人參皂苷Rg1通過激活Nrf2/xCT/GPX4通路抑制神經元鐵死亡改善缺血性腦卒中損傷

胡凱超,高 巖,何佳琦,楚世峰,張 釗,陳乃宏

(1.中國醫學科學院藥物研究所 神經科學中心,天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室,北京 100050;2.天津中醫藥大學中藥學院,天津 301617)

缺血性腦卒中約占腦卒中患病人口總數的87%,是由腦部血管堵塞引起的腦組織缺血、缺氧性腦損傷,具有高發病率、高致死率、高致殘率等特點,給社會和家庭造成沉重負擔[1]。迄今為止,唯一被FDA批準治療缺血性腦卒中的溶栓藥物重組組織型纖溶酶原激活劑(rt-PA)具有治療時間窗短,易引發出血轉化等缺點[2],而在血流恢復后神經系統又會遭受到不同程度的缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷,包括線粒體功能障礙、興奮性毒性、氧化應激、炎癥反應、凋亡、鐵死亡[3]等其他病理過程[4]。因此,針對I/R損傷的關鍵步驟去尋找有效的神經保護劑對缺血性腦卒中的治療具有重要意義。

近年來許多研究表明,鐵死亡參與腦缺血進程中神經細胞的損傷[5]。其主要機制是,在二價鐵或酯氧合酶的作用下,催化細胞膜上高表達的不飽和脂肪酸,發生脂質過氧化,從而誘導細胞死亡[6]。具體來說,鐵死亡表現出獨特的形態特征,如線粒體收縮和線粒體膜密度增加、外部膜破裂、內部膜壓縮和完整的細胞核。在分子水平上,表現為鐵蓄積式鐵離子失衡和細胞內谷胱甘肽(glutathione,GSH)耗竭,以及谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)失活,并伴有脂質過氧化物水平升高,最終導致細胞膜損傷和細胞死亡[7]。在參與調控鐵死亡信號通路中,核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)信號通路與鐵死亡的發生機制具有高度的相關性。Nrf2入核后促進轉錄的多個基因在防止鐵死亡的發生中起著關鍵作用,包括胱氨酸/谷氨酸轉運蛋白(cystine/glutamate transporter,SLC7A11,xCT)、鐵蛋白輕重鏈,甚至GPX4本身,都是Nrf2的靶基因[8]。表明針對Nrf2的調控為抗缺血性腦卒中鐵死亡的重要途徑。

人參皂苷Rg1是一種四環三萜類衍生物(Fig 1A),是人參的主要活性成分。最近的許多研究認為它是最有效的抗中風候選藥物之一[9-10]。Rg1對實驗性急性缺血性卒中有明顯療效,表現為其縮小梗死體積、減輕間質水腫程度和改善神經評分的能力,但是其根本的機制仍然在探索中[11]。前期研究證明,Rg1可以通過促進Nrf2入核,激活含有抗氧化反應元件的基因的轉錄,增加抗氧化酶的表達,從而減輕I/R后的氧化應激[12]。但其能否上調GPX4蛋白表達,進而減輕缺血性腦卒中引起的神經細胞鐵死亡尚未有報道。因此,我們針對Rg1對缺血性腦卒中后神經元鐵死亡的影響及其相關機制展開進一步的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物 SD大鼠,雄性,體質量(260～280) g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司(清潔級,合格證編號:SCXK(京)2021-0011),購入后飼養于中國醫學科學院藥物研究所動物房,室溫維持在(26±2)℃,相對濕度(55±5)%,12 h /12 h光照/避光循環,自由攝食與飲水。

1.1.2細胞株 HT22小鼠海馬神經元細胞培養于含10% FBS的DMEM完全培養基中,置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養,隔天傳代,供后續實驗使用。

