金諾芬逆轉非小細胞肺癌奧希替尼獲得性耐藥的作用

李凌凌,劉文一,王 楠,趙齊林,吳蘭香

(重慶醫科大學 1.生命科學研究院,2.附屬第一醫院心胸外科,重慶 400016)

肺癌是全世界發病率與死亡率均較高的惡性腫瘤,其中80%～85%為非小細胞肺癌(non-small cell cancer, NSCLC)[1]。由于該疾病早期無典型癥狀,接近70%的NSCLC患者確診時已屬中晚期,不僅失去了手術機會,而且對常規化療及放療均不敏感,5年生存率僅約15%[2]。近年來,表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI)等分子靶向藥物的問世,使得NSCLC的臨床治療獲得了突破性進展。

奧希替尼(osimertinib, Osi)是首個獲美國FDA批準上市的第三代EGFR-TKI,可選擇性地與敏感突變型及T790M耐藥突變型EGFR發生不可逆結合,阻斷下游信號傳導而達到抗腫瘤的目的。鑒于其良好的臨床療效與安全性,該藥被推薦用于EGFR突變陽性NSCLC患者的一線治療[3]。然而,絕大多數在用藥初始階段具有良好反應性的患者,9～14個月后均會出現獲得性耐藥現象,導致治療失敗、疾病進展[4]。該現象產生的原因非常復雜,目前,已發現的分子機制主要包括兩大類:EGFR依賴性機制,如EGFR C797S突變等;EGFR非依賴性機制,如c-MET、HER2等代償性信號通路建立以及病理組織類型轉化等[5]。為了克服Osi耐藥、增強其療效,除了目前正在研發的針對EGFR C797S突變的第四代EGFR-TKI外,尋找耐藥逆轉劑、探索聯合治療方案已成為當前研究的熱點。目前已有研究表明,帕比司他、阿司匹林及姜黃素對NSCLC細胞EGFR-TKI藥物獲得性耐藥具有一定的逆轉作用[6-8],但是,特異性安全性更高、療效穩定有效性更好的藥物逆轉劑還有待被進一步探索發現。

本研究以Osi獲得性耐藥的NSCLC細胞為研究對象,通過高通量篩選FDA批準的藥物分子庫,發現金諾芬(auranofin, ANF)對NSCLC細胞Osi獲得性耐藥有顯著逆轉作用,為臨床克服該現象提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料RPMI 1640培養基和胎牛血清購于美國Gibco公司;FDA批準的1 470種藥物分子庫(L4200)和CCK-8試劑盒(C0005)購于美國TargetMol公司;基質膠(356234)和Transwell小室(353097)購于美國康寧公司;青霉素-鏈霉素(C0222)、結晶紫染液(C0121)、EdU試劑盒(C0071S)購于上海碧云天生物技術有限公司;4%多聚甲醛(DF0135)購于北京雷根生物技術有限公司;Osi(B1104)購于美國APExBIO生物科技有限公司;ANF(HY-B1123)購于上海皓元生物醫藥科技有限公司;逆轉錄試劑盒(RR073A)購于日本TaKaRa公司;PCR引物由上海生物工程有限公司合成;Anti-HSPB8 (DF2481)購于美國Affinity Biosciences,Anti-GAPDH(bs-2188R)購于北京博奧森生物技術有限公司,Anti-LC3B(3868T)購于美國Cell Signaling Technology公司,辣根酶標記山羊抗兔IgG(ZB-2301)購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 人非小細胞肺癌細胞株H1975(攜帶EGFR L858R和T790M突變)和PC9(攜帶EGFR第19外顯子缺失突變)購于中國醫學科學院基礎醫學研究所。H1975和PC9細胞培養于含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的RPMI 1640培養液中,于37 ℃、5% CO2培養箱中進行培養。取對數生長期的H1975和PC9細胞,用0～0.5 μmol·L-1遞增濃度的Osi處理,直至細胞可在含0.5 μmol·L-1Osi培養液中穩定生長,即為H1975/OR與PC9/OR細胞。實驗前2周撤去藥物,常規培養以備用。

