miR-619-5p對乳腺癌細胞增殖、遷移與侵襲的影響

劉施妍,廖德宇,胡 凱,余伙梅,余 濤, 陳遠香,張 彥

(重慶醫科大學檢驗醫學院,臨床檢驗診斷學教育部重點實驗室, 重慶 400016)

盡管目前的診療手段已極大地改善了部分乳腺癌患者的預后,但其發病率和癌癥死亡病例數仍占據女性惡性腫瘤的第一位[1],乳腺癌的遠處轉移與復發仍舊給臨床治療帶來挑戰[2]。微小RNA(microRNA,miRNA或miR)屬于小分子非編碼RNA的范疇,其結構通常包括19～25個核苷酸。靶基因mRNA的3′-非翻譯區(3′-untranslated region,3′-UTR)可與之特異性地結合并受其調節,是miRNA發揮作用的經典途徑[3-4]。miRNA可以調節乳腺癌的生長轉移[5-6]和免疫逃逸[7]等生物學過程。miR-619-5p是近年來新發現的miRNA,在人類各種惡性腫瘤組織中均有異常表達[8-10]。例如,miR-619-5p在結直腸癌[11]、口腔鱗狀細胞癌[9]中低表達,而在非小細胞肺癌中高度表達[12]。本課題組早期研究顯示,miR-619-5p可能對乳腺癌有重要影響,然而,它的具體功能和機制仍不明確。本課題擬就miR-619-5p在乳腺癌細胞的上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)過程以及增殖與轉移等生物學行為中的作用進行初步研究,基于一系列生物信息學分析對其靶基因進行探索,以期為乳腺癌診斷及治療提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 材料永生化的正常乳腺上皮MCF-10A細胞、人類乳腺癌MDA-MB-231細胞系和MCF-7細胞保存于重慶醫科大學檢驗醫學院臨床檢驗診斷學教育部重點實驗室;miR-619-5p模擬物(mimic)和抑制劑(inhibitor)及其陰性對照均由上海生工生物工程公司設計合成;TranswellTM小室(Corning公司);DMEM高葡萄糖培養基(HyClone company);胎牛血清(Clark公司);上海陶術(Topscience)生化科技有限公司提供Cell Counting Kit-8(CCK-8)溶液;RNA快速提取試劑盒(奕杉生物科技有限公司);GP-transfect-Mate轉染試劑(GenePharma公司);逆轉錄試劑盒(TaKaRa公司);qRT-PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成;2×SYBR Green qPCR Master Mix購自Biomake公司;上海碧云天(Beyotime)生物技術公司提供RIPA裂解液及Western blot所用試劑;ECL顯影液(BioSharp公司);小鼠抗人類β-肌動蛋白(β-actin)抗體(南京鐘鼎生物有限公司);兔抗人上皮鈣黏蛋白(epithelial cadherin, E-cadherin)抗體、兔抗人神經鈣黏蛋白(neural cadherin, N-cadherin)抗體、兔抗人波形蛋白(Vimentin)抗體、兔抗人鋅指結構轉錄因子(Snail)抗體均來自proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1生物信息學分析 利用dbDEMC數據庫(https://www.biosino.org/dbDEMC/index)miRNA-seq數據,對miR-619-5p在乳腺癌組織與正常乳腺組織中的表達差異進行分析;miR-619-5p的靶基因通過檢索miRTarBase(https://mirtarbase.cuhk.edu.cn/)和miRDB(https://mirdb.org/)數據庫取交集預測得到;富集通路分析通過KOBAS(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/)數據庫進行;利用GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php)和HPA(https://www.proteinatlas.org/)數據庫分析CREB1在乳腺癌組織與正常乳腺組織中的表達差異;Kaplan-Meier Plotter工具(http://kmplot.com/analysis/index.phpp=background)用于評估CREB1對患者無復發生存率的影響。

1.2.2細胞培養與轉染 MDA-MB-231與MCF-7細胞(貼壁生長)采用DMEM高糖培養基(含10%胎牛血清和100 kU·L-1鏈霉素-青霉素),并將其置于37 ℃培養箱中恒溫培養,CO2濃度為5%。用直徑6 cm培養皿接種3×105個細胞,在60%～80%細胞匯合度時,按照GP-transfect-Mate轉染試劑說明,將inhibitor-NC、inhibitor、mimic-NC和mimic分別轉染細胞,4～6 h更換培養基,24～48 h后作后續處理。