1.1.3藥品與試劑 人參皂苷Rg1(上海源葉生物科技有限公司,B21057,純度HPLC≥98%);ML385(索萊寶,IM1020);Ferrostatin-1(Fer-1)(MACKLIN,F864515);CCK-8(索萊寶,CA1210);Anti-GPX4抗體(Abcam公司,ab125066);Anti-Nrf2抗體(Abcam公司,ab76026);Anti-xCT抗體(ABclonal,A2413);Anti-β-actin抗體(Sigma,A5441);Anti-Rabbit IgG (H+L)抗體(KPL,5450-0010);Anti-Mouse IgG (H+L)抗體(KPL,5450-0011);Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Fluor594(affinity,S0006);GSH/GSSG試劑盒(同仁化學,G263),MDA試劑盒(同仁化學,M496),SOD試劑盒(同仁化學,S311),Fe2+試劑盒(北京普利來基因技術有限公司,E1042)。

1.1.4儀器 小動物呼吸麻醉機(深圳市瑞沃德生命科技有限公司);MCAO栓線(北京西濃科技有限公司);高速組織研磨儀(康濤科技);ECL發光儀(GE公司,Amersham Imager 680);DYY-7C型垂直板電泳轉移裝置及蛋白電泳系統電源(北京六一儀器廠);Milli-Q plus超純水儀(Millipore公司);透射電子顯微鏡(日本電子株式會社,JEM-1200EX);倒置熒光生物顯微鏡(重慶澳浦光電技術有限公司,DSY2000X);三氣培養箱(Heal Force,HF100);熒光酶標儀(美谷分子儀器有限公司,SpectraMax iD3)。

1.2 方法

1.2.1動物分組、模型制備及給藥 將20只SD雄性大鼠隨機分為sham組、MCAO組、MCAO+Rg1(40 mg·kg-1)組及MCAO+Fer-1(0.2 mg·kg-1)組,每組各5只。sham組分離CCA、ECA、ICA,不插入線栓,其余與MCAO組相同。MCAO造模90 min后拔栓,同時立即尾靜脈注射生理鹽水,Rg1或Fer-1。24 h后進行神經行為學檢測,隨后取材。

1.2.2神經行為學評分Zea Longa法 造模完成后24 h,提鼠尾離開地面約一尺,觀察兩前肢狀況;將大鼠置于地面,觀察行走情況。采用5級評分法(0～5分),分數越高說明其神經行為損傷越重。0分:無神經功能缺損癥狀;1分:不能伸展對側前爪;2分:身體向對側轉圈;3分:身體向對側傾倒;4分:意識喪失,不能自發行走;5分:動物死亡。

1.2.3神經行為學評分Garcia Test 造模完成后24 h,通過Garcia Test評價神經功能。Garcia Test是由7個獨立測試組成,分別為自發活動、腹部感覺、觸須反應、肢體對稱性、側身轉向、前肢爬行、攀爬。每個單獨測試的表現按0(表現最差)至3(表現最好)的等級評分,以得分(max=21)的總和評價大鼠的神經功能,評分越低,造模越嚴重[13]。

1.2.4透射電鏡觀察神經細胞線粒體 大鼠神經功能評分完成后,腹腔注射水合氯醛(400 mg·kg-1)麻醉,心臟灌注PBS沖洗,4%多聚甲醛溶灌流固定,完成后斷頭取腦,取皮質半暗帶組織,修剪成1 mm3大小的組織塊,電鏡固定液中4 ℃保存過夜。通過分級乙醇系列脫水后,將細胞包埋在樹脂中過夜。超薄切片隨后用檸檬酸鉛染液和醋酸雙氧軸染液染色。使用透射電子顯微鏡收集圖像。

1.2.5Western blot實驗 大鼠神經功能評分完成后,腹腔注射水合氯醛麻醉,斷頭取腦,冰上分離皮質半暗帶區域,立即于-80 ℃凍存。取出提取皮質或細胞總蛋白,BCA試劑盒定量,SDS-PACE凝膠電泳,10%分離膠分離。轉膜,5%BSA封閉2 h,根據目標蛋白分子量裁膜,分別加入對應一抗(GPX4,1 ∶5 000;xCT,1 ∶2 000;Nrf2,1 ∶2 000;β-actin,1 ∶10 000),4 ℃過夜。TBST洗膜10 min,重復3次,加入二抗(1 ∶5 000),室溫孵育2 h,回收二抗,TBST洗膜10 min,重復3次,ECL儀曝光成像。