1.2.2CCK-8法進行高通量藥物篩選并檢測細胞活力 取對數生長期的H1975/OR與PC9/OR細胞,接種于96孔板中(5×103個細胞/孔),24 h后加入10 μmol·L-1或1 μmol·L-1濃度的1 470種待測藥物,同時加入0.5 μmol·L-1Osi,于37 ℃、5% CO2條件下處理72 h后,加入10%的CCK-8溶液繼續孵育1 h,酶標儀檢測450 nm吸光度,細胞存活率=(實驗組吸光度-空白組吸光度)/(對照組吸光度-空白組吸光度)×100%;檢測細胞活力時,用不同濃度的Osi(0、1.25、2.5、5、10 μmol·L-1)或/和ANF(0.625、1.25、2.5、5 μmol·L-1)處理細胞72 h,加入CCK-8試劑后繼續孵育1 h,酶標儀檢測450 nm吸光度后,計算細胞半數抑制濃度(half maximal inhibitory concentration, IC50)。

1.2.3藥物協同指數測定 將H1975/OR與PC9/OR細胞培養至對數生長期,接種于96孔板(5×103個細胞/孔)中。培養24 h后,采用正交試驗設計方法,參考單藥的IC50值,Osi組設濃度0、2、4、6、8 μmol·L-1,ANF組設濃度0、0.8、1、2 μmol·L-1,繼續孵育72 h,檢測方法同“1.2.2”。計算每個濃度下對細胞活力的抑制率,采用Compusyn軟件分析兩藥聯合效應,并采用中位數效應原理確定藥物聯合指數(combination index, CI)。CI=D1/Dx1+D2/Dx2,其中,D1和D2分別表示Osi和ANF聯合應用產生同等效果所需要的劑量,Dx1和Dx2分別表示抑制一定水平細胞活力所需的Osi和ANF的劑量。CI<1代表兩藥在該濃度組合下具有協同作用,CI=1代表兩藥在該濃度組合下具有相加作用,CI>1代表兩藥在該濃度組合下具有拮抗作用。

1.2.4流式細胞術檢測細胞凋亡 取對數生長期細胞接種于6孔板(2×105個細胞/孔),24 h后單獨加入Osi、單獨加入ANF或者用Osi+ANF聯合處理,48 h后收集貼壁及上清中所有細胞,加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶(PI)染色液,于4 ℃避光孵育15 min,利用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.5EdU細胞增殖檢測 取對數生長期細胞接種于24孔板(4×104個細胞/孔),24 h后單獨加入Osi、單獨加入ANF或者用Osi+ANF聯合處理,48 h后加入EdU繼續孵育2 h。將細胞用4%多聚甲醛固定后,用Click反應液和Hoechst避光染色,于正置熒光顯微鏡下觀察并拍照,ImageJ軟件處理圖像并計數。EdU陽性細胞率=Edu染色陽性細胞數/Hoechst標記細胞數×100%。

1.2.6Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力 細胞遷移實驗中,取對數生長期細胞接種于6孔板(2×105個細胞/孔),24 h后單獨加入Osi、單獨加入ANF或者用Osi+ANF聯合處理,48 h后將細胞轉移至24孔板Transwell小室的上室中(2×104個細胞/孔)進行無血清培養,下室中加入含20% FBS的RPMI 1640培養基500 μL,培養24 h后加入4%多聚甲醛固定15 min,加入0.1%結晶紫室溫下染色15 min,于顯微鏡下拍照并用ImageJ軟件計數。在細胞侵襲實驗中,提前24 h于Transwell小室中鋪基質膠,其余步驟同細胞遷移實驗。

1.2.7RNA的提取以及實時熒光定量PCR檢測基因表達 取對數生長期的H1975/OR和PC9/OR細胞接種于6孔板,24 h后單獨加入2 μmol·L-1Osi、單獨加入1 μmol·L-1ANF或者用Osi+ANF聯合處理,48 h后用RNA提取試劑盒提取細胞總RNA,同時提取H1975和PC9兩種細胞的總RNA,用逆轉錄試劑盒合成cDNA,以cDNA為模版進行實時熒光定量PCR反應,反應條件為:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,共40個循環,計算2-ΔΔCt值計算目的基因的相對表達水平,每組設置3個復孔,所用引物見Tab 1。

Tab1 Sequence of primers(5′- 3′)

1.2.8Western blot檢測 取對數生長期的H1975/OR和PC9/OR細胞接種于6孔板中,24 h后單獨加入2 μmol·L-1Osi、單獨加入1 μmol·L-1ANF或者用Osi+ANF聯合處理,48 h后收集細胞提取蛋白,同時收集H1975和PC9兩種細胞的蛋白,用BCA試劑盒檢測不同組蛋白濃度,進行SDS-PAGE電泳,然后電轉至PVDF膜上,用5%脫脂奶粉封閉2 h后,4 ℃搖床過夜孵育一抗,用TBST洗滌3次后,加入二抗室溫孵育1 h,再用TBST洗滌3次后,使用ECL系統檢測蛋白表達量,實驗重復3次。

