EGCG對帕金森病神經保護作用機制研究進展

丁新玲,孫會艷,李 強,王洪權

(赤峰學院1.基礎醫學院、2.醫學部,內蒙古 赤峰 024000;3.內蒙古人類遺傳病研究重點實驗室,內蒙古 赤峰 024000;4.赤峰學院附屬醫院神經內科,內蒙古 赤峰 024005;5.天津醫科大學腫瘤醫院、天津醫科大學腫瘤研究所、國家癌癥臨床醫學研究中心、天津市腫瘤防治重點實驗室、天津市惡性腫瘤臨床醫學研究中心,天津 300060)

帕金森病(Parkinson′s disease,PD)是一種常見的神經退行性疾病,其主要病理特征是中腦黑質致密部(compact part of substantia nigra,SNpc)多巴胺能(DA)神經元的選擇性死亡和缺失,黑質-紋狀體多巴胺能系統功能退化,最終導致患者運動和非運動功能障礙。氧化應激、神經炎癥、凋亡、興奮性毒性、線粒體功能障礙、蛋白質清除機制缺陷、神經營養因子耗竭等機制參與了PD中多巴胺能神經元的丟失,參與PD的發病機制。傳統中藥(traditional Chinese medicine,TCM)因為多靶點、多途徑和多層次藥效作用,引起致力于防治以PD為主的神經退行性疾病的學者關注[1]。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin 3-gallate,EGCG)是一種來源于綠茶提取物的豐富多酚成分,近年研究顯示在帕金森病(PD)的實驗模型中是有效的,使其成為PD治療的潛在藥物。本文對EGCG在PD中的神經保護作用及其機制進行了綜述,重點總結歸納了EGCG通過抗凋亡、抗氧化、抗炎、調節多巴胺生成和α-突觸核蛋白聚集等機制在PD中的神經保護作用的最新進展。

Fig 1 Chemical structure of EGCG

1 EGCG的化學特性和生物利用度

EGCG(分子式為C22H18O11),是綠茶茶多酚的主要組成成分,是從茶葉中分離得到的兒茶素類單體,一杯250 mL的1.25%(W/V)綠茶中含有約177 mg EGCG。 EGCG由四個標記為A、B、C和D的環組成(分子式見Fig 1)。A和C為苯并吡喃環,它在C2處有一個苯基,在C3處有一個沒食子酸基團。B環具有位置3,4,5-三羥基,D環沒食子酸部分在C3處配置為酯。EGCG及其代謝產物主要經肝臟代謝,進入膽汁或腸細胞,進入腸腔以糞便形式排出,少量通過尿液排出體外。茶葉的生物利用度取決于其本身的分子尺寸和極性。表兒茶素(epicatechin,EC)(分子量290)的生物利用度顯著高于EGCG (分子量458 u)。當人類口服相當于兩杯無咖啡因茶后,EGCG的血漿峰值水平通常在0.2 μmol·L-1左右。通過口服具有顯著藥理劑量的EGCG后,在小鼠和人類中分別檢測到2～9 μmol·L-1和7.5 μmol·L-1的峰值血漿濃度。人喝兩杯綠茶后,EGCG的血漿濃度最高為0.15 μmol·L-1。同時,EGCG在血漿中以大量游離形式存在。EGCG的消除半衰期為3.4±0.3小時。正常人志愿者口服1.6 g劑量的EGCG,血漿EGCG濃度達到生理濃度。口服EGCG通過腸道吸收,口服消化1～ 2 h后血漿中檢測到EGCG;禁食大鼠和人血漿中EGCG的峰值濃度分別為0.156 kg·L-1和1.047 kg·L-1。EGCG的另一個重要特性是其具有較高的BBB通透性,這可能是因為其疏水性即分子的極性越低,腦組織的吸收越好[2]。

2 在PD中的神經保護作用機制

近年來,EGCG在治療神經系統疾病中的作用引起藥理學家們的關注。首次證實EGCG在PD中具有神經保護作用以來,EGCG在PD中的應用研究越來越多[12]。EGCG可以在PD的多種體內外模型中具有神經保護作用,而且可通過多種機制發揮神經保護作用,我們歸納如下。

