α-苦瓜素對巨噬細(xì)胞炎性細(xì)胞因子風(fēng)暴的選擇性抑制作用

李 成,成佳聰,譚蘇航,葉晨欣,劉 鰩,彭克軍,沈富兵,

(成都醫(yī)學(xué)院 1.藥學(xué)院、2.檢驗醫(yī)學(xué)院、3.臨床醫(yī)學(xué)院,四川 成都 610500)

α-苦瓜素(α-momorcharin,α-MMC)是從苦瓜種子中提取的Ⅰ型核糖體失活蛋白(ribosomal inactivating protein Ⅰ,RIP Ⅰ),不僅具有抗腫瘤、抗病毒活性,還具有免疫調(diào)節(jié)作用[1-2]。前期研究表明,α-MMC能選擇性抑制THP-1單核細(xì)胞中IL-1β、IL-2、IL-8、IL-9、IL-12、MIP-1α/β、MCP-1和TNF-α等細(xì)胞因子的表達(dá),而對WIL2-S B淋巴細(xì)胞和H9 T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá)沒有影響[3]。α-MMC對THP-1細(xì)胞的選擇性免疫調(diào)節(jié)作用源自于細(xì)胞表面分布的高密度LRP1受體(low-density lipoprotein receptor-related protein 1,LRP1)[4]。LRP1已被證明為α-MMC等Ⅰ型核糖體失活蛋白的特異性受體,其在單核細(xì)胞表面的分布密度為12 618±3 766/細(xì)胞,而在淋巴細(xì)胞的分布密度僅為41± 44/細(xì)胞[5]。

眾所周知,單核細(xì)胞為巨噬細(xì)胞的前身,在炎癥期間,單核細(xì)胞從血管遷移到炎癥部位并分化成為巨噬細(xì)胞,吞噬病原微生物并被激活,表達(dá)促炎癥細(xì)胞因子如IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-8,以激活其他免疫細(xì)胞并啟動炎癥反應(yīng)[6-7]。這種炎性巨噬細(xì)胞被稱為M1型巨噬細(xì)胞,若被病原體極化會過度表達(dá)炎癥細(xì)胞因子,形成細(xì)胞因子風(fēng)暴,并導(dǎo)致炎癥風(fēng)暴[8]。新冠病毒(SARS-CoV-2)、巨細(xì)胞病毒、流感病毒、H5N1流感病毒以及A組鏈球菌等都會激發(fā)巨噬細(xì)胞炎性因子風(fēng)暴,導(dǎo)致嚴(yán)重的臨床綜合征,亦被稱為巨噬細(xì)胞活化綜合征(macrophage activation syndrome,MAS)[9]。由于單核細(xì)胞在演化為巨噬細(xì)胞后,其細(xì)胞表面的LRP1受體密度是否發(fā)生變化尚不清楚,因此,α-MMC是否也能選擇性作用于巨噬細(xì)胞并抑制炎性極化巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子風(fēng)暴,非常值得探討。

本研究擬通過Western blot法分析單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的LRP1受體表達(dá)量,并以脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的炎性巨噬細(xì)胞為模型,探討α-MMC對巨噬細(xì)胞炎性細(xì)胞因子風(fēng)暴的抑制效應(yīng)和對TOLL樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)炎癥信號通路的抑制作用機(jī)制。同時,以受體阻斷劑受體相關(guān)蛋白(receptor-associated protein,RAP)阻斷LRP1受體的方式,證明α-MMC對M1巨噬細(xì)胞的選擇性抗炎作用。α-MMC對M1巨噬細(xì)胞炎性細(xì)胞因子風(fēng)暴選擇性抑制作用和機(jī)制的闡明,可以為其應(yīng)用于以炎性細(xì)胞因子風(fēng)暴為特征的MAS治療奠定基礎(chǔ),從而開發(fā)出一種新型抗病毒感染的免疫調(diào)節(jié)劑。

