檳榔多酚對大鼠高原運動性疲勞的保護作用和網絡藥理學研究

孫月梅,韓星宇,馬江紅,程俊飛,王 榮,李文斌

(聯勤保障部隊第九四〇醫院藥劑科甘肅省高原藥學行業技術中心, 甘肅 蘭州 730050)

在高海拔環境下,人體沒有充足的氧氣供應會產生大量的自由基,自由基清除與產生二者之間的平衡狀態被打破,這種失衡導致的人體能量代謝紊亂、組織損傷,從而對機體正常的生理活動造成嚴重的影響[1-2]。其中,運動能力的下降是對身體最直接的影響,嚴重影響急進高原人群的身心健康和生活質量[3-5]。運動性疲勞嚴重影響高原人群的生活和工作[6]。目前高原運動性疲勞的發生機制尚不明確。但有研究發現,低氧導致的肺血管收縮、交感神經興奮使得肺動脈壓升高,進而增加心臟后負荷,引起心功能衰竭,從而降低了急進高原個體的有氧運動能力[7-8]。除此之外,高原環境一定程度上使得運送至機體各部位的氧氣相對減少,無氧呼吸增加,乳酸堆積等都可引起疲勞的發生[9]。

檳榔中有多種活性組分,主要活性成分為檳榔多酚和檳榔堿[10]。結合高原運動性疲勞的產生機制之一是氧自由基的失衡,本實驗通過檳榔多酚干預高原運動性疲勞大鼠模型,測定肺組織病理學變化及相關氧化應激、能量代謝生化指標,初步闡明檳榔多酚對高原運動性疲勞大鼠的保護作用,并利用網絡藥理學方法初步探究其作用機制,旨在為制備安全、有效的抗高原運動性疲勞的藥物奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 動物實驗

1.1.1實驗試劑 0.9%氯化鈉注射液,浙江國境藥業有限公司;肝素鈉注射液,南京新百藥業有限公司;甲醛溶液,山東淄博鑫榮化工科技有限公司;丙二醛(MDA)試劑盒,超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒,谷胱甘肽(GSH)試劑盒,均購于南京建成生物研究所;BCA試劑盒,北京索萊寶科技有限公司;檳榔多酚由本課題組使用檳榔飲片自行制備,其中,檳榔多酚的含量為45.03%。

1.1.2實驗儀器 SpectraMax i3型全自動熒光酶標儀,美國Molecular公司;AE-240電子分析天平(雙量),上海梅特勒-托利多;Tissuelyser-24多樣品組織研磨機,上海凈信實業發展有限公司;XH-C型漩渦混勻器,美國Sigma公司;MDF-U2086S超低溫冰箱,日本SANYO公司;力竭運動跑臺,安徽正華生物儀器設備有限公司。

1.1.3檳榔多酚的制備 采用溶劑提取法對檳榔多酚進行提取,最佳提取工藝為:用80%乙醇溶液,料液比在 1 ∶30(kg·L-1)的條件下,65 ℃提取2 h,多酚的提取率為 33.25%。再采用AB-8型大孔樹脂對對檳榔多酚進行純化。AB-8 型大孔樹脂純化檳榔酚類的適宜條件為:上樣濃度為 40 g·L-1,樹脂吸附達到飽和后,用95%乙醇溶液作為洗脫液,檳榔多酚提取率提高至45.03%。

1.1.4建立大鼠運動性疲勞模型 末次灌胃1 h后,進行跑臺力竭實驗。跑步機傾斜度數30°,跑步機的速度設定為25 m·min-1,加速度為1 m·s-1,然后大鼠運動至力竭,記錄每只大鼠的運動時間和運動距離。比較各組小鼠的運動能力。力竭判定標準:大鼠跑臺姿式由蹬地式變為伏地式,滯留于跑道末端,而且電不能使大鼠繼續維持跑動的狀態。跑臺力竭參數為599次/300 s。