1.2.9RNA的抽提以及RNA-seq檢測 委托上海美吉生物醫藥科技有限公司進行測序,采用TRIzol(Invitrogen)法提取H1975和PC9敏感株以及H1975/OR和PC9/OR(分別用2 μmol·L-1Osi單獨處理和2 μmol·L-1Osi與1 μmol·L-1ANF聯合處理)細胞的總RNA,檢測RNA樣品的質量以保證使用合格的樣品進行轉錄組測序。RNA文庫的建立采用TruSeqTMRNA sample preparation Kit(Illumina,SanDiego,CA)試劑盒,文庫使用Illumina HiSeq xten/NovaSeq 6000測序平臺進行高通量測序,測序讀長為PE150。

2 結果

2.1 建立并驗證NSCLC細胞Osi獲得性耐藥模型本研究首先利用Osi敏感性H1975和PC9細胞,按照藥物濃度遞增法建立Osi獲得性耐藥細胞株H1975/OR與PC9/OR。CCK-8檢測結果顯示,Osi對H1975與H1975/OR的IC50值分別為0.074 μmol·L-1與5.204 μmol·L-1,耐藥指數為70.31;Osi對PC9與PC9/OR的IC50值分別為0.042 μmol·L-1與5.692 μmol·L-1,耐藥指數為136.99(P<0.01,Fig 1A)。流式細胞凋亡檢測結果(Fig 1B)所示,與敏感株相比,0.5 μmol·L-1Osi處理48 h后,H1975/OR細胞凋亡率較H1975細胞降低了72.6%(6.99%vs25.51%,P<0.05),而PC9/OR細胞的凋亡率較PC9細胞下降了84.6%(4.55%vs29.53%,P<0.01)。以上結果表明,Osi獲得性耐藥NSCLC細胞株構建成功。

2.2 NSCLC細胞Osi獲得性耐藥逆轉劑篩選為了尋找NSCLC細胞Osi獲得性耐藥的逆轉劑,本研究利用FDA批準的1 470種藥物分子庫,通過CCK-8方法篩選與0.5 μmol·L-1Osi聯用后可以明顯殺傷H1975/OR與PC9/OR細胞的藥物(Fig 2A)。首先將藥物濃度設置在10 μmol·L-1,將10 μmol·L-1待篩藥物與0.5 μmol·L-1Osi共同作用于H1975/OR細胞進行初篩,篩選出對細胞活力抑制率>50%的藥物,共有91種(Fig 2B),其中30%為激酶抑制劑,17%為RNA、DNA、蛋白合成抑制劑,還包括組蛋白去乙酰化酶抑制劑、離子通道類抑制劑、蛋白酶體抑制劑等(Fig 2C)。隨后,將這91種藥物的濃度降至1 μmol·L-1,與0.5 μmol·L-1Osi聯用后,同時在H1975/OR和PC9/OR細胞上進行復篩,發現14種藥物對H1975/OR細胞活力的抑制率>50%,11種藥物對PC9/OR細胞活力的抑制率>50%,其中有7種藥物對兩種耐藥細胞活力的抑制率同時>50%,分別是帕比司他、硼替佐米、卡非佐米、伏立諾他、ANF、羅米地辛、高三尖杉酯堿(Fig 2D)。接下來,本研究比較了這7種藥物在單獨給藥以及與0.5 μmol·L-1Osi聯用時對兩種耐藥細胞活力的影響,發現ANF在兩種情況下對細胞的殺傷作用差異最為明顯:單獨給藥時,ANF對H1975/OR與PC9/OR細胞活力的抑制率分別為46.07%與40.32%;當與0.5 μmol·L-1Osi聯用時,對H1975/OR與PC9/OR細胞活力的抑制率分別上升到了66.67%與70.76%(Fig 2E)。以上研究結果表明,不同于所篩選出的其他藥物,盡管ANF在單獨用藥時對Osi獲得性耐藥的NSCLC細胞有一定殺傷作用,但是與Osi聯合應用時效果更加明顯,提示ANF的作用靶點極有可能與NSCLC細胞在耐藥過程中發生改變的某些生物學特性密切相關。在此基礎上進一步驗證其對NSCLC細胞Osi獲得性耐藥的逆轉作用,并探索其耐藥逆轉機制,不僅有助于探索新的安全有效的耐藥逆轉方案,還可以從全新視角了解更全面的Osi獲得性耐藥產生原因,為臨床克服該現象提供新的解決思路。