1 材料與方法

1.1 主要儀器CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱,中國Heal Force公司產(chǎn)品;EnVision型全功能微孔板檢測儀,英國PerkinElmer公司產(chǎn)品;化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀,美國Bio-Rad公司產(chǎn)品;Western blot電泳儀,美國Bio Rad公司產(chǎn)品。

1.2 藥品與主要試劑α-MMC藥品由四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院孟延發(fā)教授提供,RPMI 1640培養(yǎng)基(11875119)購自美國Gibco公司,TNF-α、IL-8、MCP-1、MIP-1α、IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒(KE1272、KE1360、KE1511、KE1052、KE1379、KE1368)購自美國Immuno Way公司,佛波酯PMA(79346)、LPS(L2880)、RAP(553506-M)均購自美國Sigma公司,RIPA細(xì)胞裂解液(P0013B)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,CCK-8試劑盒(CK04)購自中國上海Dojindo公司,魯米諾試劑和增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(enhanced chemiluminescence,ECL,11582950001)購自美國Millipore公司,鼠抗人β-actin抗體(60008-1-Ig)購自美國Proteintech公司,HRP標(biāo)記山羊抗兔抗體(SA00001-2)、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠抗體(SA00001-1)均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,TAK1抗體(YT4535)、p-TAK1抗體(YP0424)、JNK抗體(YT2440)、p-JNK抗體(YP0156)、AP1抗體(YT0248)、p-AP1抗體(YP0018)均購自Immuno Way公司,兔抗人LRP1抗體(ab92544)、TRAF6抗體(ab137452)、NF-κB p65抗體(ab32536)、p-p65抗體(ab76302)均購自美國Abcam公司。

1.3 細(xì)胞人單核細(xì)胞系THP-1和人正常T淋巴細(xì)胞系H9購自中國武漢Procell公司,人正常B淋巴細(xì)胞系WIL2-S購自中國上海百英生物科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng) THP-1、WIL2-S和H9細(xì)胞分別在含有10%熱滅活胎牛血清、100 kU·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中生長,于5% CO2、飽和濕度、37 ℃條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。M0巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)方法:將約1×106個THP-1細(xì)胞接種于6孔板中,加入PMA(30 μg·L-1),培養(yǎng)72 h后更換培養(yǎng)基,完全去除漂浮細(xì)胞,加入新鮮培養(yǎng)基(不含PMA),培養(yǎng)24 h,獲得M0巨噬細(xì)胞。

1.4.2LRP1受體Western blot分析 取對數(shù)生長期的WIL2-S、H9、THP-1細(xì)胞和M0巨噬細(xì)胞,以1×106個細(xì)胞/孔分別接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板的5孔中,置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后。每孔加入RIPA裂解液,在冰上裂解30 min并超聲3 min,然后在4 ℃ 12 000 r·min-1條件下離心10 min,轉(zhuǎn)移到新的EP管中。采用BCA法測定蛋白濃度,根據(jù)裂解物體積加入5倍SDS緩沖液,100 ℃煮沸5 min。將20 μg蛋白樣品分別用10%SDS聚丙烯酰胺凝膠和5%SDS濃縮凝膠分離,然后電泳轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,用5%牛奶/TBST封閉PVDF膜。在4 ℃封閉液中封閉2 h后,將膜與兔抗人LRP1和鼠抗人β-actin的一抗孵育過夜。再分別用HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗和山羊抗小鼠二抗在室溫下置于搖床上孵育1 h。之后采用增效魯米諾試劑和ECL作為顯色底物,使用化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀進(jìn)行顯色,用兔抗人β-actin抗體作為內(nèi)參對照。采用ImageJ軟件分析各條帶的灰度值,計算目標(biāo)蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值。