1.1.5動物分組及干預 40只SPF級健康雄性Wistar大鼠,體質量約為200 g,由遼寧長生生物技術股份有限公司提供,動物許可證號:SCK(遼)2020-0001,于聯勤保障部隊第九四〇醫院實驗動物科(溫度:20-26 ℃,濕度:40%～70%)適應性飼養7 d后開始實驗,期間,大鼠均以標準飼料喂養,純凈水自由飲用。然后將大鼠隨機分為對照組、高原運動性疲勞模型組、高原運動給藥低、中、高(400、800、1 200 mg·kg-1檳榔多酚)3組,共5組,每組8只。后3組置于蘭州實驗室給藥3 d后,模型組和給藥組共4組運至青海玉樹海拔4 010 m高原實地實驗室訓練。采用高原環境聯合跑臺運動建立動物模型。實驗方案通過聯勤保障部隊第九四〇醫院倫理委員會批準,審批編號:2020KYLL112。

1.1.6組織取材 水合氯醛麻醉后,取腦組織和心肌組織,用0.9%生理鹽水(提前預冷)洗凈,濾紙擦干,稱取0.10 g～0.15 g組織,按1 ∶9比例加入提前預冷的生理鹽水,使用研磨儀制備勻漿,然后低溫離心機10 000 r·min-1,離心5 min,取上清液,按照試劑盒說明測定相關指標。

1.1.7肺組織病理切片的制備 摘取大鼠肺組織,用0.9%生理鹽水(提前預冷)洗凈血液后,用多聚甲醛固定液完全固定,組織固定好后切片,進行HE染色觀察。

1.2 網絡藥理學研究

1.2.1檳榔多酚活性成分及相關靶點的篩選 本研究以“檳榔”為關鍵詞,在TCMSP平臺(https://tcmsp-e.com/tcmsp.php)進行檢索,口服生物利用度OB≥30%和類藥性DL≥0.18%進行活性成分篩選。利用PharmMapper數據庫進行活性成分的靶點預測,UniProt數據庫進行靶點基因注釋。

1.2.2高原運動性疲勞靶點檢索及篩選 以“high altitude exercise fatigue”和“hypoxic exercise fatigue”為關鍵詞在Genecards ( https://www.genecards.org/) 數據庫檢索去重獲取高原運動性疲勞相關靶點,共得到靶點1 798個。

1.2.3檳榔多酚活性成分與高原運動性疲勞共同靶點 將檳榔多酚活性成分的靶點和高原運動性疲勞的靶點上傳至VENNY 2.1平臺制作韋恩圖(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/),得到交集靶點共79個,即為檳榔多酚對高原運動性疲勞保護作用的潛在靶點。

1.2.4蛋白相互作用網絡圖(PPI)的構建與分析 獲取檳榔多酚與高原運動性疲勞的交集靶點上傳至STRING11.5 數據庫 (https://cn.string-db.org/),物種為智人(Homo sapiens),置信區間為 0.9,下載蛋白互作TSV格式信息,并導入Cytoscape3.7.2 軟件進行拓撲分析,篩選關鍵靶點。

1.2.5富集分析 檳榔多酚與高原運動性疲勞的交集靶點上傳至DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp),限定物種為智人(Homo sapiens),P值小于0.05,進行GO分析和KEGG 通路富集分析,并利用微生信平臺(http://www.bioinformatics.com.cn/)制作柱狀圖和氣泡圖。

1.2.6“成分-靶點-途徑”的網絡構建 根據以上篩選得到活性成分、交集靶點、富集通路,利用 Cytoscape3.7.2 軟件進行網絡圖構建,表達網絡圖中的相互作用關系。

2 結果

2.1 動物實驗

2.1.1肺組織HE染色結果 大鼠肺組織的HE染色病理切片結果如Fig 1所示,可見對照組大鼠肺組織結構正常,肺泡結構完整規則,呈現空泡狀薄壁結構,無明顯病變。與對照組相比,高原運動組大鼠的肺泡壁出現增厚,肺泡腔明顯縮小,同時肺泡塌陷,間隔較對照組增寬,肺泡部分擴張,并且有炎細胞浸潤。檳榔多酚中劑量組、高劑量組可以觀察到肺泡結構更加完整,肺泡壁較高原運動組明顯變薄,同時炎細胞浸潤減少。以上結果表明,檳榔多酚可減輕高原持續運動引發的肺部組織病變,對高原運動大鼠的肺部組織有保護作用。

