AMPK調控鐵死亡相關信號通路的研究現狀

王 鋒,秦文秀,王 琪,鄧震亭

(天津中醫藥大學第一附屬醫院,國家中醫針灸臨床醫學研究中心,天津 300381)

單磷酸腺苷活化的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,在真核細胞中普遍表達。它是一種重要的能量傳感器,可以感知細胞的能量狀態,在調節全身細胞能量的穩態中具有重要作用。AMPK在葡萄糖剝奪、缺氧或局部缺血等能量應激條件下因細胞內AMP/ADP比值的升高而被磷酸化和激活,促進ATP合成并抑制ATP的分解代謝來維持細胞和全身能量代謝平衡。能量平衡失調被認為是一個影響人類疾病的重要驅動因素。因此,AMPK在維持能量穩態中的核心作用使其成為預防和治療代謝性疾病的一個關鍵靶點[1]。鐵死亡是一種新定義的鐵依賴性細胞死亡,其標志是鐵代謝失衡,特點是鐵依賴性活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產生和脂質過氧化。鐵死亡與多種疾病的病理生理過程有關,如癌癥、腦卒中、缺血/再灌注損傷、腎變性等。近年來諸多研究表明,AMPK的激活在各種炎癥、缺血/再灌注和氧化應激性疾病的改善中起著至關重要的作用,基礎AMPK活性高的細胞對鐵死亡具有可抗性,而AMPK失活可使這些細胞對鐵死亡變得敏感,激活AMPK相關信號通路是調控鐵死亡的重要途徑[2]。本文主要綜述AMPK調控鐵死亡的相關信號通路,以期為相關藥物和疾病治療靶點的尋找提供參考。

1 AMPK結構及表達位置

AMPK是由1個催化亞基(α)和2個調節亞基(β和γ)組成的異三聚體復合物。在哺乳動物中,有2種不同的α、β亞型和3種不同的γ亞型,α、β和γ亞基的主要功能分別是催化、調節和連接。α亞基由激酶結構域、自身抑制劑結構域(AID)和α-亞基羧基末端結構域(α-CTD)組成,包含催化結構域和激活環中的Thr172,其被上游激酶磷酸化以激活。β亞基由β-CTD和CBM組成,通過β-CTD充當α和γ亞基之間的橋梁,這有助于AMPK靶向尋找位點。γ亞基N端結構域長度不同,含有4個串聯的胱硫醚β合成酶(CBS)重復序列,形成2個Bateman結構域[3]。Bateman結構域是AMP/ATP結合和變構調控的位點,具體見Fig 1。大腦主要包含α1、α2、β1、γ1和γ2亞基,心臟和肝臟主要含有α1、α2、γ1和γ2亞基,肺和腎主要含有α1、γ1和γ2亞基,骨骼肌主要含有α2、β2、γ1、γ2和γ3亞基[4]。由于AMPK各亞基表達表達在不同的細胞類型中,因此由其介導的相關信號通路和相關疾病的激活位點各有不同。

Fig 1 The AMPK subunit structure

Tab 1 The signaling pathways of AMPK regulating ferroptosis

2 AMPK與鐵死亡關系

能量應激擾亂細胞穩態并誘導細胞死亡,鐵死亡是一個需要能量的過程,而能量應激介導的AMPK激活可以調控鐵死亡。AMPK與鐵死亡有關的一個關鍵靶點是乙酰輔酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase1,ACC1),其抑制導致游離脂肪酸減少,這些脂肪酸在整合到細胞膜之前特別容易被過氧化[5]。此外,由于ACC1抑制促進脂肪酸氧化,這導致可氧化脂肪酸水平的進一步降低。脂肪酸合成和分解的這種組合效應提高了谷胱甘肽(glutathione,GSH)水平,這對于防止鐵死亡很重要。除了前面描述的AMPK的作用外,AMPK激活還導致蛋白質合成的減少,蛋白質合成抑制劑已經被證明可以降低細胞內GSH的水平從而抑制鐵死亡[6]。因此,AMPK介導的蛋白質合成減少也可能抑制鐵死亡而發揮保護作用。AMPK激活還能促進線粒體增殖,而線粒體功能障礙是鐵死亡及年齡相關的神經退行性疾病的關鍵特征[3],這是AMPK激活可能有助于預防鐵死亡的另一種方式。AMPK激活劑(AICAR,A769662)可以保護細胞免受鐵死亡的影響,而AMPK敲除則會大大降低A769662的保護作用[1]。有研究證實,AMPK的藥理激活劑5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(AICAR)可顯著阻斷鐵死亡和相關的脂質過氧化,與此相反,AMPKα1和α2亞基的雙敲除則顯著提高了鐵死亡和脂質過氧化物積累的敏感性[7]。可見AMPK與鐵死亡之間的關系錯綜復雜。筆者將在下文著重討論AMPK調控鐵死亡的相關信號通路,見Tab 1。

