茯苓酸通過Nrf2/SLC7A11/GPX4信號通路調控鐵死亡改善阿爾茨海默病大鼠認知障礙的研究

樊赟，竇潤鵬，胡久略，侯紫君，周春祥*

1.210046 江蘇省南京市，南京中醫藥大學

2.473000 河南省南陽市中心醫院

3.473000 河南省南陽市，南陽理工學院張仲景國醫國藥學院 河南省張仲景方藥與免疫調節重點實驗室

1 材料與方法

1.1 實驗時間

2022年1—9月。

1.2 實驗動物

6～8周齡雄性SPF級SD大鼠75只，體質量（200±20）g，購自廣東維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可：SCXK（粵）2022-0063。

1.3 主要藥品和試劑

PA（購自四川恒誠致遠生物科技有限公司，貨號：N1629）；淀粉樣β蛋白片段25-35（Aβ25-35）（購自美國sigma公司，貨號：A4559）；尼氏（Nissl）染色液（貨號：C0117）、丙二醛（MDA）檢測試劑盒（貨號：S0131S）、谷胱甘肽（GSH）檢測試劑盒（貨號：S0053）購自碧云天生物科技有限公司；亞鐵離子（Fe2+）含量檢測試劑盒（貨號：BC5415）、普魯士藍染色試劑盒（核固紅法）（貨號：G1422）購自索萊寶生物科技有限公司；Alexa Fluor? 647熒光標記神經元核抗原（NeuN）抗體（貨號：ab190565）、GPX4（貨號：ab219592）、Alexa Fluor? 488標記的羊抗兔IgG（貨號：ab150081）、Nrf2（貨號：ab31163）、SLC7A11（貨號：ab175186）抗體購自Abcam公司。

1.4 主要儀器

Morris水迷宮（型號WMT-100S，成都泰盟軟件有限公司）；熒光顯微鏡（型號BX53，日本Olympus公司）；電泳儀（型號DYY-6C，北京六一生物科技有限公司）；凝膠成像儀（型號Gel Doc EZ，美國BIO-RAD公司）。

1.5 實驗方法

1.5.1 采用隨機數字表法將大鼠分為對照組（Control組）、AD模型組（Model組）、PA治療組（PA組），PA+Nrf2抑制劑組（PA+ML385組），每組15只大鼠。

1.5.2 造模與給藥：參考文獻［8］的方法制備AD大鼠模型，除Control組外，其余組大鼠雙側海馬緩慢注射5 μL Aβ25-35（濃度2 g/L），Control組雙側海馬注射等量0.9%氯化鈉溶液，給藥7 d后進行Morris水迷宮實驗，其中平均逃避潛伏期較Control組大鼠明顯延長，平臺停留時間及穿越平臺次數較正常大鼠明顯減少者視為建模成功［9］。造模成功后，PA組腹腔注射50 mg/kg PA［10］，PA+ML385組腹腔注射50 mg/kg PA+30 mg/kg Nrf2抑制劑組ML385［5］，Control組與Model組腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液，PA給藥1次/d，ML385給藥2次/周，連續給藥8周。

1.5.3 末次給藥24 h后進行Morris水迷宮實驗，水迷宮保持水溫25 ℃左右，第1天為適應性訓練，第2、4、6天進行定位航行實驗，記錄大鼠到達平臺的時間（逃避潛伏期），第7天移走平臺，記錄大鼠在120 s內滯留平臺時間和穿越平臺次數。

1.5.4 各組隨機選取5只大鼠，斷頭處死后取出海馬組織，10%甲醛固定，脫水包埋，切成4 μm的切片，Nissl染色后顯微鏡下觀察神經元病理變化。

經過機構改革后，有工作實體的直屬機構由改革前的24個精簡為17個，直屬工作部門人員減少了19.5%,直屬事業單位人員編制減少9.9%，與改革前相比，人員共減少15.2%。

1.5.5 普魯士藍染色檢測海馬組織鐵沉積：石蠟切片脫蠟至水后加入普魯士藍染液浸染，蒸餾水沖洗，加入核固紅染液復染細胞核，常規脫水透明，中性膠封片，顯微鏡下觀察藍色斑點即為鐵沉積。

1.5.6 免疫熒光染色檢測海馬神經元GPX4表達：另取5只大鼠處死后取海馬組織冰凍切片，封閉后加入Alexa Fluor? 647熒光標記NeuN抗體及GPX4抗體，4 ℃孵育過夜，再加入Alexa Fluor? 488標記的羊抗兔IgG，37 ℃避光孵育1 h，加入含4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的熒光封片劑封片，熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.5.7 將每組剩余5只大鼠處死后，取出海馬組織，按照1∶9加入0.9%氯化鈉溶液勻漿后，12 000 r/min離心10 min（離心半徑10 cm），取上清，蛋白定量后取一部分上清檢測GSH、MDA、Fe2+含量，另一部上清用于蛋白質印跡法（Western blotting）。5，5二硫硝基苯甲酸（DTNB）法檢測GSH含量，硫代巴比妥酸（TBA）法檢測MDA含量，微量法檢測Fe2+含量。