Fig 1 Establishment and validation of osimertinib acquired resistant NSCLC cell lines

Fig 2 High-throughput screening drugs to reverse osimertinib acquired resistance

Fig 3 Different concentrations of auranofin and osimertinib combination effect on osimertinib resistant NSCLC cells

2.3 ANF與Osi聯合用藥效果評價為了進一步驗證ANF與Osi聯合用藥的效果,并確定兩藥聯用的最佳劑量,本研究首先利用CCK-8法檢測了ANF單獨處理Osi獲得性耐藥NSCLC細胞的IC50值,以便初步確定藥物濃度范圍。結果表明,ANF對H1975/OR細胞的IC50值為1.16 μmol·L-1,對PC9/OR細胞的IC50值為1.40 μmol·L-1(Fig 3A)。隨后,將不同濃度ANF(0、0.8、1、2 μmol·L-1)與不同濃度Osi(0、2、4、6、8 μmol·L-1)作用于細胞,觀察對細胞生長活力的抑制率(Fig 3B),并將抑制率數據輸入CompuSyn軟件中計算CI值[9]。結果發現,在所選的藥物濃度配比方案下,兩株細胞中所計算出的CI值<1,說明在這些濃度下,兩種藥物聯用均產生了協同作用。其中,以1 μmol·L-1ANF+2 μmol·L-1Osi方案CI值最小,協同作用最強(Fig 3C),為最佳配比,故作為后續實驗的濃度。

2.4 ANF與Osi聯用對Osi獲得性耐藥NSCLC細胞生長增殖與凋亡的影響在EdU細胞增殖實驗中,與對照組相比,ANF與Osi聯合處理48 h后,H1975/OR與PC9/OR細胞的EdU陽性細胞比例分別下降了71.7%與86.5%,而ANF單獨處理組則分別下降了39.9%與30.4%,Osi單獨處理組分別下降13.6%與11.5%(P<0.01,Fig 4A)。流式凋亡檢測結果也顯示,相比于兩者單獨用藥,ANF與Osi聯合處理48 h后,兩種耐藥細胞株的凋亡率較兩種藥物單獨處理組均明顯增多(P<0.01,Fig 4B)。以上結果提示,ANF與Osi聯用可明顯抑制H1975/OR與PC9/OR細胞的生長增殖并誘導凋亡。

2.5 ANF與Osi聯用對Osi獲得性耐藥的NSCLC細胞遷移與侵襲的影響細胞遷移實驗結果表明,與對照組相比,ANF與Osi聯合處理48 h后H1975/OR與PC9/OR細胞的遷移能力分別下降了86.5%與81.8%,而ANF單獨處理組則分別下降了60.6%與40.2%,Osi單獨處理組分別下降了14.2%與32.5% (P<0.01,Fig 5A);同樣,細胞侵襲實驗結果表明,與對照組相比,ANF與Osi聯合處理使H1975/OR與PC9/OR細胞的侵襲能力分別下降了75.5%與80.3%,而ANF單獨處理組則分別下降了49.6%與44.5%,Osi單獨處理組分別下降了11.5%與13.1%(P<0.01,Fig 5B)。以上結果提示,ANF與Osi聯用可顯著抑制H1975/OR與PC9/OR細胞的侵襲與遷移能力。

Fig 5 Auranofin and osimertinib combination inhibited migration and invasion ability of osimertinib resistant NSCLC cells

2.6 ANF和Osi聯合用藥后誘導HSPB8和自噬增加在H1975/OR與PC9/OR通過RNA-seq結果篩選聯合用藥與單獨用Osi的差異表達基因(Fig 6A),共有36個基因在兩個細胞中均上調,34個基因在兩種細胞中均下調(Fig 6B),此外,在H1975與H1975/OR的RNA-seq結果中發現差異表達的基因中HSPB8耐藥后下調,而該基因在聯合用藥后上調,對敏感株和耐藥株進行qRT-PCR驗證(Fig 6C)發現HSPB8在耐藥后明顯下調(P<0.01),而聯合用藥后明顯上調(P<0.01),Western blot結果顯示(Fig 6D),在兩種細胞中,與敏感株相比,HSPB8表達水平明顯下調(P<0.05或P<0.01),與單獨加Osi相比,Osi和ANF聯用HSPB8表達水平明顯上調(P<0.01),且LC3-II/LC3-I水平明顯上調(P<0.01),說明細胞耐藥機制是通過下調HSPB8,而聯合用藥可以促進HSPB8表達,導致細胞自噬增多最終導致腫瘤細胞死亡。