1.2.6OGD/R誘導HT22細胞損傷模型及Rg1給藥 對數生長期細胞以5×103/孔密度接種于96孔板內,正常培養24 h后,更換為Earle's平衡鹽溶液并置于三氣培養箱(94%N2、5%CO2和1%O2)進行低氧培養,時間為2 h、4 h、6 h和8 h;缺氧完成后更換完全培養基,置于37 ℃,5% CO2培養箱中正常培養24 h。CCK-8法檢測細胞活力,根據實驗結果確定HT22細胞OGD/R最佳時間。最終確定后續實驗中,OGD 8 h后,模型組更換為完全培養基,Rg1組更換為含不同濃度Rg1的完全培養基,正常培養24 h。

1.2.7CCK-8法檢測細胞活力 細胞培養結束后將培養板取出,每孔避光加入10 μL CCK-8溶液在培養箱內孵育1.5 h,用酶標儀測定在450 nm處的吸光度,計算細胞活力。

1.2.8細胞內GSH/GSSG含量檢測 收集處理后的各組細胞樣品,凍融裂解細胞后,8 000×g離心10 min,上清分為兩份,分別加入掩蔽劑作為GSSG樣品管和ddH2O作為總谷胱甘肽樣品管,隨后加入工作液在37 ℃培養10 min。用酶標儀在405 nm或415 nm下測定吸光度。根據標注曲線分別計算出總谷胱甘肽和GSSG的濃度。樣品中GSH濃度使用以下公式計算:GSH=總谷胱甘肽(GSH+GSSG)-GSSG×2。

1.2.9細胞內MDA含量檢測 收集處理后的各組細胞樣品,離心后去除上清,加入Antioxidant PBS solution吹打裂解,再加入Lysis Buffer充分渦旋后靜置5 min。取10 μL用BCA法進行蛋白質定量。各微管中加入Working solution,渦旋振蕩器充分混勻。在95 ℃,反應15 min。冰浴上冷卻5 min,10 000×g離心10 min。取上清加至96孔板黑板中。用熒光酶標儀檢測檢測熒光強度(Ex:540 nm,Em:590 nm)。根據MDA的標準曲線計算樣品中的MDA濃度,并用蛋白濃度進行校準。

1.2.10細胞內SOD含量檢測 冰浴超聲破碎HT22細胞(60 W,0.5 s間隔,15 min)后,4 ℃ 10 000×g離心15 min,上清液制成樣品溶液。取10 μL樣品用于BCA蛋白定量。樣品加入WST工作液,酶工作液,混勻。在37℃培養箱中培養20 min。用酶標儀在450 nm處讀數。按說明書計算SOD活性。

1.2.11細胞內Fe2+含量檢測 HT22細胞加入裂解液,置于搖床裂解2 h。取10 μL樣品裂解液用BCA蛋白定量。樣品加入高錳酸鉀溶液與緩沖液,混勻,60 ℃孵育1 h。冷卻至室溫,加入鐵離子檢測劑,混勻,室溫孵育30 min。取200 μL于96孔板,在550 nm測定吸光度。繪制標準曲線并計算鐵離子濃度。

1.2.12細胞免疫熒光 將生長狀態良好的HT22細胞以2×104/孔密度接種在24孔板內的圓形蓋玻片上,按上述OGD/R方法造模。完成后棄掉培養液,用冰浴的PBS洗1次,加入適量4%多聚甲醛冰上固定20 min,棄去多聚甲醛,PBS輕輕洗3次。加入0.5% TritonX-100/PBS透化10 min,棄掉Triton,PBS輕輕洗3次。加5% BSA封閉30min,隨后加一抗(GPX4,1 ∶200),4 ℃孵育過夜?；厥找豢?加PBS,放在搖床上慢速搖晃5 min,重復3次,加二抗[Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Fluor594,1 ∶200]室溫避光孵育2 h。回收二抗,PBS搖床洗3次,每次5 min。用DAPI染色液在室溫下孵育10 min染色細胞核,再次用PBS搖床洗3次,每次5 min。取3 μL 90%甘油滴于載玻片上,用鑷子夾取蓋玻片,反扣于甘油上,指甲油封片,熒光顯微鏡下觀察拍照。