1.4.3CCK-8法細(xì)胞活性分析 取對數(shù)生長期THP-1、WIL2-S、H9細(xì)胞和M0巨噬細(xì)胞,以1.2×104個/孔的密度接種于96孔板。每種細(xì)胞用0、0.5、1、2、4、8、16、32和64 mg·L-1的α-MMC處理,每劑量組設(shè)置3個復(fù)孔。24 h后,每孔加入20 μL CCK-8溶液,37 ℃孵育4 h后每孔加入20 μL終止液。用EnVision酶標(biāo)儀在450 nm波長下測量每孔的吸光度(A)。細(xì)胞存活率=(A實驗組-A空白對照組)/(A正常對照組-A空白對照組)×100%。

1.4.4M1巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子檢測 在培養(yǎng)的M0巨噬細(xì)胞中加入LPS 20 μg·L-1,并在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h,誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向炎癥表型(M1巨噬細(xì)胞)極化。誘導(dǎo)完成后進(jìn)行如下實驗:(1)分別以0、0.1、0.5和2.5 mg·L-1的α-MMC處理細(xì)胞40 h;(2)分別以α-MMC(0.3 mg·L-1)處理細(xì)胞0、2、8、24和48 h。每組取5×106個細(xì)胞,每組3孔,并設(shè)M0巨噬細(xì)胞對照組。之后,各組細(xì)胞在RPMI培養(yǎng)基中洗滌2次,液氮速凍,37 ℃解凍。經(jīng)重復(fù)2次快速凍溶后,離心除去細(xì)胞碎片,保存上清液。使用TNF-α、IL-1β、MIP-1α、IL-6、IL-8和MCP-1定量ELISA試劑盒檢測各上清液樣品中相應(yīng)的細(xì)胞因子表達(dá)水平。

1.4.5TLR4信號通路Western blot分析 按1.4.4所述方法誘導(dǎo)M1巨噬細(xì)胞。將培養(yǎng)的M1型巨噬細(xì)胞分為4組:α-MMC(0.5 mg·L-1)0 h組、α-MMC(0.5 mg·L-1)4 h組、α-MMC(0.5 mg·L-1)8 h組、α-MMC(0.5 mg·L-1)8 h+RAP組,每組共設(shè)置5復(fù)孔。RAP阻斷劑組給藥方式為,在α-MMC給藥前1 h加入終濃度為320 nmol·L-1的RAP。各組細(xì)胞在相應(yīng)處理后,按1.4.2所述方法對細(xì)胞進(jìn)行處理并進(jìn)行Western blot檢測。各轉(zhuǎn)印膜加入一抗的稀釋倍數(shù)分別為:TRAF6(1 ∶1 000)、TAK1(1 ∶1 000)、p-TAK1(1 ∶600)、NF-κB p65(1 ∶2 000)、p-p65(1 ∶1 000)、JNK(1 ∶1 000)、p-JNK(1 ∶60)、AP1(1 ∶1 000)、p-AP1(1 ∶1 000)。

2 結(jié)果

2.1 α-MMC樣本檢定α-MMC的凝膠電泳分析結(jié)果和Western blot分析結(jié)果分別見Fig 1A、1B,通道1和通道2分別為1 μg和2 μg的α-MMC樣本。檢測結(jié)果顯示,α-MMC的分子量約為28 Ku,樣本條帶均一無雜帶。

2.2 LRP1受體蛋白含量的Western blot分析WIL2-S B淋巴細(xì)胞、H9 T淋巴細(xì)胞、THP-1單核細(xì)胞和M0巨噬細(xì)胞的LRP1受體蛋白的Western blot結(jié)果如Fig 2A。結(jié)果顯示,WIL2-S和H9細(xì)胞只有淺而模糊的條帶,而THP-1和M0巨噬細(xì)胞則顯示為深而濃密的條帶。灰度值相關(guān)性分析可知,THP-1細(xì)胞和M0巨噬細(xì)胞LRP1蛋白密度明顯高于WIL2-S和H9細(xì)胞(P<0.05),M0巨噬細(xì)胞的LRP1蛋白密度同THP-1細(xì)胞相比無明顯差異(P>0.05)。實驗結(jié)果表明,THP-1細(xì)胞經(jīng)PMA誘導(dǎo)為巨噬細(xì)胞后其LRP1受體蛋白密度沒有發(fā)生改變,依然明顯高于在B細(xì)胞和T細(xì)胞的表達(dá)量。