3 AMPK調控鐵死亡的相關信號通路

3.1 AMPK-NRF2相關信號通路核因子NF-E2相關因子(nuclear factor erythroid2-related factor 2,NRF2)被認為是抗氧化反應的主要調節因子,當細胞受到ROS刺激時,NRF2改變其分子構象,從細胞質轉位到細胞核,繼而促進下游血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)、溶質載體家族7成員11(recombinant solute carrier family 7,SLC7A11)和谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase,GPX4)轉錄,這些蛋白在抗氧化和抑制鐵死亡中發揮重要作用[8]。

AMPK-PGC1α-NRF2信號通路:過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1,PGC-1α)的磷酸化是AMPK信號通路激活的關鍵指標,也是連接AMPK和NRF2信號通路的橋梁[9]。NRF2在減輕神經退行性疾病的脂質過氧化和鐵死亡中發揮了重要作用,并受AMPK-PGC1α信號通路調控。作為細胞內能量狀態的調節劑,AMPK和PGC1α在腦損傷后均異常活躍。Gao等[10]發現,在缺血性腦卒中后AMPK-PGC1α通路激活能保護線粒體的生物合成和功能,而該通路的抑制會加重腦缺血/再灌注損傷,這與激活AMPK-PGC1α-NRF2信號通路抑制鐵死亡相關。

AMPK-GSK3β-NRF2信號通路:糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK3β)是AMPK的下游分子,AMPK可以通過誘導GSK3β的磷酸化促進NRF2的核轉錄,而AMPK-GSK3β-NRF2信號轉導是鐵死亡的重要調節途徑[2]。鐵死亡被認為是心肌缺血/再灌注(MIR)損傷的重要原因,Wang等[11]研究證實,增加AMPK和GSK3β的磷酸化,促進NRF2的核轉錄,增強HO-1、SLC7A11和GPX4的表達能顯著抑制心肌細胞鐵死亡,從而減輕MIR損傷。Lu等[12]通過制備MIR損傷動物模型也得出同樣結論。

3.2 AMPK-mTOR相關信號通路哺乳動物雷帕霉素靶(mammalian target of rapamycin,mTOR)是雷帕霉素激酶的機制靶點,調節細胞生長和自噬。已知AMPK-mTOR信號通路與鐵死亡密切相關,作為能量分子的傳感器,AMPK正向抑制鐵死亡和滅活mTOR以響應能量代謝[13]。

SIRT3-AMPK-mTOR信號通路:去乙酰化酶(sirtuin 3,SIRT3)對AMPK的磷酸化有正向調節作用,與維持細胞氧化還原穩態有關。Han等[14]通過研究觀察到在鐵死亡誘導物作用下,滋養細胞SIRT3蛋白表達顯著升高。SIRT3缺失會抑制AMPK-mTOR通路的激活,增強GPX4的表達,從而抑制鐵死亡。這提示SIRT3上調能通過促進AMPK-mTOR途徑并降低GPX4水平誘導細胞鐵死亡。

AMPK-mTOR-ULK1信號通路:ULK1是酵母蛋白Atg1的同源物,有研究表明它參與鐵死亡的誘導。Bao等[15]發現雙酚a(bisphenol A,BPA)激活AMPK-mTOR-ULK1信號通路誘導了鐵死亡,表現為細胞內鐵沉積增加,脂質過氧化和細胞死亡,而且利用典型的鐵死亡抑制劑ferrostatin-1和去鐵胺可以從根本上減少細胞死亡。為證明這一結果的真實性,他們敲除AMPK,mTOR和ULK1,發現顯著減輕了BPA誘導的鐵死亡。這些結果表明,AMPK-mTOR-ULK1信號通路參與了鐵死亡的調節。同時,Guo等[13]也通過研究驗證了大蒜素可以在體內通過激活AMPK,抑制mTOR來誘導鐵死亡。

