蛋白質(zhì)磷酸化修飾參與經(jīng)典致幻劑誘導(dǎo)的大鼠甩頭反應(yīng)

王劭文,周亞男,孫 毅,蘇瑞斌

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué),江蘇 南京 210000;2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所,抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100850)

經(jīng)典致幻劑(psychedelics)是一種作用于五羥色胺2A受體(serotonin 2A receptor, 5-HT2AR)而發(fā)揮致幻效應(yīng)的精神活性物質(zhì)[1],主要包括麥角酸二乙酰胺(lysergic acid diethylamide, LSD)、 2, 5-二甲氧基-4-甲基苯丙胺(2,5-dimethoxy-4-methylamphetamine, DOM)、裸蓋菇素(psilocybin)及其代謝產(chǎn)物脫磷酸裸蓋菇素(psilocin)等。近年的研究表明,經(jīng)典致幻劑有調(diào)節(jié)精神狀態(tài)的作用,臨床具有治療抑郁癥、焦慮癥[2]、抗成癮[3]等的潛能,其中Psilocybin被美國 FDA指定為重度抑郁癥突破性治療藥物,已進(jìn)入二期臨床試驗(yàn)。然而,由幻覺效應(yīng)導(dǎo)致的精神錯(cuò)亂、沖動(dòng)性行為等副作用是影響致幻劑臨床安全性的重大風(fēng)險(xiǎn)。因此,探究致幻劑作用機(jī)制,以規(guī)避致幻劑臨床副作用,是推動(dòng)致幻劑臨床應(yīng)用的重要方向。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示,經(jīng)典致幻劑可引起小鼠和大鼠誘導(dǎo)甩頭反應(yīng)(head-twitch response, HTR)。甩頭反應(yīng)是嚙齒類動(dòng)物的頭部快速的左右運(yùn)動(dòng)行為[4],是目前經(jīng)典致幻劑研究中使用最多的動(dòng)物模型,甩頭反應(yīng)與人類的幻覺反應(yīng)密切相關(guān)[5]。經(jīng)典致幻劑誘導(dǎo)甩頭行為的分子機(jī)制目前文獻(xiàn)報(bào)道較少,研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)典致幻劑激活5-HT2AR后,通過激活下游多種信號分子來發(fā)揮作用[6],而由于經(jīng)典致幻劑誘導(dǎo)甩頭行為的作用時(shí)間較快,目前研究普遍發(fā)現(xiàn)動(dòng)物給藥后5 min內(nèi)就會誘導(dǎo)甩頭反應(yīng)[4],短時(shí)間內(nèi)蛋白水平難以發(fā)生明顯變化,蛋白質(zhì)的修飾變化可能在其中發(fā)揮了重要作用[7]。蛋白質(zhì)翻譯后修飾主要包括磷酸化、乙酰化和泛素化修飾。蛋白質(zhì)磷酸化修飾是一種廣泛存在的翻譯后修飾類型,主要發(fā)生在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、發(fā)育分化、癌癥機(jī)理等研究領(lǐng)域[8]。乙酰化是蛋白質(zhì)功能的主要調(diào)節(jié)機(jī)制,主要參與細(xì)胞代謝[9]和轉(zhuǎn)錄調(diào)控[10]等。泛素化修飾介導(dǎo)大部分蛋白質(zhì)的降解[11]。

5-HT2AR主要存在于前額葉皮層,為經(jīng)典致幻劑的主要作用部位,前額葉皮層也與認(rèn)知和信息處理等高級功能密切相關(guān)[12],因此我們選擇前額葉皮層為研究對象。為探究經(jīng)典致幻劑的幻覺等急性藥理效應(yīng)是否與蛋白質(zhì)修飾有關(guān),本研究建立致幻劑誘導(dǎo)的大鼠甩頭反應(yīng)動(dòng)物模型,通過檢測大鼠前額葉皮層中蛋白質(zhì)磷酸化、乙酰化和泛素化泛修飾變化來探究參與大鼠甩頭反應(yīng)的蛋白質(zhì)修飾類型,為探究經(jīng)典致幻劑誘導(dǎo)甩頭反應(yīng)的分子機(jī)制研究提供方向。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級Sprague-Dawley大鼠,♂,體質(zhì)量(180～230)g,購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司,許可證號SCXK(京)2019-0010。動(dòng)物倫理學(xué)審查編號:IACUC of AMMS-06-2019-007。