Fig 6 Auranofin and osimertinib combination induced HSPB8 expression and autophagy in osimertinib resistance NSCLC cells

3 討論

肺癌的靶向治療在多數研究中取得了明顯有效的成果,EGFR突變在肺腺癌中比例高達40%～55%,第三代靶向藥物Osi因為其療效顯著而被廣泛應用,但是患者產生了獲得性耐藥限制了其應用。因此,開發、發掘新的藥物克服Osi耐藥,有望為臨床耐Osi肺癌患者提供一個新的治療思路。本研究通過高通量篩選發現一種抗類風濕關節炎的藥物ANF可恢復Osi敏感性,并證明了其與Osi聯用有協同效果,在細胞增殖、凋亡以及侵襲遷移上有明顯的趨勢。

ANF是一種含金的化合物,1985年被FDA批準用于治療類風濕關節炎,很多研究表明其可以作為一種抗癌藥發揮作用[10],在哺乳動物中ANF發揮其作用的機制主要是抑制硫氧還蛋白氧化還原酶TrxR1和TrxR2,這個機制在1998年被研究,到目前仍然是最主要的作用機制。硫氧還蛋白還原酶是硫氧還蛋白系統的關鍵酶,在很多癌癥中報道癌組織中TrxR/Trx系統上調,且和癌癥的進展與耐藥相關,高表達TrxR/Trx系統還與肺癌和乳腺癌預后差相關[11]。除此之外,ANF可以通過其他多種作用機制發揮抗癌作用,在多發性骨髓瘤中已被報道ANF可以抑制NF-κB和JAK2/STAT3信號通路從而抑制骨髓瘤的進展[12],2013年Wang等報道PKCitoa也是ANF的靶點之一。在NSCLC中報道ANF可以抑制PKCitoa,進而抑制ELF3的磷酸化和后續轉位到細胞核促進轉錄的功能,最終導致癌細胞生長受到抑制[13]。多數研究表明,ANF單獨應用具有抗癌作用,但是所需濃度較大,會產生一定的副作用,而聯合用藥可以降低兩藥的濃度減小副作用且可產生較好的抑制效果,Liu通過高通量的藥物庫篩選出ANF在耐藥的肺小細胞癌中增強順鉑療效,聯合用藥誘導ROS增多,最終導致線粒體損傷和DNA損傷[14]。ANF被報道與吉非替尼聯用也有協同抗癌效果,但是其對增強Osi敏感性效果尚未被研究。

HSPB8屬于熱休克蛋白中小分子熱休克蛋白家族(small heat shock proteins,sHSPs),在環境和生理刺激下表達增多,分子量22 ku,其與BAG3結合后可將錯誤折疊蛋白通過自噬途徑降解[15]。有研究報道,HSPB8既有促癌作用又有抑癌作用,在不同腫瘤中表達情況不同,如在黑色素瘤中,HSPB8和TAK1結合導致p38-MAPK信號通路激活最終導致細胞凋亡,激活的TAK1在Ser552位點結合并磷酸化β-catenin,導致CDK2轉錄減少,最終導致細胞周期阻滯[16];在肝細胞癌中,HSPB8和PI3K結合抑制癌細胞的侵襲和遷移[17]。其在肺癌中的研究較少,本研究發現HSPB8在肺癌中發揮抑癌作用且與自噬相關。

綜上所述,本研究從高通量篩選入手,從1 470種FDA批準的藥物庫中在H1975/OR和PC9/OR細胞中篩選增強Osi敏感性的藥物,最終選出ANF在其血藥濃度時即可發揮抑制腫瘤細胞生長和增強Osi療效的作用,并從兩個細胞系的功能上進行研究,發現兩藥聯用效果明顯,對其作用機制進行研究后發現,耐藥后HSPB8表達水平下調,而聯合用藥后HSPB8和自噬相關蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達水平上調,自噬增強導致腫瘤細胞死亡增多說明HSPB8作為抑癌基因在NSCLC耐Osi細胞株中發揮作用。該研究有望對臨床耐藥患者的用藥方案的選擇提供新思路。