2 結果

2.1 Rg1可改善HT22細胞OGD/R模型的存活率Rg1結構式如Fig 1A所示,CCK-8檢測結果表明,實驗濃度范圍內的Rg1對正常HT22細胞的存活率均無影響(Fig 1B)。隨后我們檢測不同氧糖剝奪時間對HT22細胞活力的影響,HT22細胞存活率隨OGD時間增加逐漸下降,當OGD 8 h時,細胞存活率為55.07%±0.83%(Fig 1C)。后續研究選擇OGD培養8 h,復氧24 h作為HT22細胞的OGD/R造模條件。如Fig 1D所示,加入Rg1后,細胞存活率明顯上升。Rg1濃度在0.1～10 μmol·L-1檢測范圍相較模型組均具有顯著性,Rg1濃度為10 μmol·L-1時保護效果最佳,HT22細胞的存活率為81.4%± 5.73%(P<0.001)。

2.2 Rg1可抑制HT22細胞OGD/R模型引起的鐵死亡OGD/R損傷后HT22細胞GSH/GSSG比值顯著降低(P<0.05),而Rg1劑量依賴性地逆轉了這一結果,在10 μmol·L-1時效果最佳,上調OGD/R后HT22細胞GSH/GSSG比值(P<0.001)(Fig 2A);OGD/R損傷后SOD活性明顯降低(P<0.05),Rg1(10 μmol·L-1)能恢復SOD活性(P<0.01)(Fig 2B);此外,OGD/R后HT22細胞MDA(P<0.001)和Fe2+(P<0.01)含量明顯上升,Rg1(1,10 μmol·L-1)能明顯下調OGD/R損傷后HT22細胞MDA(P<0.05或P<0.001)(Fig 2C)和Fe2+(P<0.05)(Fig 2D)的含量。為研究Rg1影響OGD/R后HT22細胞鐵死亡的機制,本研究采用Western blot檢測了HT22細胞GPX4、xCT蛋白表達情況,結果表明OGD/R能降低HT22細胞GPX4和xCT(Fig 3B)蛋白的表達(P<0.01),提示OGD/R增加HT22細胞鐵死亡敏感性,Rg1給藥后,HT22細胞GPX4、xCT蛋白表達均有顯著性的提高,且在10 μmol·L-1濃度時效果最佳(P<0.01)。說明Rg1能顯著逆轉OGD/R導致的HT22細胞鐵死亡敏感性增強。為了進一步驗證Rg1降低OGD/R誘導HT22細胞鐵死亡敏感性的作用,我們采用免疫熒光觀察GPX4蛋白表達的變化。結果表明OGD/R處理后HT22細胞GPX4蛋白熒光信號明顯變弱,而隨著Rg1劑量增高,GPX4信號增強(Fig 3C),這與Western blot結果一致。

2.3 Nrf2介導Rg1對OGD/R后HT22細胞鐵死亡的抑制作用Nrf2是GPX4和xCT的上游轉錄因子,為研究Rg1是否能上調Nrf2含量,采用Western blot檢測Rg1給藥后Nrf2蛋白水平的變化,結果表明Rg1給藥后HT22細胞Nrf2蛋白表達明顯上調(Fig 4B),且在10 μmol·L-1濃度時效果最佳(P<0.01)。為了驗證Nrf2在Rg1抑制OGD/R處理HT22細胞鐵死亡中的作用,加入小分子抑制劑ML385,其可抑制Nrf2與DNA結合結構域結合。結果表明,加入ML385(10 μmol·L-1)后,Rg1(10 μmol·L-1)對OGD/R后HT22細胞存活率(Fig 4C)以及GPX4和xCT(Fig 4E)蛋白的上調作用均被抑制,提示Rg1通過促進Nrf2/xCT/GPX4通路,減少OGD/R后HT22細胞鐵死亡。

