益腎化濕顆粒對糖尿病腎病小鼠中Yes相關蛋白的調控作用

蔡小凡,黃潔波,邢 玥,符欣漪,鄧躍毅,鐘逸斐,吳慧娟

(1.上海中醫藥大學附屬龍華醫院,上海 200032; 2.上海中醫藥大學附屬普陀區中心醫院,上海 200062;3.復旦大學基礎醫學院病理系,上海 200032)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病最為常見的微血管并發癥,發病率約為20%～40%,并已成為全球范圍內導致慢性腎臟病及終末期腎病的首要病因[1-2]。DN在病程中可涉及腎小球及腎小管間質的諸多病理變化,如細胞外基質增多、足細胞表型改變及腎纖維化等,推動著DN向終末期腎病的進展。Yes相關蛋白(Yes associated protein,YAP)是Hippo信號通路下游的重要效應分子[3],可直接調控包括結締組織生長因子(CTGF)在內的多種細胞因子的轉錄[4]。其在慢性腎臟病中的作用近年來開始受到諸多學者的關注。DN的眾多病理進程,如足細胞損傷、系膜細胞增生及腎間質纖維化等[4-6]均有YAP的參與。

益腎化濕顆粒(Yishen Huashi Granule,YSHS)(國藥準字Z20090250)源于李東垣《脾胃論》中的經典方劑“升陽益胃湯”,具有升陽補脾、益腎化濕、利水消腫的功效,主治以脾腎虧虛為主的DN,臨床療效及安全性較好[7]。國內學者采用HPLC-Q-TOF-MS/MS技術對YSHS主要成分進行了準確定性,共鑒定出包括香豆素類、三萜類、黃酮類化合物在內的主要成分68個。其中,柴胡皂苷A、黃芪甲苷III/IV、澤瀉醇A等與腎病的預測靶點有良好的結合活性,并能參與晚期糖基化產物-中膜產物受體信號通路在內的多條通路。說明該藥具有多成分、多靶點、多途徑的特點[8]。另有研究表明,YSHS可上調DN小鼠nephrin、podocin等足細胞功能蛋白[9],而下調CTGF的過表達則能改善足細胞功能蛋白的表達減少[10]。本研究從YAP/CTGF信號通路入手,觀察YSHS對DN小鼠YAP的調控作用及由此對CTGF與足細胞功能蛋白nephrin、wilm′s tumor 1(WT1)及podocalyxin mRNA表達的影響, 探討該藥改善DN腎小球病理損傷的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 8周齡雄性C57BL6小鼠,SPF級,體質量(22～25) g,購買自上海斯萊克實驗動物有限責任公司,許可證號:SCXK(滬)2018-004,合格證號:20180004025908。小鼠飼養于SPF級動物房中,環境溫度(23～25)℃,濕度40%～70%,分籠飼養,自由進水,保持良好通風環境,標準動物干飼料,12 h交替照明。

1.1.2藥物 益腎化濕顆粒(YSHS),由廣州康臣藥業有限公司提供。組分:人參、黃芪、白術、茯苓、澤瀉、半夏、羌活、獨活、防風、柴胡、黃連、白芍、陳皮、炙甘草、生姜、大棗,10 g/袋。維替泊芬(vertepofin,VP)(編號SML0534),購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.1.3主要試劑 鏈脲佐菌素(STZ)(S0130)購自美國Sigma-Aldrich公司。小鼠血肌酐(serum creatinine,Scr)試劑盒(C011-2-1)、尿素氮(blood urea nitrogen,Bun)試劑盒(編號C013-2-1)及尿蛋白(urine protein,Upro)試劑盒(C035-2-1),均購自南京建成生物工程研究所。YAP抗體(14074T)及磷酸化-YAP絲氨酸127抗體(p-YAP S127)(13008T)均購自美國CST公司,CTGF抗體(ab6992)購自英國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1模型建立及分組給藥 從28只C57BL/6小鼠中隨機抽取7只作為對照組,其余21只通過STZ誘導建立DN小鼠模型。采取連續5 d腹腔注射2%的STZ (50 mg·kg-1、0.1 mol·L-1、pH 4.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液),其中首次注射前禁食24 h,d 2～5注射前禁食6 h,對照組給予等體積溶媒。末次注射72 h后尾靜脈取血檢測血糖,以血糖≥16.7 mmol·L-1,尿蛋白定量超過正常對照組,且大于原24 h尿蛋白量150%(連續出現2次以上)[11]為DN模型制備成功。隨機分為模型組、YSHS組和VP組,每組7只,第8周結束后開始干預。其中YSHS組給予YSHS每日一次性灌胃5 g·kg-1,VP組為隔日腹腔一次性注射25 mg·kg-1,對照組與模型組給予等體積生理鹽水一次性灌胃。