1.2.3qRT-PCR對乳腺癌細胞和MCF-10A細胞中miR-619-5p水平和乳腺癌細胞的EMT相關分子的 mRNA水平檢測 轉染細胞24 h后提取細胞總RNA,用1 μg總RNA進行逆轉錄(逆轉錄程序:37 ℃,15 min;85 ℃,5 s;4 ℃,∞);通過qRT-PCR技術將上述逆轉錄得到的cDNA模板,進行擴增以檢測目的基因。采用U6或GAPDH為內參基因,分別檢測各組miR-619-5p的表達水平和N-cadherin、 E-cadherin、 Vimentin、 Snail mRNA水平。miR-619-5p的莖環引物5′-GTCGTATCCAGT GCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGGCT CA-3′用于逆轉錄。

Tab 1 Primer sequence of quantitative real-time PCR primer sequence

1.2.4Western blot實驗測定細胞中目的蛋白的表達 使用RIPA裂解液將轉染48 h后的細胞完全裂解以獲得的細胞總蛋白質,并立即通過分光光度法檢測蛋白的含量,然后每組蛋白樣本中添加1/4體積的上樣緩沖液(5×),100 ℃沸水煮沸加熱10 min以使其變性。將每孔上樣量為25～30 μg的蛋白樣本使用8%或10% SDS-PAGE凝膠進行電泳,采取濕轉法轉膜至PVDF膜,然后用5%脫脂奶粉進行封閉,37 ℃,2～3 h。PVDF膜與鼠抗人β-actin(內參照)單抗(1 ∶1 000)、兔抗人E-cadherin多抗(1 ∶5 000);兔抗人N-cadherin多抗(1 ∶2 000);兔抗人Vimentin多抗(1 ∶2 000);兔抗人Snail多抗(1 ∶1 000);兔抗人CREB1多抗(1 ∶1 000)等一抗,于4 ℃孵育12～16 h。用TBST清洗3 次PVDF膜,每次10 min;加入山羊抗小鼠或山羊抗兔IgG二抗(辣根過氧化物酶標記,1 ∶5 000稀釋),37 ℃下孵育1 h;再次清洗膜,用ECL顯影液完全覆蓋膜條,Image Lab自動凝膠成像系統曝光顯影并分析目的蛋白的灰度值。相對蛋白表達水平通過將每個目的蛋白的灰度值歸一化表示(以β-actin蛋白的灰度值為內參照)。

1.2.5CCK-8法檢測miR-619-5p在細胞增殖中的作用 96孔板中接種100 μL含轉染24 h后的細胞3×103個的細胞懸液,培養6～8 h后,在每組5 個復孔中加入10 μL CCK-8試劑,全程避光并混勻(計為0 h),置于培養箱2 h后,各孔的吸光度(OD值)由酶標儀測定,波長參數為450 nm,在培養24、48、72 h后重復添加CCK-8試劑并測量的步驟,最后繪制出生長曲線。

1.2.6劃痕愈合實驗評估miR-619-5p對細胞橫向遷移的作用 在6孔培養板中培養轉染后的乳腺癌細胞,每孔細胞數目3×105個。在細胞融合度在90%左右時,用10 μL小槍頭在培養板中間,勻速筆直劃線制造劃痕,隨即用PBS清洗1遍,加入雙無DMEM高糖培養基并拍照(記為0 h)。培養24 h和48 h后,選擇同一位置拍照,劃痕距離由ImageJ軟件檢測分析。平均劃痕愈合率=(0 h劃痕寬度-24 h(或48 h)劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.2.7TranswellTM實驗檢驗miR-619-5p對細胞遷移和侵襲所起作用 遷移實驗不需提前添加基質膠,侵襲實驗需提前稀釋基質膠(基質膠原液 ∶無胎牛血清培養基=1 ∶9)并取40 μL鋪在小室的上層,于37 ℃培養箱中將小室靜置1 h。轉染24 h后,細胞被消化并重懸于雙無DMEM高糖培養基中,鏡下計數并調整密度,隨后沿上室壁加入400 μL細胞密度為3×107個·L-1的細胞懸液,700 μL DMEM高糖培養基(含10%胎牛血清)添加至下室,在37 ℃下繼續培養,24 h后用PBS緩沖液將小室輕輕漂洗2次,在室溫下用多聚甲醛(4%)固定15 min,隨后再用結晶紫染液(0.1%)避光染色15 min,PBS漂洗過程中將上室未通過室膜的細胞用濕棉簽擦除,等待小室晾干后,每個組別隨機選擇3 個視野在尼康Ti-S倒置顯微鏡下觀察,用NIS-Elements成像軟件對其進行拍照并計數。