Fig 1 Results of gel electrophoresis(A)and Western blot(B) of α-MMC samples

2.3 α-MMC對單核-巨噬細(xì)胞的選擇性細(xì)胞毒作用α-MMC在0、0.5、1、2、4、8、16、32和64 mg·L-1的劑量下,對WIL2-S細(xì)胞、H9細(xì)胞、THP-1細(xì)胞和M0巨噬細(xì)胞的存活率結(jié)果如Fig 2B。結(jié)果顯示,α-MMC給藥劑量低于8 mg·L-1時,4種細(xì)胞的存活率皆在95%以上,而在給藥劑量高于16 mg·L-1后,α-MMC對THP-1和M0巨噬細(xì)胞顯示出了細(xì)胞毒性(存活率<90%),并且同WIL2-S細(xì)胞和H9細(xì)胞相比差異具有顯著性(P<0.05)。顯示出α-MMC對THP-1和M0巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性明顯高于WIL2-S和H9細(xì)胞,α-MMC對該4種細(xì)胞的細(xì)胞毒性差異與它們LRP1受體密度差異相一致。

2.4 α-MMC對M1巨噬細(xì)胞炎性細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)節(jié)作用α-MMC對LPS誘導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞的炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、MIP-1α和MCP-1)表達(dá)具有明顯抑制作用,實驗結(jié)果如Fig 3所示。(1)炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、MIP-1α、MCP-1在M0型巨噬細(xì)胞表達(dá)較低,而在LPS誘導(dǎo)后,這些細(xì)胞因子呈現(xiàn)爆炸式升高。如TNF-α在M0巨噬細(xì)胞中的表達(dá)量為(43.92±8.09) ng·L-1,極化為M1巨噬細(xì)胞后,其表達(dá)量分別急劇上升到(1 398.52±231.9) ng·L-1(劑量依賴實驗)和(1 507.16±339.9) ng·L-1(時間依賴實驗);IL-6在M0巨噬細(xì)胞中的表達(dá)量為(80.07±15.43) ng·L-1,極化成M1巨噬細(xì)胞后,其表達(dá)水平分別急劇上升到(689.5±65.85) ng·L-1和(671.5±70.1) ng·L-1,呈現(xiàn)出細(xì)胞因子風(fēng)暴特征。(2)當(dāng)α-MMC以0.1、0.5和2.5 mg·L-1的劑量給藥40 h后,這些炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)量皆呈劑量依賴性下降,其中TNF-α、IL-6和IL-1β的水平下降最為明顯。例如TNF-α,隨著α-MMC劑量的增加,其表達(dá)量分別為(1071.48±168.82)、(880.56±318.91)和(595.45±176.93) ng·L-1,呈明顯的逐漸下降趨勢,且與未處理模型組的表達(dá)量相比,除0.1 mg·L-1劑量組外,其余各組的表達(dá)量差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。(3)當(dāng)α-MMC以0.3 mg·L-1的劑量作用0、2、8、24及48 h后,這些炎癥因子的表達(dá)皆呈時間依賴性下降。例如TNF-α,隨著給藥時間的增加,其表達(dá)量分別為(1337.81±344.30)、(995.22±193.88)、(726.46±170.32)和(523.09±144.55) ng·L-1,與未處理模型組的表達(dá)量比較,除給藥時間2 h組外,其余各組的表達(dá)量差異均有顯著性(P<0.05)。各細(xì)胞因子表達(dá)量的變化趨勢詳見Fig 3A-F。