1.2.2尿蛋白、血肌酐及尿素測定 留取給藥前后小鼠尿液標本雙縮脲法測定Upro。干預結束后處死小鼠,腹主動脈取血,3 000 r·min-1離心15 min取上層血清,分別用肌氨酸氧化酶及脲酶法檢測Scr及Bun水平。

1.2.3HE染色觀察 取小鼠腎皮質組織,10%中性甲醛溶液內固定24 h后,常規脫水、二甲苯透明及石蠟包埋,制成4 μm切片。行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining,HE)染色,二甲苯透明,烤干后中性樹膠封片,光鏡觀察腎小球系膜區改變情況。根據腎小球系膜區增寬程度分為輕度(系膜區寬度<毛細血管襻直徑)、中度(系膜區寬度>毛細血管襻直徑) 及重度(系膜基質擠壓襻呈結節、團塊或分葉狀)進行評估。

1.2.4Western blot檢測 采用Western blot法對YAP、p-YAP S127及CTGF的蛋白表達進行測定。取部分腎皮質組織提取總蛋白。100 ℃ 10 min蛋白變性后加入SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后,轉入PVDF膜。用5%脫脂奶粉TBST浸泡PVDF膜,室溫搖床封閉1 h后,加入一抗兔抗YAP抗體(1 ∶1 000),抗p-YAP S127抗體(1 ∶1 000),抗CTGF抗體(1 ∶1 000),并以GAPDH(1 ∶1 000)為內參在4 ℃孵育過夜。TBST充分洗滌PVDF膜3次,每次5 min,加入羊抗兔IgG-HRP(1 ∶5 000),37 ℃孵育1 h,再次洗滌3次。顯影曝光后ImageJ軟件分析結果。

1.2.5RT-PCR檢測 引物由南京金斯瑞生物科技有限公司設計合成(Tab 1)。采用TRIzol Reagent一步法提取總RNA后,稀釋并逆轉錄,將制備好的cDNA用于PCR擴增,各指標均擴增40個循環,以β-actin為內參,YAP、CTGF、nephrin、WT1和podocalyxin的mRNA相對表達量用2-ΔΔCt表示。引物序列,見Tab 1。

Tab 1 Primer sequence for real-time PCR

Tab 2 Comparison of kidney function and urine protein level in different groups of

Fig 1 Effect of Yishen huashi Granule on pathological changes in glomerulus of mice(HE ×400)

2 結果

2.1 YSHS對DN小鼠腎功能、尿蛋白的影響如Tab 2所示,與對照組相比,第12周時,模型組小鼠Scr及Bun水平均明顯升高(P<0.01)。YSHS組、VP組相較于模型組,Scr、Bun水平均有較明顯改善(P<0.01,P<0.05)。與同期對照組相比,DN小鼠在第8周和第12周時的Upro均明顯升高(P<0.01),經YSHS、VP治療4周后,兩組各自的Upro較同期模型組均明顯下降(P<0.01)。

2.2 YSHS對DN小鼠腎小球病理形態學的影響如Fig 1所示,對照組腎小球結構基本正常。與對照組相比,模型組腎小球系膜區基質明顯增多,系膜區寬度>毛細血管襻直徑(中度增寬);而經YSHS與VP治療后,上述病理表現較模型組有所減輕。

2.3 YSHS對DN小鼠腎皮質YAP、p-YAP S127及CTGF蛋白表達的影響Western blot結果顯示,與對照組相比,模型組小鼠YAP、p-YAP S127及CTGF蛋白表達明顯增加(P<0.01)。經VP治療后YAP、p-YAP S127和CTGF的蛋白表達較模型組明顯下降(P<0.01)。而經YSHS治療后,三者的表達較模型組亦有明顯下降 (P<0.01),見Fig 2。

2.4 YSHS對DN小鼠腎皮質YAP與CTGF mRNA表達的影響如 Fig 3所示,與對照組比較,模型組YAP與CTGF的mRNA表達量均有所上升(P<0.01,P<0.05)。與模型組比較,YSHS組兩者的mRNA均有所下降(P<0.01),其中CTGF的mRNA表達量亦低于對照組水平(P<0.01)。與對照組、模型組比較,VP組兩者的mRNA表達量明顯下降(P<0.01),其中YAP的mRNA表達量亦明顯低于YSHS組(P<0.01)。

Fig 2 The protein expression of YAP, p-YAP S127 and CTGFin renal cortex among each group n=7)