Fig 1 The pathological Results of rat lung tissue (HE staining, 20×)

2.1.2機體氧化應激水平檢測結果 本實驗采用TBA法測定丙二醛(MDA)水平。根據Tab 1可知,與對照組相比,在心肌組織中,高原運動組MDA含量明顯升高101.45%(P<0.05);與模型組相比,高原運動給藥高劑量組MDA含量明顯降低了53.96%(P<0.01)。在腦組織中(Tab 2),與對照組相比,高原運動組MDA升高了11.06%;與高原運動組相比,高原運動給藥高劑量組MDA含量明顯降低了20.33%(P<0.01)。結果表明,檳榔多酚高劑量組可以降低心肌組織和腦組織MDA水平,緩解脂質過氧化的水平。

與對照組相比,高原運動組心肌組織SOD活力明顯降低13.48%(P<0.05),腦組織中SOD活力降低,但差異無統計學意義。在心肌組織中,與高原運動組相比,高原運動給藥中高劑量組SOD含量明顯升高了17.00%、28.72%,并呈現出劑量依賴性。在腦組織中,與高原運動組相比,高原運動給藥低中高劑量組SOD活力有所增加。結果提示,檳榔多酚可以提高高原運動疲勞大鼠心肌組織和腦組織的SOD活力。

與對照組相比,高原運動組心肌組織、腦組織中GSH含量降低。在心肌組織中,與高原運動組相比,高原運動給藥中劑量組GSH含量明顯升高了17.86%(P<0.01)。在腦組織中,與高原運動組相比,高原運動給藥低中高劑量組GSH含量升高,但差異無顯著性。結果提示,檳榔多酚中劑量組可以明顯提升高原運動疲勞大鼠心肌組織的GSH含量,防止氧化損傷。

2.2 網絡藥理學研究

2.2.1檳榔多酚活性成分 TCMSP數據庫檢索到檳榔的52個成分,按OB≥30%,DL≥0.18%篩選得到高活性成分8種,其中,檳榔多酚活性成分3個,見Tab 3,結合TCMSP平臺和PharmMapper數據庫預測靶標去重共得到131個靶點。

Tab 1 Results of oxidative stress index in each group

Tab 2 Results of oxidative stress index in each group of brain tissue

Tab 3 Active ingredients of betelnut polyphenols

2.2.2檳榔多酚活性成分和高原運動性疲勞交集靶點PPI網絡構建 Genecards數據庫檢索高原運動性疲勞的靶點1 798個,利用VENNY 2.1在線平臺,選檳榔多酚的靶點和高原運動性疲勞的靶點取交集,得到檳榔多酚對高原運動性疲勞保護作用的靶點79個,見Fig 2。在String11.5數據庫導入交集靶點分析,Cytoscape3.7.2進行PPI 互作圖美化,如Fig 3所示。PPI網絡中無游離蛋白,79個節點相互作用產生了120個蛋白互作邊,平均度值為3.04,其中,大于平均度值的靶點有 24 個,在PPI網絡圖中節點越大、顏色越深,對應的度值越大;連線越粗、顏色越深,兩者之間聯系越緊密。

Fig 2 Venn diagram of common targets of betelnutpolyphenols and high altitude exercise fatigue

2.2.3GO功能和KEGG通路富集分析 利用 DAVID 數據庫對檳榔多酚發揮高原運動性疲勞保護作用的79個靶點進行 GO 富集分析(P<0.05),獲得生物過程(BP)、細胞組分(CC)、分子功能(MF)分別為 215、37、69 條,利用微生信工具對Count 值前10位作圖,見Fig 4。 由圖可得,BP主要富集在凋亡過程的負調控、蛋白質磷酸化、轉錄的正調控等;CC主要富集在胞質溶膠、細胞質、胞外區;MF主要富集在蛋白質結合、酶結合、絲氨酸/蘇氨酸激酶活性等。利用 DAVID 數據庫對交集靶點進行KEGG富集分析(P<0.05),得到105條信號通路,利用微生信工具對Count 值前30位進行作圖,結果見Fig 5,可知主要PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、IL-17 信號通路、松弛素信號通路等有關。