2.1 抗凋亡作用帕金森病神經元死亡的主要機制之一是細胞凋亡。帕金森病患者和實驗模型中大量證據支持內在凋亡在多巴胺能神經元退變中的作用,而抑制凋亡成為治療PD的重要靶點之一。200 μmol·L-1EGCG能在PC12細胞中通過抗凋亡作用抑制6-羥基多巴胺( 6-hydroxydopamine,6-OHDA)誘導的細胞損傷,這是首次證實EGCG在PD中具有神經保護作用的研究[3]。后續的系列深入研究也證實了EGCG的抗凋亡作用[4-5]。 6-OHDA處理的人神經母細胞瘤SH-SY5Y中,EGCG(0.1～10 μmol·L-1)預處理SH-SY5Y細胞可顯著減輕6-OHDA誘導的細胞死亡。1 μmol·L-1EGCG可完全阻止6-OHDA誘導的STAT3活性下降,并且可刺激有道神經細胞的增殖。這表明,EGCG對神經元的保護作用可能是通過重新刺激STAT3信號通路實現的[6]。在過表達A53T-α-syn的SH-SY5Y細胞中,EGCG能抑制6-OHDA誘導的細胞凋亡[7]。

EGCG預處理N27細胞,能夠抑制6-OHDA導致的二價金屬轉運體-1(divalent metal transporter-1,DMT1)表達增加、鐵轉運蛋白1(ferroportin 1,Fpn1)水平的降低,進而降低細胞內鐵含量,這也同時表明EGCG具有調控鐵代謝的功能,提示EGCG可能具有調控鐵死亡的作用[8]。鐵死亡是一種由細胞膜中含有磷脂的多不飽和脂肪酸的過氧化損傷驅動的、鐵依賴性的調節性細胞死亡[9]。于此同時EGCG可抑制6-OHDA誘導的caspase-3活性增加,在原代中腦神經元中,EGCG能夠抑制6-OHDA誘導的TH+細胞計數減少和增加軸突長度[8]。在6-OHDA誘導的SK-N-AS細胞中,EGCG抑制 6-OHDA引起的α-synuclein蛋白表達增加,免疫組化結果顯示EGCG可減弱模型細胞中6-OHDA引起的caspase-3免疫反應性[10]。經瘦素(leptin,Lep)修飾的包裹白藜蘆醇(resveratrol,Res)和EGCG組成的脂質體(Lep/RES-EGCG-PA)具有通過血腦屏障的功能,Lep/RES-EGCG-PA能夠抑制MPP+誘導的SH-SY5Y細胞中凋亡促進蛋白Bax蛋白的表達,增加Bcl-2抑制細胞凋亡的發生[11]。EGCG也能抑制由百草枯(paraquat)誘導的PC12細胞凋亡,其機制可能與維持線粒體膜電位、抑制caspase-3活性和下調胞質中促凋亡蛋白Smac的表達有關[12]。同時EGCG也能夠在動物模型中通過抗凋亡機制在PD中發揮神經保護作用。在魚藤酮誘導的大鼠PD模型中,EGCG可顯著減弱魚藤酮誘導的紋狀體caspase-3激活[13]。綜上所述,EGCG能夠在PD體內外模型中通過抑制神經毒素誘導的凋亡而發揮神經保護作用。但是其抑制凋亡的分子機制仍有待于深入研究。

2.2 抗氧化損傷作用氧化應激損傷是PD的重要特征之一,抑制氧化應激成為治療PD的重要靶點之一。在細胞水平上,100 μmol·L-1EGCG能夠抑制L-DOPA誘導的ROS生成,降低組織硫代巴比妥酸反應物(thiobarbituric acid reactive substances,TBARS)生成,同時上調細胞內GSH水平,這些結果表明,EGCG對左旋多巴誘導的PC12細胞氧化凋亡具有保護作用[14]。EGCG能夠增加PC12細胞中SIRT1和PGC-1α蛋白表達,10 μmol·L-1EGCG抑制MPP+誘導ROS生成增加,細胞活力增加,而EGCG上調PGC-1α mRNA、SOD1和GPX1 mRNA,這表明,SIRT1/PGC-1α通路是EGCG抑制MPP+誘導的PC12細胞氧化損傷的機制之一[15]。

