鉤藤堿治療炎癥性腸炎可行性及機制研究

劉 宇,程路峰,武 洋,李夢佳,阿米爾·澤布,古麗若依·帕爾哈提,陳佳琪,毛旭文

(1. 新疆醫科大學藥學院,2. 新疆天然藥物活性組分與釋藥技術重點實驗室,新疆 烏魯木齊 830017)

隨著炎癥性腸炎(inflammatory bowel disease,IBD)發病率不斷攀升,全球共有680萬例炎癥性腸炎患者,僅我國就有266萬例[1]。IBD屬于以胃腸道為主的慢性全身性炎癥,病變多集中在結腸、直腸黏膜層以及黏膜下層,嚴重時甚至涉及全消化道,嚴重影響身體健康。目前,IBD病因尚不明確,且沒有根治性的治療藥物,這使得IBD成為迫切需要解決的重大問題[2]。傳統治療IBD藥物包括5-氨基水楊酸類、免疫抑制劑及糖皮質激素類等,但多有潛在的免疫排斥反應、不耐受等情況,許多患者的病情得不到有效控制[3]。近年來,JAK、IL-12、IL-13等靶點逐漸被研究者們所關注,臨床研究發現托法替尼(JAK抑制劑)、烏司奴單抗(IL-12和IL-23抑制劑)能夠有效緩解炎癥性腸炎[4-5],一些中藥對IBD的治療優勢也逐漸得到了驗證[6]。隨著IBD治療的個性化以及治療靶點的不斷增加,開發來源于植物、中草藥的天然化合物在IBD治療上具有很大的應用前景。

鉤藤為茜草科鉤藤屬植物,是我國傳統中草藥,可以用于治療高血壓、癲癇、焦慮等疾病[7]。鉤藤的化學成分復雜多樣,主要活性成分生物堿類約70余種,其有效成分鉤藤堿(rhynchophylline,Rhy)具有降低血壓、平喘、抗癌等功效,開發前景可觀[8]。既往研究發現,鉤藤堿能夠抑制炎性介質(如TNF α、IL-1β等)的產生,同時可以通過抑制TLR4/NF-κB/NLRP3途徑發揮抗炎、抗氧化作用[9],但鉤藤堿治療炎癥性腸炎作用及其機制尚待闡明。因此,本研究擬通過網絡藥理學分析方法,結合體內、外實驗進一步探討鉤藤堿治療炎癥性腸炎的可行性及作用機制,以期為后續治療炎癥性腸炎藥物的研發提供思路及參考。

1 材料

1.1 動物60只C57BL/6j,♀♂各半,體質量(20±2) g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司(許可證號:SCXK(京)2016-0006)。于新疆醫科大學實驗動物中心SPF級實驗室進行常規飼養,SPF級實驗動物使用許可證號SYXK(新)2016-0002,光照12 h/d,黑暗12 h/d,溫度(21±2) ℃,濕度40%～45%。本實驗經過新疆醫科大學實驗動物中心倫理委員會批準,倫理批號:IACUC-20211016-39。所有小鼠適應性飼養1周后用于實驗。

1.2 細胞結直腸癌Caco2細胞購自中國醫學科學院腫瘤細胞庫。

1.3 藥品與試劑鉤藤堿,購自上海源葉生物科技有限公司,批號:C22M11S113789;葡聚糖硫酸鈉,上海麥克林生化科技有限公司,批號:C12750877;地塞米松注射液,上海現代哈森(商丘)藥業有限公司,批號:1905190231;小鼠糞便隱血試劑盒,上海酶聯生物科技有限公司,批號:0701A22;腫瘤壞死因子(TNF-α,批號:063016HLP104840701)、白細胞介素-1β(IL-1β,批號:JL20884)、髓過氧化物酶(MPO,批號:063016HLP103670701)、趨化因子配體1(CXCL1,批號:063016HLP201500701)ELISA檢測試劑盒,均購自上海江萊生物科技有限公司;NO試劑盒,北京索萊寶科技有限公司,批號:BC1475;JAK1抗體(批號:BB04078927)、JAK2抗體(批號:BA11156538)均購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.4 主要儀器酶標儀,型號:CoDa,Bio-RaD公司生產;二氧化碳CO2培養箱(美國Thermo Scientific公司);V18R型高速冷凍離心機(瑞士Dynamica公司);Power Pac3000型電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 鉤藤堿治療IBD網絡藥理學分析