2.5 YSHS對DN小鼠腎皮質nephrin、WT1、podocalyxin mRNA表達的影響如Fig 4所示,與對照組比較,模型組nephrin、WT1和podocalyxin的mRNA表達量明顯下降(P<0.01)。與模型組比較,YSHS組三者的mRNA表達量均明顯上升(P<0.01),而VP組nephrin、podocalyxin的mRNA表達量有所上升(P<0.01,P<0.05),但WT1的mRNA表達量與模型組的差異無統計學意義(P>0.05)。

Fig 3 Relative mRNA expression of YAP and CTGF in renal cortexamong each group n=7)

Fig 4 Relative mRNA expression of nephrin, WT1 and podocalyxin

3 討論

DN的主要臨床表現有蛋白尿、低蛋白血癥性水腫及腎功能不全,故中醫屬于“尿濁”、“水腫”、“虛勞”等范疇,病機上則多因脾失健運,并由脾及腎,導致脾腎兩虛而引發。益腎化濕顆粒秉承“升陽益胃湯”方義,是從脾論治的代表方劑。臨床研究表明,該藥與利格列汀聯用可有效降低DN患者腎功能相關指標[7]。本研究中,經YSHS治療后的DN小鼠,尿蛋白濃度、血肌酐及尿素水平上均有明顯下降,再次證實了該藥在減少蛋白尿及延緩腎功能進展方面的作用。

YAP是Hippo信號通路下游的核心元件之一,具有通過進入細胞核促進轉錄增殖來調節細胞生長、分化及凋亡的作用。該作用又與YAP的磷酸化密切相關。通常,YAP以磷酸化的形式滯留在胞漿中,只有去磷酸化的YAP才能入核發揮相應的生物學功能。YAP可參與DN病程進展過程中的多個環節。在db/db小鼠中,YAP表達增多是導致腎小球系膜細胞增生及系膜區基質增多的重要原因[5]。腎近曲小管上皮細胞中YAP的活化可促進DN腎間質纖維化,而上述進程可通過YAP抑制劑VP的干預得到改善[4]。此外,過表達的YAP還能誘使足細胞重新進入細胞周期并發生去分化,造成足細胞表型的改變[12]。與上述文獻報道相符,本研究中DN小鼠腎皮質組織中的YAP在蛋白與mRNA表達水平上均明顯升高,經YSHS治療后,上述指標均出現不同程度的下降且腎小球系膜區基質增多情況亦得到改善,說明該藥具有下調YAP表達,以減輕腎小球系膜區病理損傷作用。我們還發現,經YSHS治療后p-YAPS127蛋白表達亦較模型組有明顯下降。這從一定程度上提示,YSHS對DN的治療作用并非通過將YAP滯留于胞漿以減少YAP入核的形式實現,而主要是通過減少YAP的表達來完成。

作為一種重要的纖維化誘導因子,CTGF能促進DN中腎小球系膜區基質增多、腎小球硬化及間質纖維化的發生。在DN大鼠腎組織及DN患者腎小球中,均可以發現CTGF在mRNA表達水平的升高[13-14]。足細胞損傷導致相關功能蛋白表達水平下降是DN的又一重要病理標志[15],而該過程亦與CTGF密切相關[16]。通過特異性抗體清除CTGF,可有效提高DN中nephrin等足細胞蛋白的表達[10]。而相關研究已證實,CTGF可直接受到YAP的調控[4]。利用VP進行干預,可抑制DN小鼠腎組織中CTGF的表達[4]。因此,本研究中我們對腎皮質組織中CTGF及分別位于足細胞裂孔膈膜、細胞核及頂端的功能蛋白nephrin、WT1、podocalyxin的mRNA表達情況進行了觀察。結果顯示,模型組小鼠CTGF的蛋白及mRNA表達水平明顯升高,而YSHS和VP組CTGF的表達量均出現下降,該結果與DN大鼠的研究報道一致[13]。此外,YSHS組小鼠的nephrin、WT1及podocalyxin的mRNA表達量較模型組均有所上調。說明YSHS具有通過抑制YAP過表達,下調CTGF表達水平上調nephrin、WT1及podocalyxin等足細胞功能蛋白mRNA的作用。值得注意的是,與模型組比較,VP組小鼠的nephrin和podocalyxin的mRNA表達水平亦有上升,但WT1的mRNA表達升高不明顯。造成該結果的原因可能與本研究中VP的給藥劑量(25 mg·kg-1,隔日一次)遠低于文獻報道中的劑量(100 mg·kg-1,隔日一次),從而減弱了該藥的療效有關。

綜上所述,益腎化濕顆粒在DN治療過程中具有降低尿蛋白、保護腎功能的作用。該作用可能與其下調DN小鼠腎皮質組織中YAP的表達水平,從而減少CTGF表達,并上調足細胞nephrin、WT1及podocalyxin等功能蛋白的mRNA表達有關。