ROS-AMPK-mTOR信號通路:據報道,花杉黃酮(AF)具有抗腫瘤能力。Sun等[16]研究AF在子宮內膜癌(KLE)中的作用及其機制。結果發現經AF處理后KLE細胞ROS和AMPK表達增加,而mTOR表達降低且呈濃度依賴性。提出AF通過激活ROS-AMPK-mTOR途徑促進鐵死亡,抑制了KLE細胞增殖。

AMPK-MTOR-SLC7A11信號通路:苯并吡喃衍生物2-亞氨基-6-甲氧基-2H-鉻烯-3-碳硫代酰胺(IMCA)能通過AMPK-mTOR途徑下調SLC7A11的表達而誘導鐵死亡。Zhang等[17]證實了IMCA能誘導細胞AMPK磷酸化,抑制mTOR去磷酸化,并同時下調SLC7A11的表達,降低半胱氨酸和GSH含量,最終導致ROS積累和鐵死亡。因此,IMCA誘導的鐵死亡與AMPK-mTOR通路有關。

3.3 AMPK-JAK2/STAT3-P53-GPX4信號通路近年來,Janus激酶(JAK)信號轉導和轉錄激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)途徑被發現并作為與細胞因子密切相關的細胞內信號轉導途徑。JAK2/STAT3是JAK/STAT的一個重要亞型,參與細胞增殖、分化、凋亡和免疫調節等多種生物學過程,與許多癌癥的增殖、遷移、轉移和惡病質有關[18]。在Li等[19]的研究中,他們發現能量應激通過激活AMPK顯著增強了GPX4依賴性鐵死亡。并發現通過上調p53(已知的一種人體抑癌基因)的表達以及在轉錄水平上抑制GPX4的表達,能促進AMPK介導的GPX4依賴性鐵死亡。而JAK2/STAT3信號通路失活能上調p53的表達,從而參與鐵死亡這一過程。總之,能量應激介導的AMPK激活后通過JAK2/STAT3-P53信號通路促進了鐵死亡發生。

3.4 ROS-AMPK-SCD1信號通路在以往的研究中,TP53誘導的糖酵解和凋亡調節因子(TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator,TIGAR)顯示出較強的抗氧化作用,并能顯著降低細胞內ROS水平[20]。Liu等[21]進一步研究提出,TIGAR是對抗鐵死亡的潛在關鍵驅動因素,他們發現TIGAR通過滅活AMPK介導的硬脂酰輔酶A去飽和酶1(stearyl coenzyme A dehydrogenase-1,SCD1)上調來控制氧化還原信號,從而誘導細胞鐵死亡。因此,他們提出TIGAR可能通過抑制ROS的產生影響鐵死亡。這些結果提示TIGAR能通過ROS-AMPK-SCD1信號通路來抑制細胞鐵死亡。

3.5 LKB1-AMPK-ACC1信號通路Li等[7]的研究表明,AMPK能調節鐵死亡的敏感性,通過抑制脂肪酸合成限速酶ACC1在能量不足的情況下負向調節脂肪酸合成。除此,他們觀察到鐵死亡在小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)中誘導了ACC1的強烈磷酸化,而在AMPK 敲除模型中則不能誘導ACC1磷酸化,這提示在鐵死亡過程中AMPK抑制了ACC1的磷酸化。本研究同時證實了在鐵死亡的誘導下,AMPK被上游肝激酶B1(liver kinase B1,LKB1)激活,通過抑制ACC1和脂質生物合成所需的其他可能底物的磷酸化來抑制細胞脂質合成,從而保護細胞免受鐵死亡。總之,LKB1-AMPK能通過抑制ACC1磷酸化負調控鐵死亡。

3.6 AMPK-SREBP1/SCD1信號通路Zhao等[22]觀察到,富含乳酸的腫瘤細胞對常見的鐵死亡誘導劑所致的損傷具有強抵抗力,單羧酸轉運體1(monocarboxylate transporter 1,MCT1)介導的乳酸攝取可促進癌細胞ATP的產生,并使AMPK失活,導致固醇調節元件結合蛋白1(sterol regulatory element binding protein-1,SREBP-1)和下游SCD1上調,從而促進抗鐵死亡單不飽和脂肪酸的產生。該團隊還證實腫瘤細胞中乳酸抑制受體HCAR1/MCT1的缺失會導致p-AMPK上調和下游SREBP1、SCD1下調,從而促進鐵死亡發生。這說明SREBP1/SCD1參與了AMPK調控鐵死亡的途徑。