2.1.1網絡藥理學數據庫

2.1.2鉤藤堿靶點預測 通過檢索PubChem數據庫獲得鉤藤堿(CAS:76-66-4)3D結構、SMILES號等,并利用SwissTargetPrediction平臺對鉤藤堿進行潛在作用靶點預測。

2.1.3IBD疾病靶點篩選 利用GeneCards、OMIM、CTD及TTD數據庫進行“IBD”疾病靶點檢索,匯總去重后得到疾病相關靶點。通過Draw Veen Diagram在線程序將鉤藤堿和IBD靶基因取交集獲得鉤藤堿-IBD共同靶點,此集合為鉤藤堿治療IBD的可能靶點。

2.1.4藥物-疾病靶點PPI網絡構建及互作分析 為進一步明確靶點間相互作用關系,利用STRING數據庫對2.1.3項獲得的鉤藤堿-IBD共同靶點進行蛋白-蛋白互作分析,導入Cytoscape軟件,運用Network Analyzer及CytoNCA插件進行網絡拓撲分析及可視化分析,將Degree值前10位的靶點作為核心靶點。

2.1.5潛在靶點GO功能富集分析與KEGG通路分析 通過Metascape數據庫對交集靶點進行GO及KEGG富集分析,通過生信平臺進行統計分析及可視化處理。

2.1.6藥物-核心靶點分子對接驗證 選取Cytoscape軟件分析中Degree值前10位作用靶點,從Pubchem數據庫獲得鉤藤堿3D結構,通過Uniprot數據庫在RCSB PDB平臺獲得蛋白受體,輸出pdbqt文件后通過CB-Docks進行分子對接。若配體與受體能自發進行結合,則結合能<0 kcal·mol-1(1 kcal= 4.186 kJ),若結合能<-5 kcal·mol-1表示兩者結合活性較好,若結合能<-7 kcal·mol-1表示結合較強且穩定[10]。

2.2 體內實驗

2.2.1動物分組及給藥 60只C57/BL6j小鼠隨機分成對照組、模型組、陽性藥組及鉤藤堿低、中、高劑量組,每組10只。對照組小鼠每日正常飲食飲水,不做處理。模型組、陽性藥組及鉤藤堿低、中、高劑量組小鼠每日自由飲用2.5% DSS溶液代替飲水,自由進食。鉤藤堿(低、中、高)組分別灌胃鉤藤堿溶液(2、4、8 mg·kg-1),陽性藥組腹腔注射0.4 mg·kg-1地塞米松,每日1次,連續7 d。

Tab 1 Basic information of database

2.2.2疾病活動指數(DAI)評分 實驗期間,每日同一時間記錄各組小鼠體質量變化、大便性狀及糞便隱血情況。根據Tab 2評分標準計算DAI評分。

Tab 2 DAI scoring criteria

2.2.3結腸長度、重量及結腸黏膜損傷(CMDI)評分 給藥結束后,取小鼠結腸段,測量長度,后剖開并清洗腸腔,稱取結腸重量,觀察結腸病變情況并進行結腸黏膜損傷(CMDI)評分,評分標準見Tab 3。

Tab 3 CMDI scoring criteria

2.2.4ELISA法檢測小鼠結腸中TNF-α、IL-1β、CXCL1、MPO水平 取結腸組織加入適量PBS,勻漿,4 ℃,5 000×g,離心10 min,取上清液,根據ELISA試劑盒說明書檢測勻漿中腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)、趨化因子1(CXCL1)、髓過氧化物酶(MPO)含量。

2.2.5腸道通透性檢測 構建DSS誘導的IBD模型后,采用異硫酸熒光素-硫酸葡聚糖(FITC-dextran)示蹤法,取給藥7 d后的各組小鼠,禁食禁水4 h,灌胃給予FITC-dextran,灌胃4 h后,眼眶靜脈叢取血并離心處理。在分光光度計490 nm處檢測血漿中FITC-D含量表示小鼠腸黏膜通透性。

2.3 體外實驗

2.3.1細胞培養 Caco2細胞接種于含1%雙抗、10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養基,置于37 ℃、5% CO2培養箱中,隔天換液,待細胞融合至90%,用0.25%胰酶消化并傳代。