Fig 1 Effect of ginsenoside Rg1 on survival rate of HT22 cells induced by

2.4 Rg1可改善MCAO大鼠神經功能我們采用大鼠MCAO模型驗證Rg1在體水平對腦卒中的保護作用,實驗設計如Fig 5所示。MCAO模型缺血1.5 h,再灌注24 h后,采用Zea Longa法以及Garcia Test對大鼠進行神經行為學評分。結果顯示與sham組相比,MCAO組大鼠Zea Longa和Garcia Test(Tab 1)評分差異均有顯著性(P<0.001),而在Rg1(40 mg·kg-1)或Fer-1(0.2mg·kg-1)給藥后神經行為學評分均有明顯的改善。

2.5 Rg1改善MCAO大鼠皮質神經細胞線粒體鐵死亡典型特征為了檢測Rg1對MCAO大鼠皮質神經細胞鐵死亡的影響,我們取缺血半暗帶附近組織,采用透射電子顯微鏡觀察各組細胞線粒體微結構。結果顯示,sham組大鼠皮層神經細胞狀態良好,胞質分布均勻,線粒體形態正常。與sham組相比,MACO組大鼠細胞電鏡下出現線粒體外膜破裂、線粒體皺縮、嵴減少、膜致密等鐵死亡典型特征;MCAO+Rg1組和鐵死亡抑制劑MCAO+Fer-1組神經細胞線粒體外膜均未見破裂,收縮明顯逆轉,且線粒體嵴未見嚴重損傷(Fig 6)。

Fig 2 Effect of ginseng Rg1 on content of ferroptosis markers in HT22 cells induced by

Fig 3 Effect of ginsenoside Rg1 on content of ferroptosis-related proteins in HT22 cells induced by OGD/R

Fig 4 Effect of Nrf2 on inhibitory effect of Rg1 on ferroptosis in HT22 cells after

Fig 5 Schematic diagram of MCAO modeling,administration and sampling in rats

Tab 1 Effect of ginsenoside Rg1 on Zea Longa and Garcia Test scores in MCAO

2.6 Rg1對MCAO大鼠皮質腦組織鐵死亡相關蛋白的影響Western blot實驗進一步檢測Rg1對MCAO模型中鐵死亡相關蛋白的影響,結果顯示,與sham組相比,MCAO組大鼠皮質腦組織內鐵死亡負調節蛋白GPX4(P<0.05)和xCT(P<0.05)(Fig 7B)水平明顯降低;與MCAO組相比,MCAO+Rg1組大鼠皮質腦組織GPX4蛋白表達增加(P<0.05)、xCT蛋白表達明顯增加(P<0.01),MCAO+Fer-1組GPX4(P<0.05)蛋白以及xCT(P<0.01)蛋白表達也明顯上升。Rg1處理組對鐵死亡相關蛋白的上調效果與鐵死亡抑制劑Fer-1組相當,動物水平上驗證Rg1具有改善卒中后神經元鐵死亡的作用。

Fig 7 Effect of ginsenoside Rg1 on ferroptosis-related proteins in cortical tissue of MCAO rats

3 討論

人參和三七在臨床治療缺血性腦卒中的復方和中成藥中占比巨大[14],人參皂苷Rg1為二者共有的主要活性成分,是通心絡膠囊、血栓心寧片等中成藥的共同有效成分,具有廣闊的應用開發前景[15-16]?，F代藥理研究表明,人參皂苷Rg1可改善動物局灶性腦缺血引起的神經損傷、腦梗死體積和血腦屏障通透性,其主要機制是通過抑制氧化應激和神經炎癥觸發的細胞凋亡與壞死程序[11]。既往研究報道,神經元死亡的主要原因是壞死、凋亡、自噬、焦亡等,但這些機制均不能完全解釋缺血性腦卒中引起的腦損傷,鐵死亡作為一種新型的細胞死亡方式,被證實參與腦卒中損傷的生理病理過程[5]。在實驗性中風動物模型中,鐵螯合劑、Liproxstatin-1、Ferrostatin-1等鐵死亡抑制劑均能有效的減少缺血性卒中后的再灌注損傷來改善神經預后[17]。提示抑制神經細胞鐵死亡可能成為治療缺血性腦卒中的有效手段。而Rg1對缺血性腦卒中的保護作用是否與抑制細胞鐵死亡有關還未見報道,因此,本實驗對Rg1影響缺血性腦卒中后神經細胞鐵死亡的作用進行研究。