1.2.8統計學方法 獨立重復3次以上實驗,所有實驗結果采用GraphPad Prism 8.0軟件進行統計分析,使用t檢驗進行各組內兩兩比較,使用單因素方差分析比較兩組及以上組間數據。

2 結果

2.1 miR-619-5p在乳腺癌中低表達通過分析dbDEMC數據庫miRNA-seq數據顯示,乳腺癌組織中miR-619-5p的表達比正常乳腺組織更低。乳腺癌細胞MDA-MB-231與MCF-7中miR-619-5p的表達量較正常乳腺細胞MCF-10A更低也經qRT-PCR實驗驗證。見Fig 1。

2.2 miR-619-5p抑制乳腺癌細胞的增殖相較于對照組,乳腺癌細胞中miR-619-5p表達在轉染miR-619-5p mimic后明顯升高,轉染miR-619-5p inhibitor后,細胞中miR-619-5p的表達相應減少。CCK-8實驗結果提示,通過高表達miR-619-5p明顯削弱了乳腺癌細胞的增殖活性,而抑制miR-619-5p的表達后,細胞的增殖能力得到促進。見Fig 2。

Fig 1 Expression of miR-619-5p in breast cancer and

Fig 2 Proliferation of breast cancer cells inhibited by miR-619-5p n=3)

2.3 miR-619-5p對乳腺癌細胞的侵襲和遷移起抑制作用通過劃痕愈合實驗發現,miR-619-5p低表達的乳腺癌細胞在24、48 h的劃痕愈合率均高于對照組,而過表達miR-619-5p使乳腺癌細胞24、48 h劃痕愈合率明顯低于對照組。通過TranswellTM遷移與侵襲實驗發現,低表達miR-619-5p的實驗組通過小室膜的細胞數目明顯高于對照組,而miR-619-5p過表達的實驗組通過小室膜的細胞數目明顯減少。見Fig 3。

Fig 3 Migration and invasion of breast cancer cells inhibited by miR-619-5p n=3)

2.4 miR-619-5p抑制乳腺癌細胞的EMTqRT-PCR和Western blot結果顯示,在兩種細胞系中,過表達miR-619-5p使得促EMT分子Snail或間充質標志物N-cadherin和Vimentin的表達下降,但上皮標志物E-cadherin的表達上調;而在低表達miR-619-5p的乳腺癌細胞中則得到相反的結果。以上結果提示,miR-619-5p可抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231與MCF-7的EMT過程。見Fig 4。

2.5 miR-619-5p靶基因預測通過miRTarBase和miRDB數據庫對miR-619-5p的靶基因進行了聯合交集預測,共篩選到95個miR-619-5p潛在靶基因,對以上候選基因進行GO和KEGG的富集分析利用KOBAS數據庫實現。分析結果顯示,miR-619-5p的靶基因在cAMP信號通路(hsa04024)、代謝通路(hsa01100)、cGMP-PKG信號通路(hsa04022)、TGF-β信號通路(hsa04350)、Toll樣受體信號通路(hsa04620)、TNF信號通路(hsa04668)等途徑中起重要作用。環磷酸腺苷反應元件結合蛋白1(CREB1)得分較高,且與EMT相關的miR-619-5p靶基因之一,通過miRDB數據庫對其與miR-619-5p的結合位點進行了預測。在MDA-MB-231細胞中分別過表達或抑制miR-619-5p后,CREB1的mRNA與蛋白表達隨之下調或上調,而抑制miR-619-5p的表達則導致CREB1的蛋白水平上升。GEPIA數據庫mRNA-seq數據顯示,CREB1在乳腺癌組織中的表達高于正常組織;HPA數據庫的免疫組化結果進一步表明,CREB1在正常乳腺組織中主要高表達于腺細胞和肌上皮細胞,另外,脂肪細胞的表達量則處于中等水平;而在乳腺癌組織中,CREB1集中在乳腺癌細胞核高表達。此外,通過Kaplan-Meier Plotter分析顯示,CREB1高表達的患者具有更低的無復發生存率(RFS)。見Fig 5。