1.2 試劑及抗體LSD、DOM(軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所,自制,純度>99%)、Psilocin(軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所,自制,純度>99%); P-Threonine抗體(杭州景杰生物科技股份有限公司,PTM-705RM)、P-Serine 抗體(Abcam,ab9332)、P-Tyrosine抗體(杭州景杰生物科技股份有限公司,PTM-702RM)、Ubiquitin抗體(杭州景杰生物科技股份有限公司,PTM-5798)、Acetyllysine抗體(杭州景杰生物科技股份有限公司,PTM-105RM)、二抗均購自Jackson ImmunoResearch公司;RIPA裂解液(北京普利萊基因技術(shù)有限公司,C1053-100);Cocktail(Roche,04693116001)、PhosStop(Roche,4906845001)、Trichostatin A(上海陶術(shù)生物科技有限公司,T6270)、Nicotinamide(上海陶術(shù)生物科技有限公司,T0934)、PR-619(Selleck,S7130);BCA蛋白定量試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司,P1511)、蛋白上樣緩沖液(北京博邁德基因技術(shù)有限公司,PA124-01)、顯影液(Millipore,P90720)。

1.3 儀器和工具透明箱(25 cm×25 cm×25 cm);手術(shù)剪(直)、眼科鑷(彎)、咬骨鉗、咬骨剪、手術(shù)刀、大鼠腦模具、彎鑷;高通量組織研磨器(QIAGEN TissueLyserⅡ)、DYY-8C型電泳儀(北京市六一儀器廠,2085943),顯影儀(上海天能科技有限公司,5200)。

1.4 方法

1.4.1甩頭反應(yīng)實(shí)驗(yàn) 將大鼠隨機(jī)分為對照組(VEH)和給藥組(LSD、DOM、Psilocin)。均采用腹腔注射方式,給藥體積為0.2 mL/200 g。LSD、DOM和Psilocin溶于生理鹽水,VEH為等量生理鹽水。LSD(0.025、0.1、0.5 mg·kg-1)、DOM(0.5、1、3、4、5、6 mg·kg-1)、Psilocin(0.25、0.5、2、4 、8 mg·kg-1)和 VEH單次給藥后立即將大鼠置于觀察箱,記錄給藥10 min或30 min內(nèi)大鼠的總甩頭次數(shù)。

1.4.2組織樣本解剖 根據(jù)大鼠腦圖譜及腦模具,選擇前囟5.16～3.16 mm、3.16～0.16 mm兩個(gè)部分各切2 mm、3 mm腦片(Fig 1示藍(lán)色三角形部位)。樣本置于凍存管,液氮或-80 ℃保存。

Fig 1 Anatomical diagram of prefrontal cortex in rats

1.4.3蛋白提取 分別提取各樣本中的全部蛋白。在RIPA裂解液中加入相應(yīng)的蛋白修飾抑制劑,PhosStop每10 mL提取液中加入1片,cocktail每50 mL提取液中加入1片。磷酸化蛋白使用cocktail和PhosStop進(jìn)行抑制,乙酰化蛋白使用cocktail、Trichostatin A(3 μmol·L-1)和Nicotinamide(50 mmol·L-1)進(jìn)行抑制,泛素化蛋白使用cocktail和PR-619(50 μmol·L-1)進(jìn)行抑制。各組加入2顆小鋼珠,使用高通量組織研磨器進(jìn)行組織研磨。取100 μL上清,進(jìn)行BCA 蛋白測定,檢測各組上清液的蛋白濃度,再提取500 μL上清液加入125 μL 5×蛋白上樣緩沖液,煮沸變性后分裝放于-80 ℃冰箱保存。

1.4.4蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot) 上樣前再次煮沸10 min,將樣品濃度調(diào)至2 g·L-1,每孔上樣10 μL,使用15孔10% SDS-PAGE凝膠在80 V和120 V恒壓下進(jìn)行電泳,200 mA恒流下選擇適當(dāng)時(shí)間將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,使用5% BSA室溫封閉2 h,加入相應(yīng)稀釋于5% BSA的特異性一抗(1 ∶1 000) 4 ℃冰箱孵育過夜,洗膜3次,每次5 min。加入5% BSA稀釋的相應(yīng)二抗(1 ∶1 000),室溫孵育1 h,洗膜后使用ECL顯影液進(jìn)行曝光顯影。

2 結(jié)果

2.1 經(jīng)典致幻劑誘導(dǎo)大鼠甩頭反應(yīng)大鼠腹腔給予溶劑和不同濃度的致幻劑后,記錄30 min內(nèi)的甩頭次數(shù)(Fig 2A)。結(jié)果顯示,與VEH組比較,LSD在0.025 mg·kg-1劑量下甩頭次數(shù)明顯升高(P<0.001,Fig 2B); DOM在3 mg·kg-1劑量下甩頭次數(shù)明顯升高(P<0.0001,Fig 2C); Psilocin在8 mg·kg-1劑量下甩頭次數(shù)明顯升高(P<0.05,Fig 2D)。因此,我們選擇LSD (0.025 mg·kg-1)、DOM (3 mg·kg-1) 和 psilocin (8 mg·kg-1)的劑量腹腔注射建立動(dòng)物模型并進(jìn)行接下來的研究。已有研究證明,經(jīng)典致幻劑誘導(dǎo)甩頭反應(yīng)的量效曲線為倒“U“型[13],在我們的實(shí)驗(yàn)體系中,DOM和LSD誘導(dǎo)的甩頭次數(shù)符合這一特點(diǎn)。