OGD/R模型是模擬體內缺血/缺氧/再灌注情況較理想的模型,HT22細胞是小鼠神經元細胞系,體外研究谷氨酸毒性誘導鐵死亡的良好模型,因此本實驗采用OGD/R誘導HT22細胞模擬體內缺血再灌注的情況,研究Rg1對缺血性腦卒中神經元的保護作用[18]。結果表明在OGD 8 h/R 24 h時,HT22細胞存活率明顯降低,而10、1和0.1 μmol·L-1的Rg1均能提高OGD/R后細胞存活率,并隨著Rg1濃度的增加而升高,所以后續研究選擇10、1和0.1 μmol·L-1作為Rg1的高,中和低劑量濃度。實驗發現OGD/R損傷后HT22細胞GSH/GSSG比值明顯降低,SOD活性減弱,而Rg1改變了這一結果,上調了OGD/R后HT22細胞GSH/GSSG比值,恢復了SOD活性。此外,OGD/R后HT22細胞內MDA與Fe2+明顯升高,Rg1降低了MDA和Fe2+的水平,提示Rg1降低了OGD/R后HT22細胞鐵死亡的相關指標,減少了細胞鐵死亡。GPX4是細胞鐵死亡的核心負調控蛋白,GPX4能降解小分子過氧化物和某些脂質過氧化物,抑制脂質過氧化。GPX4表達下調則會對鐵死亡更敏感;相反,若上調GPX4的表達,則會產生對鐵死亡的耐受[3]。xCT蛋白負責攝入胱氨酸,參與GSH的合成,GSH又是GPX4降解脂質過氧化物的底物,起到抗氧化和抵抗鐵死亡的作用(Fig 8)。實驗發現OGD/R能降低HT22細胞GPX4和xCT蛋白的表達,進一步說明OGD/R會誘導HT22細胞鐵死亡。Rg1給藥能恢復HT22細胞GPX4和xCT蛋白表達。說明Rg1能明顯降低OGD/R損傷后HT22細胞鐵死亡的敏感性。Nrf2能促進GPX4和xCT基因的轉錄。實驗發現Rg1能促進OGD/R后HT22細胞Nrf2的表達。在加入抑制Nrf2與DNA結合的小分子抑制劑ML385后,Rg1提高OGD/R后HT22細胞存活率,上調GPX4和xCT蛋白表達的作用被抵消,提示Rg1可能通過促進Nrf2/GPX4/xCT通路,減少OGD/R后HT22細胞鐵死亡。

Fig 8 Schematic diagram of protective mechanism of Rg1 on neuronal ferroptosis induced by MCAO or OGD/R

此外,我們前期研究還發現,Rg1可降低MCAO大鼠皮質神經元靶向Nrf2的miR-144含量,增強Nrf2的轉錄活性,但其是否能上調GPX4和xCT蛋白的表達尚未可知[12]。在本實驗中,Rg1能上調MCAO大鼠皮質腦組織GPX4和xCT蛋白的表達,緩解神經元線粒體形態損傷,并改善MCAO后大鼠神經功能。提示Rg1可能通過促進Nrf2/xCT/GPX4通路抑制MCAO大鼠神經元鐵死亡。

綜上,人參皂苷Rg1可通過促進Nrf2/xCT/GPX4通路抑制缺血性腦卒中神經元鐵死亡(Fig 8)。本課題研究進一步闡明并完善人參皂苷Rg1治療缺血性腦卒中的相關作用機理,為以抑制鐵死亡作為缺血性腦卒中的治療手段以及為Rg1治療缺血性腦卒中的開發應用提供了理論參考和實驗依據。