Fig 4 EMT of breast cancer cells inhibited by miR-619-5p n=3)

Fig 5 Prediction for target genes of miR-619-5p and pathway enrichment and impact of miR-619-5p on CREB1

3 討論

乳腺癌具有全球女性惡性腫瘤中位列第一的高發病率和死亡率[1]。盡管乳腺癌患者的5年生存率已提升了近15%[13],但對于乳腺癌晚期和特定亞型,如三陰性乳腺癌,其治療方案十分有限,易發生治療耐藥、轉移復發等。因此,探究乳腺癌發生發展的分子機制,尋找治療分子靶點仍至關重要。

miRNA的異常表達幾乎貫穿了乳腺癌的整個發生發展過程,對乳腺癌的增殖、轉移、代謝、免疫逃逸以及調控腫瘤微環境等多方面等產生影響。目前,miR-619-5p作為一種新發現的miRNA,在腫瘤中主要通過與LncRNA, circRNA構成競爭性RNA網絡(ceRNETs)發揮作用。例如,miR-619-5p在結腸腺癌組織中低表達,且在機制上LncRNA ILF3-AS1可與miR-619-5p結合并降低其表達,從而調節下游靶基因CAMK1D促進結腸腺癌的進展[14]。另有研究表明LncRNA PVT1可通過吸附miR-619-5p調節Pygo2和ATG14的表達水平,進而影響Wnt/β-catenin信號轉導途徑和自噬活性,促進胰腺癌對吉西他濱耐藥[10]。在血清外泌體和尿外泌體中的miR-619-5p也可作為新型腫瘤標志物[8-15]。本研究選用三陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-231和ER陽性的MCF-7細胞株進行實驗,通過分別轉染miR-619-5p的模擬物以及抑制劑來進行正反驗證。多項體外功能試驗顯示,乳腺癌細胞的增殖活性,遷移與侵襲能力,在一定程度上均被miR-619-5p抑制。這與在胰腺癌[10],口腔鱗狀細胞癌[9]等所報道的miR-619-5p發揮抑制癌細胞增殖與轉移的作用類似,而與在神經膠質瘤細胞中miR-619-5p發揮促癌作用則截然不同。

腫瘤細胞在EMT發生時逐漸由上皮樣(Ep樣)轉變為間質樣(M樣),這使其在轉移過程中適應能力更強,在到達遠處轉移前生態位重新激活時也更易存活[16],而miRNA也可能參與調控乳腺癌細胞的EMT[17]。本研究中,miR-619-5p過表達后,乳腺癌細胞中促EMT分子Snail或間充質標志物N-cadherin和Vimentin的表達下降,但上皮標志物E-cadherin的表達上調;在miR-619-5p低表達組的結果相反,上述結果均證明miR-619-5p能使乳腺癌細胞的EMT進程受阻,從而抑制乳腺癌細胞的遷移侵襲。

進一步利用生物信息學對miR-619-5p作用的下游分子機制進行初步探索,發現miR-619-5p的靶基因主要與cAMP信號通路(hsa04024)、代謝通路(hsa01100)、cGMP-PKG信號通路(hsa04022)、TGF-β信號通路(hsa04350)、TNF信號通路(hsa04668),Toll樣受體信號通路(hsa04620)等相關。在miR-619-5p的靶基因中,CREB1是一種轉錄因子,通過與DNA的cAMP反應元件(CRE)結合刺激轉錄,其異常表達與細胞周期、增殖、分化和腫瘤發生發展過程中的其他生物學過程密切相關。既往研究表明,CREB1在乳腺癌中高表達,CREB1沉默對乳腺癌細胞的增殖有一定的抑制作用[18]。在本研究中,通過生物信息學分析同樣表明CREB1在乳腺癌中低表達,且其表達與臨床患者的無復發生存率密切相關。CREB1可受miR-619-5p調控,因此推測,在乳腺癌中miR-619-5p可通過下調CREB1發揮作用。

綜上所述,本研究首次報道了miR-619-5p在乳腺癌中發揮的生物學作用,即miR-619-5p能抑制MDA-MB-231與MCF-7乳腺癌細胞的增殖活性、遷移、侵襲能力和EMT過程,其作用可能通過靶向調控CREB1實現。接下來我們將進一步驗證miR-619-5p是否直接靶向CREB1進而調控其他信號通路來抑制乳腺癌侵襲與轉移,為臨床診斷和治療乳腺癌提供新的參考。