Fig 3 Diagram of protein interaction network

Fig 4 GO function enrichment analysis

Fig 5 KEGG signaling pathway enrichment analysis (top 30)

Fig 6 Active ingredient-target-pathway network

2.2.4活性成分-靶點-通路網絡 將檳榔多酚的活性成分,檳榔多酚與高原運動性疲勞的交集靶點和KEGG富集的通路構建活性成分-靶點-通路網絡(Fig 6)。左側部分表示檳榔多酚的3個活性成分,中間矩形部分表示交集靶點,右側圓形表示富集通路,由圖可推測,檳榔多酚的活性成分可能通過作用于MAPK、EGFR、KDR等不同靶點從而調控PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、IL-17信號通路、松弛素信號通路等,進而影響細胞增殖與凋亡、MAPK級聯反應、炎癥反應等。

3 討論

高原環境會制約機體的運動能力,更容易發生運動性疲勞。高原運動性疲勞的研究對于高原工作、旅行、居住人群具有重大的意義,同時具有重要的國防意義。課題組前期研究發現,檳榔多酚具有清除自由基,抗氧化的作用,尚且無明顯毒副作用[11]。本實驗在高原實地建立了大鼠運動性疲勞模型,通過觀察大鼠肺組織病理變化,生化法測定氧化應激指標MDA、GSH、SOD的水平評價抗疲勞活性,實驗表明檳榔多酚對大鼠高原運動性疲勞具有保護作用。

經前期文獻調研發現,運動是高原肺水腫誘因之一[12],因此我們采用肺組織病理切片考察衡量高原運動性疲勞的情況。肺組織病理切片可以看出檳榔多酚可以保護炎癥細胞浸潤,減輕高原運動性疲勞引起的肺組織損傷。高原低氧環境導致氧自由基大量產生,引起脂質過氧化產生醛基、羧基、羰基等[13]。因此,檢測MDA的量可以反映機體內脂質過氧化的程度。高原運動狀態下,在心肌組織中,MDA含量明顯上升,當給予檳榔多酚高劑量后,可以明顯降低心肌組織中的MDA水平;在腦組織中,隨著檳榔多酚劑量的增加,表現為高劑量組效果最為明顯。SOD對維持機體抗氧化與氧化平衡有著重要的作用,保護細胞免受損傷[14]。檳榔多酚中高劑量組可有效提升心肌組織中高原運動大鼠SOD活力。GSH是一種低分子清除劑,可以穩定血紅蛋白及其他輔因子防止氧化損傷[15]。實驗結果表明,檳榔多酚中劑量可以增加心肌組織中GSH含量。綜合機體氧化應激水平SOD、MDA、GSH檢測結果可以看出檳榔多酚對心肌組織較腦組織作用更加明顯。經查閱相關文獻分析產生這種情況可能由于檳榔多酚脂溶性較差,不易通過血腦屏障[16]。

從網絡藥理學角度,檳榔多酚對大鼠高原運動性疲勞的保護機制是通過多靶點多通路發揮療效。我們對關鍵靶點通過富集分析發現可能與PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、IL-17 信號通路、松弛素信號通路等有關。其中,PI3K-Akt信號通路主要與調節細胞增殖、分化、凋亡相關,通過促進成骨細胞增殖、分化和形成。當細胞外傳達的信號刺激細胞后,細胞內的 PI3K 磷脂酰肌醇環上的 3 位羥基磷酸化生成 3 磷酸磷脂酰肌醇(PI3P),使 AKT 上的 Thr308 和 Ser473 位點磷酸化激活[17]。

本研究發現檳榔多酚對大鼠高原運動性疲勞具有保護作用,并應用網絡藥理學的方法對其機制進行了初步探究,但由于其存在一些局限性,有待后續對網絡藥理學推測的機制進一步驗證。