2.2 經(jīng)典致幻劑給藥10 min時(shí)誘導(dǎo)大鼠前額葉皮層蛋白質(zhì)修飾變化大鼠腹腔給藥溶劑和致幻劑后,甩頭10min 時(shí)取大鼠前額葉皮層進(jìn)行蛋白質(zhì)修飾檢測(Fig 3A)。Western blot結(jié)果顯示,與VEH組相比,LSD、DOM和Psilocin組在蛋白質(zhì)絲氨酸和蘇氨酸修飾上有較明顯的上調(diào)或下調(diào)趨勢。在蛋白質(zhì)絲氨酸變化中,在給藥致幻劑LSD和DOM后,在50～55 ku條帶相較VEH組上調(diào),Psilocin沒有明顯上調(diào)趨勢;在蛋白質(zhì)蘇氨酸變化中,在55～100 ku的條帶處相較VEH組明顯上調(diào)。180～100、36 ku處致幻劑給藥組(LSD、DOM、Psilocin)相較VEH組呈下降趨勢。Psilocin組從55～250 ku部分相較VEH組呈下降趨勢;酪氨酸的磷酸化修飾沒有明顯差異。蛋白的乙酰化和泛素化修飾未見明顯變化(Fig 3B)。結(jié)果提示我們,經(jīng)典致幻劑腹腔給藥誘導(dǎo)大鼠甩頭10 min后,前額葉皮層的蛋白磷酸化發(fā)生變化。

2.3 經(jīng)典致幻劑給藥30 min時(shí)誘導(dǎo)大鼠前額葉皮層蛋白質(zhì)修飾變化大鼠腹腔給藥溶劑和致幻劑后,甩頭30 min時(shí)取大鼠前額葉皮層進(jìn)行蛋白質(zhì)修飾檢測(Fig 4A)。Western blot結(jié)果顯示,與VEH組相比,LSD、DOM組在蛋白質(zhì)蘇氨酸修飾存在下調(diào)趨勢。在蛋白質(zhì)絲氨酸變化中,絲氨酸的磷酸化修飾沒有明顯差異;在蛋白質(zhì)蘇氨酸變化中,在85 ku處LSD和DOM組相較VEH組呈下降趨勢,Psilocin存在上調(diào)趨勢;在蛋白質(zhì)酪氨酸變化中,LSD組相較VEH組在15 ku處有一條帶。蛋白的乙酰化和泛素化修飾未見明顯變化(Fig 4B)。該結(jié)果表明,經(jīng)典致幻劑腹腔給藥誘導(dǎo)大鼠甩頭30 min后,前額葉皮層的蛋白磷酸化發(fā)生變化。結(jié)合之前得到的10 min時(shí)也發(fā)生磷酸化變化,我們得到經(jīng)典致幻劑在誘導(dǎo)甩頭過程中會誘導(dǎo)前額葉皮層蛋白質(zhì)磷酸化變化。

3 討論

經(jīng)典致幻劑是一類通過作用于五羥色胺受體而誘導(dǎo)人類幻覺效應(yīng)的藥物,幻覺作用是致幻劑對社會造成潛在危害的原因之一,也是影響致幻劑臨床應(yīng)用安全性的重要原因之一。在本研究中,我們通過單次腹腔注射經(jīng)典致幻劑進(jìn)行大鼠的甩頭反應(yīng)實(shí)驗(yàn),確定甩頭次數(shù)最高的劑量及甩頭次數(shù)增高較快的時(shí)間,通過蛋白修飾泛抗體檢測實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)給藥10 min和30 min后前額葉皮層中的絲氨酸和蘇氨酸磷酸化修飾發(fā)生變化,而乙酰化和泛素化未見明顯變化,提示我們蛋白質(zhì)的磷酸化修飾是經(jīng)典致幻劑誘導(dǎo)甩頭過程中的重要機(jī)制。而蛋白質(zhì)泛素化修飾在我們的結(jié)果中未見明顯變化,也尚未查閱到經(jīng)典致幻劑與泛素化的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。關(guān)于乙酰化修飾,有文獻(xiàn)表明經(jīng)典致幻劑LSD在靜脈給藥兔30 min時(shí)腦中發(fā)生組蛋白乙酰化修飾[14],但在我們的結(jié)果中未檢測到明顯的乙酰化修飾,這可能因?yàn)閷?shí)驗(yàn)條件限制,蛋白提取效率不夠高,也可能是兔和大鼠種屬差異。