2.3.2CCK-8法檢測細胞活力 CCK-8法檢測不同濃度鉤藤堿溶液處理后對Caco2細胞增殖活性的影響。調整細胞懸液密度為7×107個·L-1,每孔100 μL接種至96孔板孵育24 h,設空白組、對照組、模型組、鉤藤堿組。模型組與鉤藤堿組加入DSS誘導炎癥模型,鉤藤堿組加入不同濃度的鉤藤堿溶液,使鉤藤堿培養液的終濃度分別為0.01、0.1、1、10、100 mg·L-1,各組6個復孔。孵育48 h后,每孔加入10 μL CCK-8溶液,孵育1 h后450 nm測定吸光度。

2.3.3ELISA檢測鉤藤堿對Caco2細胞中TNF-α和IL-6含量 給予鉤藤堿溶液(2.5、5、10 mg·L-1)干預48 h后,收集各組細胞上清液。按照ELISA試劑盒說明書檢測細胞上清液中TNF-α和IL-6的含量。

2.3.4檢測細胞上清液中NO水平 收集鉤藤堿干預后各組細胞上清液,按照試劑盒說明書檢測NO水平。

2.3.5Western blot法檢測細胞相關蛋白表達 為進一步探討鉤藤堿干預后Caco2細胞關鍵蛋白的表達情況,收集鉤藤堿干預后細胞,加適量RIPA裂解液,4 ℃,12 000 r·min-1,離心10 min,提取總蛋白并蛋白定量,取20 μg蛋白,100 ℃煮5 min使蛋白充分變性。每次上樣20 μL,通過SDS-PAGE凝膠電泳,轉膜,封閉,一抗及二抗孵育,曝光顯影,以目的蛋白與β-actin條帶灰度值比值作為目的蛋白相對表達量。

3 結果

3.1 網絡藥理學預測結果

3.1.1鉤藤堿-IBD交集靶點獲取結果 通過數據庫獲得104個鉤藤堿作用靶點及6 684個IBD作用靶點。采用Draw Veen Diagram在線程序繪制韋恩圖,得到70個鉤藤堿-IBD交集靶點(Fig 1)。

Fig 1 Intersection target of rhynchophylline-IBD

3.1.2藥物-疾病靶點PPI網絡分析及關鍵靶點獲取結果 通過STRING數據庫分析鉤藤堿-IBD共同靶點蛋白互作關系及網絡可視化,篩選疾病-藥物共同靶點中的前十位起重要作用的關鍵靶點,包括酪氨酸蛋白激酶2(JAK2)、酪氨酸蛋白激酶1(JAK1)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)等(Fig 2,Tab 4)。

3.1.3GO及KEGG通路富集分析 GO富集發現(Fig 3A),交集靶點主要參與跨膜酪氨酸激酶受體蛋白、炎癥反應、蛋白酪氨酸激酶活性等過程。KEGG富集發現(Fig 3B),交集靶點涉及PI3K-Akt、NF-κB等經典信號通路,以及cAMP、Hippo等新穎信號通路。

Fig 2 PPI diagram of rhynchophylline-IBD intersection target

Tab 4 Information on key targets of rhynchophylline in treatment of IBD

3.1.4分子對接驗證 分子對接結果如Tab 5所示,對交集靶點度值前十的核心靶點對接發現,鉤藤堿及陽性藥地塞米松能夠與選定的10個核心靶點進行自發結合,鉤藤堿與JAK2和JAK1受體蛋白的結合最穩定。利用CB-Docks分析最佳結果對接模式圖(Fig 4)。

Tab 5 Rhynchophylline-IBD target binding energy prediction

Fig 3 GO functional enrichment analysis (A), KEGG pathway analysis (B)

Fig 4 Molecular docking diagram results Cartoon structure is protein; rod structure is drug

3.2 體內實驗

3.2.1鉤藤堿對IBD小鼠體質量及DAI評分的影響 小鼠飲用2.5% DSS溶液后,第3天出現懶動、進食和飲水量減少、體質量下降、腹瀉、血便。與對照組比較,模型組小鼠體質量明顯降低(P<0.01);與模型組比較,鉤藤堿組小鼠體質量下降幅度明顯減小(P<0.01),懶動、進食和飲水量減少、體質量下降、腹瀉、血便情況明顯好轉。模型組小鼠DAI評分逐漸升高(P<0.01),第5～7天出現不同程度的肉眼血便。與模型組比較,經鉤藤堿和地塞米松干預后,小鼠DAI評分顯著降低(P<0.01),見Fig 5,6。

Fig 5 Effect of rhynchophylline on body *P<0.05,**P<0.01 vs control; #P<0.05,##P<0.01 vs model

Fig 6 Effect of rhynchophylline on DAI score in IBD mice n=6)