2.5 α-MMC對TLR4受體信號通路的抑制作用鑒于LPS誘導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞的作用機(jī)制是通過TLR4受體信號途徑激發(fā)炎性細(xì)胞因子表達(dá)完成的,

Fig 2 Western blot of LRP1 receptor protein density and CCK-8 analysis in four cell lines

Fig 3 The regulatory effect of α-MMC on expression of inflammatory cytokines in M1

Fig 4 Western blot bands and relative gray value of TLR4 pathway signaling proteins

本實驗選取該通路的TRAF6、TAK1/p-TAK1、NF-κB p65/p-p65、JNK/p-JNK、AP1/p-AP1信號蛋白觀察α-MMC對該信號通路的抑制效應(yīng)。各信號蛋白的免疫印跡條帶匯總于Fig 4A,各條帶的相對灰度值分析見Fig 4B-G。結(jié)果顯示,TRAF6信號蛋白在α-MMC給藥0、4和8 h時均呈濃密而均一的深色條帶,顯示出α-MMC對TRAF6蛋白沒有調(diào)節(jié)作用;而TAK1蛋白和p-TAK1在α-MMC處理后皆有條帶顏色減弱,在給藥8 h時條帶顏色減弱最為明顯,呈現(xiàn)淺而模糊的條帶,其重復(fù)檢測的灰度均值與0 h相比差異有顯著性(P<0.05),如Fig 4C,D,顯示出α-MMC對TAK1蛋白和TAK1磷酸化激活信號有明顯抑制作用。同時,我們觀察到JNK和AP1蛋白條帶在給藥0、4和8 h均沒有明顯的變化,而它們的磷酸化蛋白p-JNK、p-AP1條帶的密度則隨著α-MMC處理時間增加而明顯下降,顯示出α-MMC對JNK和AP1蛋白的磷酸化抑制。同樣,p65蛋白的致密均一條帶在給藥0、4和8 h時并未改變,而其磷酸化p-p65蛋白則逐漸變淺,顯示了α-MMC對p-p65磷酸化的明顯抑制。各蛋白的相對灰度值分別見Fig 4E-G。

同時,我們觀察到,使用RAP阻斷劑可成功阻滯α-MMC對相應(yīng)信號蛋白的抑制作用。α-MMC處理8 h組,被抑制的p-TAK1、p-JNK、p-AP1和p-p65蛋白條帶的蛋白淺而模糊,而使用RAP阻斷劑后,這些蛋白條帶的著色明顯加深,各蛋白的相對灰度值幾乎與α-MMC處理4 h時的相當(dāng),見Fig 4A、4C、4E-G。

3 討論

α-MMC能通過失活核糖體而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞凋亡[10],α-MMC的這種細(xì)胞毒性作用是受其特異性受體LRP1的分布密度限定的[3]。α-MMC尚具有較好的免疫調(diào)節(jié)作用[2],我們前期研究也發(fā)現(xiàn),在非細(xì)胞毒性劑量時,α-MMC能調(diào)節(jié)單核細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá),而對B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞沒有作用[11]。α-MMC對單核細(xì)胞選擇性免疫抑制作用同樣是由于LRP1受體高密度分布導(dǎo)致的,在LRP1受體被siRNA敲降后,α-MMC對THP-1細(xì)胞的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)即被阻滯[12]。本研究中,我們探討α-MMC對巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用,并觀察這種調(diào)節(jié)作用是否也具有受體依賴的選擇性。我們首先使用PMA誘導(dǎo)的M0巨噬細(xì)胞模型,觀察到M0巨噬細(xì)胞的LRP1受體密度與單核細(xì)胞THP-1并無差異,并明顯高于正常B細(xì)胞株WIL2-S和T細(xì)胞株H9。同時,我們也觀察到了與LRP1受體密度相一致的差異性細(xì)胞毒性,即α-MMC對THP-1和M0巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒作用遠(yuǎn)高于WIL2-S和H9細(xì)胞。