3.7 PP2A-AMPK-EEF2相關信號通路Zhong等[23]發現,芬戈莫特(FTY720)能通過PP2A-AMPK途徑誘導鐵死亡。眾所周知,GPX4和SLC7A11的失活和耗竭抑制了半胱氨酸代謝,導致脂質過氧化升高和鐵死亡[24],即GPX4和SLC7A11的表達減少代表了鐵死亡發生。他們發現蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)抑制劑LB-100和AMPK激活劑AICAR能逆轉FTY720下調的GPX4和SLC7A11表達,因此他們認為PP2A抑制劑或AMPK激活劑抑制PP2A-AMPK通路能抑制FTY720誘導的鐵死亡。真核延伸因子2激酶(eukaryotic elongation factor 2 kinases,EEF2K)是Ca2+/CaM依賴性蛋白激酶,通過磷酸化其唯一已知底物EEF2來調節蛋白質合成[25]。本研究也發現FTY720可通過激活PP2A,從而去磷酸化AMPK,進一步降低EEF2的磷酸化,誘導細胞鐵死亡。

3.8 AMPK-BECN1-SLC7A11-Xc-信號通路System Xc-是細胞膜上的一種胱氨酸/谷氨酸逆向轉運蛋白,在調控細胞鐵死亡過程中發揮關鍵作用,也是BECN1(一種特異性的自噬基因)自噬的關鍵分子。Song等[26]發現,BECN1通過與其核心組分SLC7A11結合,直接阻斷System Xc-的活性,從而促進鐵死亡。AMPK介導的BECN1在Ser90/93/96位點的磷酸化是BECN1-SLC7A11復合物形成和脂質過氧化所必需的。因此,BECN1磷酸化缺陷能逆轉BECN1誘導的脂質過氧化和鐵死亡。總之,他們定義了一個由AMPK-BECN1-SLC7A11介導的調節信號通路,這一通路通過直接阻斷System Xc-活性來調控鐵死亡。

4 AMPK調控鐵死亡相關信號通路在疾病中的應用

AMPK處于能量應激的十字路口,不僅參與了鐵死亡的調控,也參與了多種疾病的發生發展過程。Huang等[27]表明,葛根素通過激活AMPK-PGC1α-NRF2信號通路能減輕蛛網膜下腔出血大鼠模型的鐵死亡,從而改善大鼠神經行為損傷。Bao等[15]證實,抑制AMPK-mTOR-ULK1軸激活能明顯抑制鐵死亡,保護腎小管上皮細胞,改善腎功能。Wang等[11]發現,右美托咪啶通過AMPK/GSK-3β信號途徑激活NRF2能顯著降低心肌細胞Fe2+積累和脂質過氧化,改善心功能。Zhou等[28]表明,葛根素能調節AMPK表達,抑制大鼠鐵死亡,對膿毒癥所致的心肌損傷有保護作用。Lu等[12]經研究證實,激活AMPK-GSK3B-NRF2信號通路并上調GPX4對心肌缺血/再灌注損傷具有保護作用。Wang等[29]提出,蘿卜硫素能通過激活AMPK-NRF2途徑抑制鐵死亡,從而預防或延緩糖尿病心肌病發生。Guo等[13]表明,大蒜素可通過激活AMPK-mTOR介導的鐵死亡,誘導食管鱗狀癌細胞死亡,控制疾病進程。Zhang等[17]發現,苯并吡喃衍生物2-亞氨基-6-甲氧基-2H-鉻烯-3-碳硫代酰胺(IMCA)能通過AMPK-mTOR途徑誘導癌細胞鐵死亡,最終抑制結直腸癌細胞的生存能力。Han[14]團隊表明激活AMPK-mTOR途徑能誘導鐵死亡,預防妊娠期糖尿病。Sun等[16]證實,花杉黃酮通過激活ROS-AMPK-mTOR通路能抑制子宮內膜癌細胞的活力和增殖,促進癌細胞凋亡和鐵死亡,從而延緩疾病進展。Zhong等[23]發現,FTY720能通過激活蛋白磷酸酶2A(PP2A)-AMPK途徑誘導鐵死亡,延長多發性骨髓瘤患者生命。上述研究均表明,AMPK和鐵死亡參與了腦血管疾病、心血管疾病、呼吸系統疾病、消化系統疾病、泌尿系統疾病、血液病、腫瘤等多種疾病的發生過程,而通過藥物或物理手段干預AMPK調控鐵死亡的相關通路防治疾病是未來研究的一大趨勢和熱點。