3.2.2鉤藤堿對IBD小鼠結腸長度、結腸質量及結腸黏膜損傷(CMDI)評分的影響 與對照組比較,模型組小鼠結腸明顯縮短(P<0.01)、結腸重量明顯減輕(P<0.01),CMDI評分明顯上升(P<0.01);與模型組比較,鉤藤堿及陽性藥地塞米松干預后小鼠結腸縮短幅度明顯減小(P<0.01)、結腸重量減輕幅度明顯減小(P<0.05)、CMDI評分明顯下降(P<0.05),見Fig 7。

3.2.3鉤藤堿對小鼠結腸勻漿中炎癥因子水平的影響 模型組小鼠結腸勻漿中TNF-α、IL-1β、CXCL1、MPO濃度明顯高于對照組(P<0.01),鉤藤堿和地塞米松干預后,TNF-α、IL-1β、CXCL1、MPO濃度明顯下降(P<0.01),且含量與鉤藤堿給藥濃度成負相關(Fig 8)。

3.2.4鉤藤堿對腸通透性的影響 與對照組比較,模型組小鼠血清中FITC-Dex濃度明顯增高(P<0.01);與模型組比較,鉤藤堿及陽性藥組地塞米松組小鼠血清中FITC-Dex濃度明顯降低(P<0.05),見Fig 9。

3.3 體外實驗

3.3.1鉤藤堿對Caco2細胞增殖活性的影響 使用不同濃度鉤藤堿進行干預后,與正常組相比,模型組細胞的增殖活性明顯降低(P<0.01);與模型組相比,鉤藤堿濃度在0.01～100 mg·L-1對Caco2細胞有促進增殖作用(P<0.05),其中5 mg·L-1的鉤藤堿溶液對Caco2細胞增殖作用影響最明顯(P<0.01),見Fig 10。

3.3.2鉤藤堿對Caco2細胞中TNF-α和IL-6含量的影響 與正常組比較,模型組TNF-α和IL-6水平顯著上升(P<0.01);與模型組比較,各給藥組TNF-α和IL-6水平明顯著下降,且呈劑量依賴性(P<0.05),優于陽性藥地塞米松組,見Fig 11。

3.3.3鉤藤堿對Caco2細胞上清液中NO水平的影響 與正常組比較,模型組NO水平明顯上升(P<0.01);與模型組比較,鉤藤堿及地塞米松干預后NO水平明顯下降(P<0.01),見Fig 12。

Fig 8 Effect of rhynchophylline on TNF-α, IL-1β, CXCL1 and MPO in colonic homogenate of IBD mice n=6)

Fig 9 Effect of rhynchophylline on serum FITC-Dex concentration in IBD mice n=6)

Fig 10 Effect of rhynchophylline on proliferation of Caco2 cells n=6)

Fig 11 Effect of rhynchophylline on TNF-α and IL-6 content in Caco2 cells n=3)

3.3.4鉤藤堿對Caco2細胞中JAK2、JAK1蛋白表達水平的影響 Western blot結果表明,模型組JAK2和JAK1蛋白表達較對照組顯著升高(P<0.01);與模型組比較,鉤藤堿組JAK2和JAK1蛋白表達較模型組明顯降低且呈劑量依賴性(P<0.01),見Fig 13。

Fig 12 Effect of rhynchophylline on NO level in supernatant of Caco2 cells n=3)

4 討論

IBD作為一類病因不明且病程反復的疾病,一直是當前醫學面臨的一道難關,盡管已有的常規治療藥物能夠使IBD的疾病過程得到改善,但由于全身給藥或藥物在體內重新分布而產生嚴重副作用的可能性很高。因此,尋找治療IBD靶向性強、有效性高的藥物是需要突破的關鍵。