1.5.8 Western blotting檢測大鼠海馬組織Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表達：取1.5.7上清液，提取30 μg蛋白，經電泳分離轉膜、封閉后，加入兔抗鼠Nrf2、SLC7A11、GPX4抗體稀釋液（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，再加HRP-IgG二抗稀釋液（1∶1 500），孵育1 h后ECL顯色，以β-actin為內參，Image Lab軟件分析蛋白表達。

1.6 統計學方法

采用SPSS 23.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4組大鼠Morris水迷宮實驗結果

4組大鼠逃避潛伏期、平臺停留時間、穿越平臺次數比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。組間比較結果顯示，末次給藥第2、4、6天Model組逃避潛伏期高于Control組、PA組，PA+ML385組高于PA組，差異有統計學意義（P＜0.05）；Model組平臺停留時間、穿越平臺次數低于Control組、PA組，PA+ML385組低于PA組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 4組大鼠Morris水迷宮實驗結果（±s）Table 1 Results of Morris water maze experiment in the 4 groups of rats

注：Control組=對照組，Model組=AD模型組，PA組=茯苓酸（PA）治療組，PA+ML385組=PA+核因子E2相關因子2抑制劑組；a表示與Control組比較P＜0.05，b表示與Model組比較P＜0.05，c表示與PA組比較P＜0.05。

分組只數逃避潛伏期（s）平臺停留時間（s）穿越平臺次數（次）第2天第4天第6天Control組1542.42±6.2525.38±4.6713.32±2.4548.34±4.2315.20±3.42 Model組1576.31±7.13a57.55±6.26a45.63±7.41a23.65±4.14a8.40±2.35a PA組1557.39±6.23b36.47±5.83b27.39±4.69b34.42±3.82b12.33±3.54b PA+ML385組1568.42±7.57c48.35±5.81c34.52±5.88c28.34±4.23c9.27±2.23c F值69.63191.48893.560102.07116.589 P值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.2 4組大鼠神經元Nissl染色結果

Control組神經元形態結構正常，尼氏體豐富；Model組神經元壞死嚴重，細胞核皺縮，尼氏體數目減少；PA組神經元壞死減少，排列緊密且尼氏體增多；PA+ML385組神經元損傷明顯加重，尼氏體數目減少，見圖1。

圖1 4組大鼠神經元Nissl染色結果（×400）Figure 1 Results of Nissl staining of neurons in the 4 groups of rats

2.3 4組大鼠海馬組織普魯士藍染色結果

Control組未觀察到藍色鐵沉積，Model組鐵沉積較Control組增加，與Model組比較，PA組鐵沉積減少，PA+ML385組較PA組鐵沉積增多，見圖2。

圖2 4組大鼠海馬組織普魯士藍染色結果（×400）Figure 2 Results of Prussian blue staining in hippocampus of the 4 groups of rats

2.4 4組大鼠免疫熒光染色結果

NeuN為神經元標記物（紅色），GPX4標記細胞顯示為綠色，Control組綠色熒光增強，表明GPX4強陽性表達，Model組綠色熒光減弱，GPX4陽性細胞減少，PA組細胞綠色熒光較Model組增強，GPX4陽性細胞增多，PA+ML385組較PA組GPX4陽性細胞減少，見圖3。

2.5 4組大鼠海馬組織GSH、MDA、Fe2+含量比較

4組大鼠GSH、MDA、Fe2+含量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。組間比較結果顯示，Model組GSH低于Control組、PA組，PA+ML385組低于PA組，差異有統計學意義（P＜0.05）；Model組MDA、Fe2+高于Control組、PA組，PA+ML385組高于PA組，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 4組大鼠海馬組織GSH、MDA、Fe2+含量比較（±s）Table 2 Comparison of GSH，MDA and Fe2+ contents in hippocampus of the 4 groups of rats

表2 4組大鼠海馬組織GSH、MDA、Fe2+含量比較（±s）Table 2 Comparison of GSH，MDA and Fe2+ contents in hippocampus of the 4 groups of rats

注：GSH=谷胱甘肽，MDA=丙二醛，Fe2+=亞鐵離子；a表示與Control組比較P＜0.05，b表示與Model組比較P＜0.05，c表示與PA組比較P＜0.05。

Fe2+（μg/g）Control組519.85±3.4313.75±2.6926.21±3.76 Model組55.76±0.97a38.24±5.73a53.41±5.64a PA組514.34±2.78b20.25±3.61b25.26±4.23b PA+ML385組59.42±1.65c27.34±4.52c38.55±3.81c F值32.30829.90644.304 P值＜0.001＜0.001＜0.001組別只數GSH（μmol/g）MDA（μmol/g）

2.6 4組大鼠海馬組織Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表達比較

4組大鼠海馬組織Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表達比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。組間比較結果顯示，Model組Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白相對表達量低于Control組、PA組，PA+ML385組低于PA組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3、圖4。

表3 4組大鼠海馬組織Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白相對表達量（±s）Table 3 Relative expression of Nrf2，SLC7A11 and GPX4 proteins in hippocampus of rats in the 4 groups of rats

