0.11mg/kg，符合我國食品安全規定食品中DBP允許最大殘留量0.3mg/kg，分析方法對指導工藝生產具有重要意義。