同時在動物模型水平上EGCG也能夠通過抗氧化機制在PD中發揮神經保護作用。在MPTP誘導的PD小鼠模型中,MPTP治療使小鼠從旋轉體下降的潛伏期縮短16%,而紋狀體多巴胺濃度降低58%,二羥苯乙酸(dihydroxyphenylacetic acid )濃度降低35%,血清蛋白羰基(serum protein carbonyls)含量增加71%,EGCG抑制MPTP誘導的神經毒性。EGCG可上調小鼠的黑質Fpn1表達,但沒有發現對鐵調節蛋白(hepcidin)和DMT1的表達的影響,這表明EGCG調節黑質鐵輸出蛋白和降低氧化應激[16]。在魚藤酮誘導的SD大鼠PD模型中,EGCG腹腔注射(100或300 mg·kg-1)21 d可預防魚藤酮誘導的運動損傷,降低脂質過氧化產生,該研究是關于EGCG對魚藤酮誘導的運動損傷的神經保護作用的首次報道[13]。EGCG能夠改善6-OHDA誘導的Wistar大鼠行為變化,表現為旋轉行為減少、運動活動增強、抗抑郁作用增強和認知功能障礙改善,而EGCG可逆轉紋狀體氧化應激和免疫組織化學改變[17]。另外,在PD轉基因黑腹果蠅模型中也而觀察到了EGCG具有抗氧化作用[18-19]。綜上所述,EGCG能夠在PD體內外模型中抑制神經毒素誘導的氧化應激損傷。但目前抗氧化防御體系,如Nrf2/ARE通路在EGCG抑制PD相關神經毒素介的神經導損傷中作用不清楚,值得深入研究。

2.3 抗炎作用PD患者腦內受累區內小膠質細胞和星形膠質細胞的激活,小膠質細胞和星形膠質細胞激活產生的促炎性因子導致突觸丟失和功能障礙,而慢性炎癥也可以促進路易體形成進而參與PD發病機制,在PD患者腦內、腦脊液和血液中存在高濃度的促炎性因子(如IL-1β、IL-6和TNF-α)的水平升高,表明慢性神經炎癥在PD的進展過程中發揮重要作用,因此抑制慢性炎癥成為PD潛在的治療靶點。在6-OHDA誘導的SK-N-AS細胞中,EGCG能夠減弱6-OHDA誘導的IL-1β染色增強,表明EGCG具有抗炎作用[10]。在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導的BV-2小膠質細胞中,裝載EGCG的脂質體可被BV-2細胞吞噬,EGCG脂質體改善了LPS誘導的BV-2小膠質細胞一氧化氮(nitrogen oxide,NO)和TNF-α的產生,表明EGCG具有抑制LPS誘導的神經炎癥發生,同時黑質內注射EGCG脂質體可減輕LPS誘導的促炎細胞因子并恢復運動損傷,這表明EGCG脂質體通過調節小膠質細胞的激活發揮神經保護作用[20]。而EGCG抑制魚藤酮引起的黑質內炎性因子標志物NO、IL-1β和TNF-α的升高[13],同樣證實了在魚藤酮誘導的大鼠PD模型中EGCG具有抗炎作用。綜上所述,EGCG能夠在PD體內外模型中通過抑制神經炎癥從而發揮神經保護作用。