表3 4組大鼠海馬組織Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白相對表達量（±s）Table 3 Relative expression of Nrf2，SLC7A11 and GPX4 proteins in hippocampus of rats in the 4 groups of rats

注：Nrf2=核因子E2相關因子2，SLC7A11=溶質載體家族7A11，GPX4=谷胱甘肽過氧化物酶4；a表示與Control組比較P＜0.05，b表示與Model組比較P＜0.05，c表示與PA組比較P＜0.05。

組別只數Nrf2SLC7A11GPX4 Control組51.21±0.141.05±0.121.13±0.11 Model組50.43±0.05a0.23±0.05a0.19±0.03a PA組50.97±0.10b0.85±0.08b0.57±0.06b PA+ML385組50.72±0.08c0.43±0.05c0.35±0.04c F值58.195109.664185.348 P值＜0.001＜0.001＜0.001

圖4 4組大鼠海馬組織Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白Western blotting分析圖Figure 4 Western blotting analysis of Nrf2，SLC7A11 and GPX4 proteins in hippocampus of the 4 groups of rats

3 討論

AD主要以認知功能障礙為主要臨床表現，我國65歲以上AD患者高達900余萬，隨著老齡化的加重，其發病率呈升高趨勢［11］。目前AD的治療尚無特效藥物，只能改善臨床癥狀，尋找安全有效的治療藥物具有重要意義［12］。PA具有抗炎、抗氧化、鎮靜催眠、降糖等多種藥理學作用［13-14］。PANG等［10］的研究顯示，PA通過激活磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路，改善大鼠腦缺血再灌注損傷和神經元凋亡，表明PA具有神經保護功能。本研究結果顯示，使用PA治療后AD大鼠逃避潛伏期時間縮短，平臺停留時間及穿越平臺次數增加，表明PA可有效改善AD大鼠的認知功能障礙，Nissl染色結果顯示，PA還可減輕海馬神經元病理損傷。

鐵參與中樞神經系統重要生物學過程，在體內鐵超載可引起鐵死亡，鐵死亡是一種調節性細胞死亡方式，在神經疾病中神經元的死亡中均可發現鐵死亡，鐵蛋白抑制劑可保護神經元和恢復認知功能［15］。在AD中，Aβ積累可以誘導內質網應激反應，引起細胞抗氧化劑GSH水平降低，內質網內活性氧增加，GSH是合成GPX4的底物，GPX4是一種細胞內抗氧化酶，其水平降低導致過氧化脂類的積累，促進鐵死亡發生［16］。研究顯示，抑制鐵死亡，可改善缺血再灌注大鼠的認知障礙和神經功能缺損［17］。JIANG等［18］研究顯示，PA通過激活Nrf2抑制腎臟鐵死亡，上調GPX4、SLC7A11和HO-1的表達，保護小鼠缺血再灌注誘導的急性腎損傷。本研究結果顯示，使用PA治療AD大鼠后，大鼠海馬組織鐵沉積減少，海馬組織GSH水平及GPX4表達顯著升高，MDA與Fe2+水平顯著降低，提示PA可能通過抑制鐵死亡，改善AD大鼠認知障礙與神經損傷。

Nrf2是一種應激誘導轉錄因子，正常情況下，Nrf2與Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1（Keap1）蛋白相結合形成復合物，當發生氧化應激時，Nrf2分離進入胞核中啟動基因轉錄，在抗氧化中起關鍵作用，在腦損傷中，激活Nrf2途徑可保護神經細胞抵抗鐵死亡［19］。Nrf2作為轉錄因子可增加SLC7A11和GPX4表達，SLC7A11是一種鐵死亡調節劑，是GPX4上游調節因子，激活Nrf2/SLC7A11/GPX4信號通路可抑制鐵死亡，保護氧葡萄糖剝奪/再灌注誘導的神經元損傷［20］。研究顯示，柚皮素通過激活Nrf2-GPX4通路，抑制鐵死亡，減輕腦出血大鼠腦水腫與血-腦脊液屏障通透性，保護神經損傷［21］。本研究顯示，PA可上調AD大鼠海馬組織Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表達水平，提示PA可能通過激活Nrf2/SLC7A11/GPX4信號通路，改善AD大鼠認知障礙。本研究還顯示，使用Nrf2抑制劑ML385可逆轉PA對AD大鼠認知障礙的改善及鐵積累的抑制，證明PA通過激活Nrf2/SLC7A11/GPX4信號通路抑制鐵死亡，改善AD大鼠認知障礙。

綜上所述，PA通過激活Nrf2/SLC7A11/GPX4信號通路抑制鐵死亡，改善AD大鼠認知障礙。PA在AD中的作用機制仍需更深入的研究。

作者貢獻：樊赟提出主要研究目標，負責研究的構思與設計，研究的實施，撰寫論文；竇潤鵬、胡久略進行數據收集與整理，統計學處理，圖、表的繪制與展示；樊赟、侯紫君進行論文的修訂；周春祥負責最終版本修訂，對論文負責。

本文無利益沖突。