外泌體裝載蛇床子素的方法探究

李明莉,胡冬生,楊秀竹,王西墨,鮑會靜

(天津醫科大學南開醫院精準醫學實驗室,天津 300100)

卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤之一,主要的治療手段是手術聯合化療,一線化療藥物是紫杉醇聯合卡鉑,但目前越來越多的患者出現卡鉑耐藥,且化療藥物的無差別損傷,使胃腸道反應、腎臟損害、過敏反應等不良反應[1 - 2]嚴重影響了患者的生存質量,常常導致患者預后不良。蛇床子素是中藥蛇床子的主要活性成分,現代醫學研究發現其具有抗腫瘤的作用,可明顯抑制卵巢癌細胞的增殖,并可通過多種途徑逆轉腫瘤多藥耐藥[3],故可作為治療卵巢癌的藥物補充。但由于其生物利用度低、溶解度低[4]等特點,限制了其臨床應用。外泌體是直徑100 nm左右具有脂質雙分子層膜結構的細胞囊泡,參與機體生理病理過程,作為細胞間通訊參與細胞間信號轉導,可在各種體液如汗液、淚液、乳汁中分離得到[5]。外泌體不僅可以增加藥物的生物利用度和溶解度,也可以增加藥物在腫瘤部位的濃度,還因其低免疫原性和良好的生物相容性作為藥物載體備受關注[6]。因此,本研究擬探索外泌體裝載蛇床子素的載藥方法,為蛇床子素在卵巢癌治療中的應用提供方法支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株和培養 293T細胞來自天津中西醫結合急腹癥研究所實驗室,SKOV3細胞購自ATCC。293T細胞用含10% 胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM培養基,SKOV3細胞用含10% 胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI 1640培養基,在5% CO2、37 ℃細胞培養箱中培養,0.25%胰酶消化傳代。

1.1.2主要儀器 透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)(日本日立,HT7700);納米顆粒跟蹤分析儀(nanoparticle tracking analysis,NTA)(英國Malvern,Nanosight300);CO2培養箱(日本三洋電機株式會社,MCO-15AC);臺式低溫離心機(日本Kubota公司,K21126-F000);恒溫振蕩水槽(上海精宏實驗設備有限公司,DKZ-2);高效液相色譜儀(美國安捷倫LC1100);高效液相色譜柱(北京迪馬歐泰科技發展中心,Diamonsil 5 μm C8,150 × 4.6 mm,XDB-C8);酶標儀(上海科華生物工程股份有限公司,Khb ST-360);流式細胞儀(美國安捷倫NovoCyte D2060R)。

1.1.3主要試劑 蛇床子素(上海阿拉丁,O101699);外泌體提取試劑(美國InvitroGen,4478359);CD63分離/檢測試劑(美國InvitroGen,10606D);PE-anti-CD9 antibody(美國Abcam,ab82394);DMEM培養基(美國Gibco,C11995500BT);RPMI 1640培養基(美國Gibco,C11875500BT);胎牛血清(上海Vivacell,C04001050);青霉素-鏈霉素雙抗(北京Solarbio,P1400-100);0.25% Tripisin-EDTA(1 ×)(北京Solarbio,T1320-100);DMSO(北京Solarbio,D8371);RIPA裂解液(天津中實基因科技,ZS-PR21001S);乙腈(上海吉至生化,A27981);BCA(北京天根生化科技,PA115-01);Slide-A-LyzerTMDialysis Cassette(美國Thermo Fisher,66380);PBS緩沖液(北京Biosharp,BL302A)。

1.2 方法

1.2.1蛇床子素對SKOV3的增殖作用 培養SKOV3細胞,待其在細胞培養瓶中生長至80%～90%時進行鋪板,96孔板,每孔5 000個細胞;次日取出細胞培養板,加入藥物,分為PBS、DMSO、蛇床子素組(80 μmol·L-1),每組重復6孔;培養48 h后取出細胞培養板,向每孔加入10 μL CCK溶液,然后放回細胞培養箱,繼續培養2 h;取出細胞培養板,用酶標儀檢測在450 nm處的吸光度。

1.2.2外泌體的提取 293T細胞常規培養,待細胞密度生長至80%～90%時,換為DMEM培養3天[7],然后收集上層培養基,根據試劑盒說明書提取外泌體,即先在4 ℃下,以2 000×g轉速離心去掉細胞碎片,收集上清,加入1/2體積的提取試劑,充分混勻后,4 ℃孵育過夜,再進行離心(10 000×g,4 ℃,1 h),棄去上清,用100 μL PBS重懸外泌體,用BCA測定其濃度。