目前對于經(jīng)典致幻劑的研究認(rèn)為,經(jīng)典致幻劑在激活5-HT2AR后通過激活下游的Gq和Gs信號通路從而介導(dǎo)動(dòng)物的甩頭行為[15-16],與環(huán)磷酸腺苷和Ca2+的釋放有關(guān),提示我們信號通路中的蛋白激酶A等蛋白質(zhì)可能在其中發(fā)揮了作用。一項(xiàng)蛋白質(zhì)組學(xué)研究檢測了致幻劑5-MeO-DMT作用于類腦器官下的蛋白質(zhì)變化,發(fā)現(xiàn)934種蛋白在5-MeO-DMT的處理后發(fā)生差異表達(dá)[17],為蛋白質(zhì)在經(jīng)典致幻劑的機(jī)制研究中提供了依據(jù)。另一項(xiàng)基于細(xì)胞水平的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)典致幻劑DOI相較非致幻型5-HT2AR激動(dòng)劑利舒脲(Lisuride)會特異性誘導(dǎo)5-HT2AR胞外第三環(huán)的絲氨酸280位磷酸化[18]。提示我們幻覺現(xiàn)象的產(chǎn)生可能與蛋白質(zhì)磷酸化密切相關(guān),我們的研究結(jié)果初步證實(shí)了此假設(shè)。但是蛋白修飾的變化可能也是由蛋白質(zhì)水平變化所導(dǎo)致,在我們的研究中僅檢測了蛋白質(zhì)修飾的變化,并沒有驗(yàn)證蛋白水平的變化。

Fig 2 Effects of LSD, DOM and Psilocin on head-twitch response in SD rats in 30 min

Fig 3 Effects of LSD, DOM, Psilocin on protein phosphorylation, acetylation and ubiquitination in PFC of SD rats in 10 min(n=3)

Fig 4 Effects of LSD, DOM, Psilocin on protein phosphorylation, acetylation and ubiquitination in PFC of SD rats in 30 min(n=3)

在一項(xiàng)動(dòng)物水平的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究中提到,腹腔急性給藥苯環(huán)利定進(jìn)行精神分裂癥造模后,給藥15 min時(shí)腦組織中蛋白質(zhì)的磷酸化變化更明顯于30 min和240 min時(shí)的磷酸化變化,并且由于藥物作用時(shí)間較快,15 min時(shí)蛋白水平?jīng)]有明顯的改變[7]。因此,我們推測在經(jīng)典致幻劑急性作用過程中,主要為蛋白質(zhì)磷酸化修飾的變化。

綜上所述,現(xiàn)有的經(jīng)典致幻劑分子機(jī)制的研究僅停留在細(xì)胞水平以及5-HT2AR結(jié)構(gòu)及下游信號通路水平,而幻覺的產(chǎn)生往往通過腦內(nèi)多個(gè)腦區(qū)的相互作用來實(shí)現(xiàn),因此有必要從動(dòng)物組織水平對幻覺產(chǎn)生的機(jī)制進(jìn)行深一步研究。在本研究中我們使用經(jīng)典致幻劑中最常用的甩頭反應(yīng)動(dòng)物模型,研究甩頭行為下大鼠前額葉皮層中的蛋白質(zhì)修飾變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)典致幻劑單次給藥大鼠10和30 min時(shí)前額葉皮層中會發(fā)生不同蛋白的磷酸化上調(diào)或下調(diào)變化,證明經(jīng)典致幻劑在誘導(dǎo)急性的藥理作用過程中伴隨著蛋白質(zhì)磷酸化修飾。但僅通過泛抗體檢測實(shí)驗(yàn)無法精確了解磷酸化蛋白的種類和變化倍數(shù),無法進(jìn)一步驗(yàn)證蛋白質(zhì)磷酸化修飾是否與幻覺或甩頭反應(yīng)有關(guān),也無法研究幻覺或甩頭行為發(fā)生的具體機(jī)制,因此有必要繼續(xù)通過更高精度的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)方法對此條件下的大鼠腦組織樣本進(jìn)行進(jìn)一步定量檢測,以便發(fā)現(xiàn)經(jīng)典致幻劑作用下的關(guān)鍵基因及蛋白,深入了解經(jīng)典致幻劑誘導(dǎo)幻覺作用可能的分子機(jī)制,為將來經(jīng)典致幻劑幻覺治療藥物的研發(fā)提供方向。