5 小結

自20世紀80年代研究以來,致力于AMPK研究的熱情就不斷高漲。各種研究結果先后證實了AMPK能抑制氧化應激、細胞凋亡、線粒體功能障礙、谷氨酸興奮性毒性和神經炎癥,促進自噬和組織修復,維持代謝穩態[30]等。自鐵死亡這一概念問世后,AMPK與鐵死亡的調控機制便成為諸多學者的研究焦點。本文整理AMPK調控鐵死亡的相關信號通路主要有:AMPK-PGC1α-NRF2;AMPK-GSK3β-NRF2;SIRT3-AMPK-mTOR;AMPK-mTOR-ULK1;ROS-AMPK-mTOR;AMPK-MTOR-SLC7A1;AMPK-JAK2/STAT3-P53-GPX4;ROS-AMPK-SCD1;LKB1-AMPK-ACC1;AMPK-SREBP1-SCD1;PP2A-AMPK-EEF2;AMPK-BECN1-SLC7A11。其中被激活后能夠抑制鐵死亡進程的是AMPK-PGC1α-NRF2、AMPK-GSK3β-NRF2、ROS-AMPK-SCD1和LKB1-AMPK-ACC1信號通路。而SIRT3-AMPK-mTOR、AMPK-mTOR-ULK1、ROS-AMPK-mTOR、AMPK-MTOR-SLC7A1、AMPK-JAK2/STAT3-P53-GPX4、AMPK-SREBP1-SCD1、PP2A-AMPK-EEF2和AMPK-BECN1-SLC7A11信號通路一旦被激活,若不加以阻斷則會誘導鐵死亡,引起或阻止相關疾病發生。所以了解這些通路的具體途徑,明確調控相關通路最終達到的效果,對藥物的研發及治療手段的實施具有重要指導意義。

對于AMPK相關通路激活最終抑制還是誘導鐵死亡學界眾說紛紜,未深入研究的學者甚至上升到AMPK直接對鐵死亡的作用,忽略了通路轉接過程,所以讀者經常可以看到AMPK能抑制鐵死亡,或AMPK能誘導鐵死亡等說法,殊不知這就是斷章取義的結果。機體是一個完整的系統,任何指令的下達和實現都依賴于一整套完整的神經電生理和分子通路傳導,而AMPK作為能量應激分子通路的交叉點,其上下游連接的結構不同,最終所起的作用自然存在差異。所以今后若想探討AMPK在鐵死亡及相關疾病中作用,需溯本求源,追蹤具體通路,應用嚴謹的實驗方案方可得出令人信服的結論,才能正確指導臨床,助力藥物研究。除此之外,鐵死亡究竟對哪些疾病有益,又對哪些疾病有害;針對具體疾病需抑制鐵死亡還是誘導鐵死亡;AMPK的每一條通路在如何調控鐵死亡,具體疾病又與AMPK的那一條通路相關,該阻斷還是促進這條通路發揮作用,以及AMPK調控鐵死亡相關信號通路的靶向藥物研發都將成為未來研究熱點。本文對AMPK調控鐵死亡相關信號通路的梳理有一定局限,一方面,人體結構十分復雜,相關蛋白及信號通路豐富繁雜,鐵死亡作為一種新型的細胞死亡方式,學者們對AMPK調控鐵死亡的相關信號通路研究還有待完善;另一方面,不排除筆者在查閱文獻過程中遺漏相關內容,未在本篇中進行介紹。后期筆者將繼續深入挖掘相關文獻,進一步明確和完善AMPK調控鐵死亡的信號通路,深入探討鐵死亡的發生以及在具體疾病中的機制與應用,為相關藥物研發和疾病治療提供思路。