1.2.3外泌體的鑒定 取30 μL外泌體溶液,用TEM觀察外泌體的形態。將外泌體稀釋到1 mL,用NTA測定其粒徑。

1.2.4蛇床子素外泌體制備 稱取10 mg蛇床子素溶解于255.8 μL DMSO溶液中配成濃度為160 mmol·L-1的儲存液,取30 μL(1 172.6 μg)蛇床子素與100 μL(45.9 μg)外泌體混勻,在37 ℃的水浴鍋中輕晃避光孵育2 h或4 h,孵育結束后將混懸液用注射器小心注入透析卡中,用浮漂固定,懸浮于2 L PBS溶液中,然后置于4 ℃冰箱中透析過夜,以去除游離的蛇床子素,次日取出,放入4 ℃冰箱待用。

1.2.5載藥效率測定

1.2.5.1 標準品制備 將蛇床子素(160 mmol·L-1)用PBS稀釋至0.004、0.008、0.016、0.031、0.063 g·L-1。

1.2.5.2 樣品準備 將提取的蛇床子素外泌體(osthole-Exo)離心(7 000 r·min-1,4 ℃,5 min),收集上清,分組為2OST-Exo、2OST-Exo-RIPA、4OST-Exo、4OST-Exo-RIPA,其中帶有RIPA的組處理:加入等體積的RIPA裂解液,在冰上靜置30 min后離心(13 000 r·min-1,4 ℃,5 min),取上清。

1.2.5.3 色譜條件 C8色譜柱,乙腈 ∶水=70% ∶30%,30 ℃柱溫,在303 nm處檢測,進樣量10 μL,停止時間10 min。

1.2.5.4 根據峰面積及標準曲線線性關系計算載藥量,按文獻計算載藥效率[4]:

注:W1表示外泌體裝載的藥物質量,W2表示載藥時加入的藥物質量。

1.2.6流式細胞術測定外泌體 蛇床子素外泌體與CD63磁珠孵育過夜,再與PE-CD9抗體孵育1 h,用PBS清洗后,上流式細胞儀分析。

2 結果

2.1 蛇床子素對SKOV3細胞的增殖作用現代治療卵巢癌的化療藥物存在較多不良反應,且多發生耐藥,而中藥在減毒增效方面具有顯著優勢[8],擬選某中藥治療卵巢癌。查閱相關文獻[9],確定中藥單體蛇床子素能夠抑制SKOV3細胞的生長,為了驗證這一結果,進行了CCK-8實驗,即用80 μmol·L-1蛇床子素處理SKOV3細胞,發現蛇床子素能明顯的抑制SKOV3細胞的增殖,見Fig 1。

Fig 1 Proliferation of SKOV3 cells

2.2 外泌體的鑒定如Fig 2、Tab 1所示,外泌體直徑100 nm左右,呈典型的杯狀,可見膜型結構。NTA結果分析顯示納米顆粒粒徑主要集中在104 nm,粒徑為0～200 nm的占比為81%,平均粒徑(158.4±77.9) nm,有的粒徑稍大,可能是顆粒之間的黏附黏連造成的。以上結果表明從293T細胞上清所提取的顆粒是外泌體。

Fig 2 Morphological observation of exosomes and size distribution analysis

Tab 1 Particle size distribution statistics of exosomes

2.3 載藥效率測定

Fig 3 Chromatographic peaks of osthole at different concentrations

Tab 2 Chromatographic peak areas of osthole at different concentrations

2.3.2確定載藥條件 外泌體與蛇床子素共孵育2 h或4 h,經高效液相色譜儀測得峰面積分別為68.50和16.23,計算出載藥效率分別為0.76%和0.12%,2 h的載藥效率明顯高于4 h,故選擇共孵育2 h作為載藥條件,見Fig 4、Tab 3。

Tab 3 Drug loading efficiency at different times

2.3.3外泌體裝載蛇床子素的途徑 對蛇床子素外泌體(osthole-Exo)進行流式分析,CD9是外泌體的表面標志蛋白,osthole-Exo中CD9陽性表達,即所提取的osthole-Exo中存在外泌體,見Fig 5A。將osthole-Exo用裂解劑RIPA裂解后,進行HPLC分析,可以發現裂解后的蛇床子素量分別從8.85 μg、1.43 μg增加到21.60 μg和7.80 μg,見Fig 5B、Tab 4。