2.4 調控DA神經遞質系統帕金森病最主要的病理改變是中腦黑質多巴胺(dopamine,DA)能神經元的變性死亡,由此而引起紋狀體DA含量顯著性減少而致病。因此恢復紋狀體DA含量成為治療PD的重要靶點。在服用左旋多巴/卡比多巴后2 h,口服400 mg·kg-1EGCG略微增加了紋狀體多巴胺水平[16]。LPS腹腔注射誘導的雄性SD大鼠PD模型中,4、24 h、3和7 d中腦TNF-α、NO含量增加,DA水平降低,而EGCG(10 mg·kg-1)預處理7 d可降低TNF-α和NO,并提高了腦內DA水平[21]。在MPTP誘導的PD小鼠模型中,EGCG能提高紋狀體多巴胺及其代謝產物3,4-二羥基苯乙酸(3,4-dihydroxyphenylacetic acid)和高香草酸(homovanillic acid,HVA)的水平[22]。另一項在MPTP誘導的PD小鼠模型中同樣證實了EGCG具有提高紋狀體多巴胺濃度的能力[16]。綜上所述,EGCG具有升高腦內DA的性能,但其具體機制是否與抑制DA降解仍不清楚,有待進一步深入研究。

2.5 調控α-突觸核蛋白錯誤折疊的α突觸核蛋白(α-synuclein,α-syn)異常聚集,是PD病人腦內多巴胺能神經元內路易小體的主要成分,編碼α-syn的SNCA基因突變突變參與家族性早發PD的發病機制。EGCG已被證明是一種有效的抗淀粉樣蛋白制劑[23-24]。系列研究顯示EGCG可以抑制α-syn淀粉樣變性[25-26],并保護大鼠PC12和神經母細胞瘤細胞免受聚集誘導的細胞毒性[25]。EGCG使淀粉樣蛋白聚集途徑被重新定向為形成穩定的球形低聚物(spherical oligomers),這些低聚物被鑒定為無毒的無定形物種,在變性條件下不能促進播種和分解[27]。EGCG與α-syn蛋白質特異性結合,阻止無規線圈結構(random-coil structures)轉化為β-折疊。EGCG與天然結構蛋白質α-syn蛋白中的柔性區域相互作用,結合在整個蛋白質序列中均勻發,也有數據顯示EGCG可以通過氧化α-syn來減少其聚集過程[28]。

新發現表明,EGCG直接與原纖維的β片層結構(β-sheets of fibrils)結合,改變α-syn淀粉樣蛋白的構象,而不會將其分解為有毒的低聚物中間體[29]。EGCG重塑原纖維,減少α-syn淀粉樣蛋白的沉積,并將其轉化為無定形的非細胞毒性聚集體(amorphous non-cytotoxic aggregates)[29]。EGCG與β-環糊精協同作用增加了對α-syn淀粉樣變性的抑制作用和預形成纖維(pre-formed fibrils )的解聚[30]。因此,我們可以得出結論EGCG能夠在PD中阻止α-syn的聚集的作用,同時也能夠重塑α-syn原纖維改的作用,減少α-syn淀粉樣蛋白的沉積。

Fig 2 Schematic illustration of neuroprotective effects of EGCG in PD

3 結語

綜上所述,EGCG通過多種機制在PD中發揮神經保護作用。其可以在PD的細胞模型和動物模型中具有神經保護作用,其機制總結見Fig 2。EGCG具有抗凋亡、抗氧化、抗炎,同時它們通過促進腦內多巴胺升高,調節腦內病變區的神經遞質平衡,以及具有調控α-突觸核蛋白的功能。雖然EGCG在PD中的藥理作用多樣,但是是否存在其它機制來參與其對PD損傷的抑制作用尚不清楚。有數據顯示EGCG能夠通過下調二價金屬轉運體-1和上調鐵轉運蛋白1(Fpn1)水平,而調控鐵代謝,而鐵是參與一種由細胞膜中含有磷脂的多不飽和脂肪酸的過氧化損傷驅動的、鐵依賴性的調節性細胞死亡即鐵死亡機制,提示EGCG可能通過抑制鐵死亡發揮對PD的治療作用,但目前尚缺乏詳細實驗驗證,涵待進一步深入探索。