我們進(jìn)一步觀察到,α-MMC對LPS誘導(dǎo)M1巨噬細(xì)胞的炎性細(xì)胞因子風(fēng)暴具有明顯的抑制作用,并呈現(xiàn)出良好的劑量和時間依賴性。實驗觀察到M1型巨噬細(xì)胞的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、MIP-1α和MCP-1等炎性細(xì)胞因子有爆發(fā)式高表達(dá),在分別給予α-MMC 0.1、0.5、2.5 mg·L-1劑量作用40 h后,這些細(xì)胞因子呈現(xiàn)劑量依賴性降低,在α-MMC以0.3 mg·L-1劑量分別給予0、2、8、24和48 h后,這些炎性細(xì)胞因子的表達(dá)量呈時間依賴性降低。

鑒于LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎性極化并表達(dá)炎性細(xì)胞因子是通過激活TLR4受體信號通路發(fā)生的[13-14],我們通過檢測TLR4受體信號通路蛋白,觀察α-MMC對該信號通路的抑制作用,并觀察使用LRP1受體阻斷劑后的效應(yīng)。結(jié)果顯示,α-MMC能明顯抑制TLR4信號通路的TAK1和p-TAK1,其下游的NF-κB/p-p65和MAPK/p-JNK和p-AP1蛋白也相應(yīng)被抑制。使用特異性RAP受體阻斷劑后,α-MMC對TAK1/p-TAK1以及p-p65/p-JNK/p-AP1的抑制效應(yīng)被明顯阻滯。結(jié)果證明,α-MMC是通過LRP1受體介導(dǎo)抑制TAK1,進(jìn)而抑制了下游的NF-κB和MAPK通路,從而發(fā)揮對炎性細(xì)胞因子合成的抑制作用。

本實驗證實的α-MMC對巨噬細(xì)胞的選擇性調(diào)節(jié)作用,特別是對其炎性細(xì)胞因子風(fēng)暴的良好的抑制作用,將有可能使其成為治療MAS的臨床有效藥物。相比于靶細(xì)胞不專一的常用抗炎免疫抑制劑如糖皮質(zhì)激素,α-MMC的單核-巨噬細(xì)胞選擇性使其具有高效低毒優(yōu)勢。糖皮質(zhì)激素不僅能抑制巨噬細(xì)胞,也能抑制T細(xì)胞和B細(xì)胞,對中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞也有抑制作用[15-16],同時,糖皮質(zhì)激素對其他組織細(xì)胞也有不同的藥理作用,引起諸如胰島素抵抗、肥胖、青光眼、骨質(zhì)疏松、傷口愈合困難甚至庫欣綜合征等副作用[17-18]。

由于我們前期研究中已經(jīng)使用了siRNA敲降法阻斷LRP1受體,本研究我們采用特異性受體阻斷劑RAP來觀察阻滯效果。RAP是LRP1受體的分子伴侶,其對LRP1的結(jié)合非常牢固,是一種常用的LRP1受體阻斷方法。在后續(xù)研究中,我們會使用效果更好的基因敲除法,以進(jìn)一步探討LRP1受體在單核-巨噬細(xì)胞的功能。

總之,本研究證實了(1)α-MMC能選擇性作用于單核細(xì)胞THP-1和M0巨噬細(xì)胞,該選擇性依賴于LRP1受體的分布密度;(2)α-MMC呈劑量依賴性和時間依賴性抑制M1巨噬細(xì)胞炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、MIP-1α和MCP-1)表達(dá);(3)α-MMC是通過LRP1受體介導(dǎo)抑制TLR4信號通路,從而抑制了炎性細(xì)胞因子合成。α-MMC靶向抑制單核-巨噬細(xì)胞的藥理特性極有可能使其成為治療MAS的免疫調(diào)節(jié)劑。