蘋果酸對結腸癌細胞增殖的抑制作用及機制

趙慧芳,李琳琳,關振霆,譚俊珍,張 帥

(天津中藥大學中西醫結合學院,天津 301617)

結直腸癌(colorectal cancer, CRC)是當今最常見的惡性腫瘤之一,在我國其發病率僅次于肺癌及胃癌,位列惡性腫瘤第3位。目前CRC的治療強調以手術為主,輔以放療、化療、靶向治療、免疫治療等手段。“藥食同源”中藥既是食品又是藥品,具有飽腹之功、療病之效[1],對降低CRC的發病率和死亡率具有重要的意義。研究表明,覆盆子[2]、馬齒莧[3-4]、砂仁[5]等藥食同源中藥對腸炎及 CRC有治療作用。蘋果酸(Malic acid )是其活性成分之一,抑制腫瘤生長和轉移,還可以降低化療藥物的毒副作用,提高化療藥物的使用劑量[6]。但目前關于蘋果酸對腸道疾病的治療效果具體分子機制研究尚少。因此,我們將對蘋果酸對CRC的抑制作用及其分子機制進行初步研究。

1 材料與方法

1.1 細胞株、試劑與儀器人結直腸癌細胞株LoVo、HCT8和HCT116,均保存于本實驗室。蘋果酸二甲酯(Dimethyl malate, DMM)購自美國Sigma-Aldrich公司,ERK1/2和p-ERK1/2抗體購自Proteintech Group公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 人結直腸癌細胞株LoVo、HCT8和HCT116均為貼壁細胞,含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基培養于含有5%的CO2、37 ℃細胞培養箱中。

1.2.2細胞計數 為了檢測蘋果酸處理后細胞的增殖情況,將LoVo和HCT8細胞接種于24孔板(1×104個/孔),經不同濃度蘋果酸處理后,每24 h使用臺盼藍排除法進行細胞計數,持續4 d,繪制生長曲線。

1.2.3細胞克隆形成 為了檢測蘋果酸處理后細胞的克隆形成率,將LoVo和HCT8細胞接種于6孔板(1×104個/孔),經不同濃度蘋果酸處理后,在5% CO2、37 ℃的條件下培養7 d,加入甲醇固定15 min,結晶紫染色15 min,洗去浮色,晾干,拍照并計算克隆形成率。

1.2.4蛋白免疫印跡分析 不同濃度蘋果酸與HCT116細胞分別共同孵育48 h后,收集細胞,RIPA裂解并提取總蛋白,進行濃度測定、電泳、轉膜、封閉、抗體孵育,最后使用ECL發光試劑在暗室曝光。

2 結果

2.1 蘋果酸對LoVo和HCT8細胞增殖的影響LoVo細胞分別用0、2.5、5及10 mmol·L-1的蘋果酸處理,HCT8細胞分別用 0、2、4及8 mmol·L-1的蘋果酸處理。細胞計數的實驗結果顯示,與對照組相比,蘋果酸明顯抑制LoVo和HCT8細胞的生長速度,且具有劑量相關性,差異具有統計學意義(P<0.05,P<0.01),見Tab 1 和 Tab 2。說明蘋果酸可能抑制結直腸癌的細胞增殖能力。

2.2 蘋果酸對LoVo和HCT8細胞克隆形成的影響根據Tab 3、4結果,蘋果酸組細胞的克隆形成數明顯低于對照組(P<0.01),且呈現劑量依賴性。說明蘋果酸對結直腸癌的克隆形成能力具有抑制作用。

2.3 蘋果酸對HCT116細胞中ERK1/2磷酸化的影響為了進一步探討蘋果酸抑制結直腸癌細胞增殖的潛在機制,通過免疫印跡實驗檢測不同濃度蘋果酸處理前后的HCT116細胞中ERK1/2和p-ERK1/2蛋白水平。結果顯示,2、4和8 mmol·L-1的蘋果酸明顯減小 p-ERK1 /2與 ERK1 /2的比值,見Tab 5。提示蘋果酸抑制結直腸癌細胞的增殖有可能與 ERK1 /2 通路有關。

Tab 1 Effect of malic acid on cell proliferation of LoVo cells n=3)

Tab 2 Effect of malic acid on cell proliferation of HCT8 cells n=3)

Tab 3 Effect of malic acid on colony formation level protein level of LoVo cells n=3)

Tab 4 Effect of malic acid on colony formation level protein level of HCT8 cells n=3)

Tab 5 Effect of malic acid on protein level of

3 討論

CRC是當今世界第四大常見的腫瘤類型[7],我國CRC發病率及死亡率也均呈現明顯的上升趨勢。CRC的常規臨床治療手段為手術及放化療等,然而,由于手術應激、放化療的毒副作用及藥物耐藥等情況的出現,尋找毒性更低、效果更好的治療方法仍十分重要。隨著研究的深入,藥食同源中藥在抗腫瘤治療中的優勢逐漸顯露出來。蘋果酸作為一種藥食同源中藥單體,本研究發現,蘋果酸對CRC細胞的增殖具有明顯的抑制作用,有望成為前景可觀的抗癌藥物。

細胞外信號調節激酶( extracellular signal regulated kinase, ERK)是介導信號轉導至核內的重要細胞信號分子,其參與從質膜到胞核的信號轉導,是細胞增殖、分化、凋亡等的重要調節因素,在CRC發生發展中起到重要作用[8]。本研究發現,蘋果酸明顯降低ERK1/2的磷酸化水平,推測蘋果酸抑制CRC細胞增殖與ERK1/2通路有關。后續我們將對此分子機制開展進一步研究。