3 討論

卵巢癌是女性常見的惡性腫瘤之一,手術聯合化療是目前的主要治療手段,但化療藥物的不良反應使患者的生存質量降低。中藥作為傳統醫藥,有著減輕不良反應、逆轉耐藥等優勢,蛇床子素是中藥蛇床子的有效成分,現代醫學研究其具有抑制卵巢癌細胞增殖的作用[10],因此蛇床子素可能成為治療卵巢癌的新策略。但蛇床子素的口服生物利用度和溶解度低[4],限制了它的應用,外泌體裝載藥物能提高藥物的溶解度和口服生物利用度[6],所以本研究利用外泌體運輸蛇床子素,使蛇床子素能夠充分發揮抑制腫瘤的作用。

Tab 4 Osthole loading mass after exosome lysis

HEK293T(293T)細胞系是HEK293的衍生細胞株,表達SV40大T抗原,能夠表達高滴度的病毒基因載體,常用于逆轉錄病毒載體的生產[11]。研究報道,由293T產生的細胞外囊泡誘導的免疫反應和毒性,給C57BL/6小鼠靜脈注射和腹腔注射細胞外囊泡3周,采集血液以評估血液學、血液化學和免疫標志物,收集組織進行尸檢和組織病理學檢查,沒有觀察到毒性的跡象,即293T來源的細胞外囊泡具有免疫惰性,不會在體內引發炎癥反應[12],所以我們選擇293T細胞來源的外泌體。

目前的載藥方式分為分泌前載藥和分泌后載藥。分泌前載藥主要由基因編輯和藥物與產外泌體細胞共孵育后收集藥物外泌體,分泌后載藥應用較多是共孵育、超聲和電穿孔,其他分泌后載藥應用較少地是擠壓、凍融循環和皂素滲透等[13]。分泌前的共孵育載藥效率不易控制,且藥物對細胞的影響未知,細胞的正常生理功能可能遭到破外,外泌體的正常分泌是否受到影響尚不明確。

超聲的載藥效率較高,可持續釋放藥物,但這種方法可能導致外泌體聚集,影響外泌體的免疫活性,另外還可能會破壞外泌體的質膜結構,造成藥物漏出,導致載藥量不理想[14]。電穿孔是利用電場的電脈沖對外泌體進行作用,在短的高壓脈沖下可以導致膜擊穿,會產生暫時的孔隙,藥物分子會借此孔流入到外泌體中。但外泌體的濃度影響電穿孔的效率,發現外泌體濃度最低在0.25 g·L-1,最高在1 g·L-1時,電穿孔的載藥效率最高,而這種方法也存在許多缺點,比如加載速率低、膜結構完整性破壞、外泌體活性受到影響等,進而限制了它的應用[15]。共孵育是最直接且簡單的裝載方法,通過藥物與外泌體膜脂質層相互作用得以裝載,效率取決于藥物的疏水性[16],因其具備保持外泌體結構完整性的優點而被廣泛應用。有研究用RAW264.7細胞分泌的外泌體與抗生素在37 ℃下共孵育,構建了抗生素外泌體,提供了一種有效、經濟、安全的替代方案[17],所以本研究選擇共孵育的方式進行載藥。

Fig 4 Drug-loaded and dialysate chromatographic peaks of exosomes at 2 or 4 h (n=3)

Fig 5 Pathway of osthole loading by exosomes

外泌體的載藥效率和外泌體與藥物的比例有一定相關性。據報道[18],隨著外泌體與藥物比例的增加,載藥效率會逐步升高,但升高到一定程度后,載藥效率并不會繼續上升反而下降。同我們的前期研究一致,20 μg阿霉素與不同質量(0、50、100、200、400、800、1 600 μg)的外泌體在37 ℃共孵育2 h,發現在400 μg時的載藥效率最高。本研究缺乏蛇床子素與外泌體的比例變化對載藥效率的影響,將在后續實驗過程中繼續探索。

外泌體與蛇床子素共孵育后,經HPLC測量發現存在蛇床子素,且經流式分析觀察到外泌體標志蛋白CD9陽性表達,說明存在外泌體,即獲得的樣品確定是osthole-Exo。另外,經RIPA裂解后,蛇床子素的裝載量有了明顯增加,說明外泌體運輸蛇床子素不僅通過黏附的方式,還有部分蛇床子素通過直接進入外泌體膜內的方式完成運載。

綜上所述,本研究成功提取了外泌體,構建了osthole-Exo的載藥體系,為蛇床子素的應用提供了研究基礎。