已有研究發現,阻斷Janus激酶(JAK)能夠有效抑制黏膜免疫細胞中多種促炎細胞因子的信號轉導,JAK是一個酪氨酸激酶的家族,該家族包括JAK1、JAK2、JAK3和TYK2四個亞型,與自身免疫性疾病、移植排斥反應密切相關[11]。JAK參與許多必需的細胞因子信號傳導,在細胞因子信號傳遞中扮演著重要角色。JAK2的異常激活能夠刺激細胞因子的運輸進而促進IBD的發生發展[12]。已有研究發現[13],在IBD大鼠腸黏膜中p-JAK2含量會顯著增加,可誘導相關炎癥因子(如IL-6等)的釋放。JAK1是免疫反應細胞信號傳導的另一類關鍵促炎因子,在IBD小鼠中JAK1和相關促炎因子表達會顯著上調[14]。也就是說,JAK抑制劑成為了一種新的有希望治療炎癥性腸病的藥物。如托法替尼(非選擇性JAK抑制劑)、非戈替尼(JAK1選擇性小分子抑制劑)已被批準用于IBD的治療,能夠明顯消退IBD癥狀,且激酶抑制劑屬于口服小分子藥物,使得其在IBD治療上備受關注[15]。而JAK抑制劑治療IBD目前仍處于初始階段,相關研究較少,來源于植物、食物、中草藥的具有毒副作用少,療效確切等獨特優勢的天然化合物有望成為治療IBD的替代選擇。

隨著國內外對鉤藤藥理學研究的不斷深入,確定了鉤藤堿是其發揮藥理作用的重要物質基礎,具有降壓、抗驚厥、抗炎等藥理作用,但關于鉤藤堿治療炎癥性腸炎作用及其機制尚待闡明。本研究通過對鉤藤堿治療IBD進行網絡藥理學分析并結合體內、外實驗進行可行性及機制探索。網絡藥理學分析獲得鉤藤堿與IBD交集靶點共70個,功能學分析發現,交集靶點可參與跨膜酪氨酸激酶受體蛋白、炎癥反應、蛋白酪氨酸激酶活性等過程。分子對接發現JAK2和JAK1受體蛋白與鉤藤堿結合最穩定,提示鉤藤堿可能通過調控JAK2和JAK1靶點進而抑制IBD的發展。體內實驗結果顯示,鉤藤堿可明顯減小IBD小鼠體重下降幅度,升高IBD小鼠結腸長度及重量,降低DAI評分,抑制結腸組織中TNF-α、IL-1β、CXCL1、MPO炎癥因子產生,同時降低小鼠腸道通透性,改善小鼠結腸炎癥狀,表明鉤藤堿具有治療炎癥性腸炎的潛力。體外實驗結果顯示,0.01～100 mg·L-1鉤藤堿溶液能夠促進Caco2細胞增殖,其中5 mg·L-1的鉤藤堿溶液對Caco2細胞增殖作用影響最明顯。此外,鉤藤堿能夠顯著降低細胞上清液中TNF-α、IL-6水平,且含量與鉤藤堿給藥濃度成負相關,表明鉤藤堿能夠顯著改善DSS誘導的細胞炎癥損傷。而NO能使細胞間的緊密連接松弛進而導致腸黏膜的通透性增高,并直接作用于腸黏膜而損傷腸黏膜上皮[16]。本研究對Caco2細胞上清液NO水平進行測定發現,鉤藤堿能夠顯著降低Caco2細胞NO的釋放量,表明鉤藤堿能夠降低腸粘膜通透性,減輕腸黏膜上皮損傷。Western blot實驗發現,模型組JAK2和JAK1蛋白表達較對照組顯著升高,鉤藤堿干預后JAK2和JAK1蛋白表達較模型組顯著降低且呈劑量依賴性,符合網絡藥理學預測結果,因此推測鉤藤堿可能通過抑制JAK2和JAK1蛋白表達,減輕機體炎癥反應,從而發揮治療IBD的作用。

Fig 13 Effect of rhynchophylline on JAK2 and JAK1 protein expression in Caco2 cells n=3)

既往研究發現,PI3K/AKT是重要的細胞信號轉導通路,參與調節機體炎癥反應和趨化等多種生理學過程,該通路的活化是IBD發病的重要特征之一[17]。JAK信號能夠激PI3K/AKT信號通路,抑制免疫炎癥反應[18]。本研究通過GO及KEGG分析發現,鉤藤堿-IBD交集靶點與跨膜酪氨酸激酶受體蛋白生物過程、PI3K/AKT信號通路相關,推測鉤藤堿可能通過調控JAK信號進而激活PI3K/AKT信號通路,減輕機體炎癥反應,發揮治療IBD的作用。

綜上所述,本研究采用數據挖掘結合體內、外實驗驗證的方法,從網絡靶標的方向探索了鉤藤堿用于治療炎癥性腸炎的可行性及作用機制,體內、外實驗進一步證實鉤藤堿可能通過靶向抑制JAK2和JAK1從而減輕機體炎癥反應,發揮治療IBD的作用。鉤藤堿有望成為JAK抑制劑,治療炎癥性腸炎。