葡萄籽提取物通過NF-κB/TLR4信號通路對腦缺血再灌注損傷大鼠的保護機制研究

李 丹,徐沙麗,王 穎,張俊霞

腦缺血是由腦動脈狹窄或閉塞、腦動脈栓塞、血流動力學、血液學等多種原因導致的局部或多部位的供血不足性疾病,是一種常見病,供血及供氧減少會導致組織損傷及壞死,而腦缺血再灌注可能會進一步加重病情及功能紊亂,影響病人的預后及生活質量[1-2]。近年來,越來越多的研究顯示,缺血并不是腦組織損傷的主要原因,而是由血供恢復后過量的自由基攻擊重新獲得血液供應的組織內的細胞造成的,稱為腦缺血再灌注損傷[3-4]。研究顯示,炎癥與神經元細胞死亡和神經系統功能紊亂密切相關[5]。葡萄籽原花青素是從葡萄籽中提取的生物類黃酮,具有較強的清除自由基、抗氧化活性,可減輕腦缺血再灌注大鼠缺血區病理改變,減輕脂質過氧化,改善大鼠學習和記憶功能,發揮腦保護作用[6]。核轉錄因子-κB(NF-κB)在炎癥發生過程中具有關鍵作用[7]。Toll樣受體(TLR)是一種跨膜受體,而TLR4作為其中的一種亞型,主要識別不同的病原相關分子模式,進而導致炎性細胞分泌增加,引起全身炎癥反應[8]。因此,本研究基于NF-κB/TLR4信號通路探討葡萄籽提取物對腦缺血再灌注損傷大鼠模型的影響并分析其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與藥物

8周齡SD大鼠40只,體質量(230±30)g,購自北京市華阜康生物技術股份有限公司,動物許可證號:SCXK(京)2020-0004。飼養環境保持干燥、通風、安靜,大鼠自由進食、飲水,室內溫度22 ℃,相對濕度60%,適應性喂養2周。葡萄籽提取物(提取率為8%,原花青素含量為95%)購自天津市尖峰天然產物研究開發有限公司,批號:002-1503012-27。

1.2 試劑及儀器

蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒購自武漢百浩天生物科技有限公司;酶聯免疫吸附(ELISA)法試劑盒購自四川邁克生物科技股份有限公司;白細胞介素(IL)-1β、IL-6檢測試劑盒由廣州新晉生物科技有限公司提供;腫瘤壞死因子-α(TNF-α)檢測試劑盒購自遼寧天醫生物制藥有限公司;B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)試劑盒、B淋巴細胞瘤-2相關蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)試劑盒均購自江蘇睿捷生物科技有限公司;Caspase-3檢測試劑盒購自廣州銘安生物科技有限公司;TLR4、NF-κB p65及NF-κB p65一抗、二抗均購自深圳市益百順科技有限公司;電子天平YP80001型購自河北傳維化工有限公司;低溫離心機(型號5810R)購自深圳諸夏科技有限公司;正置顯微鏡(GR-29J-2型)購自廣東金相檢測技術有限公司;電泳儀、轉膜儀購自深圳市文樂生物科技有限公司;凝膠成像儀系統由北京華圣科儀實驗設備有限公司提供。

1.3 動物分組、造模及給藥

將40只大鼠隨機分為對照組、模型組、葡萄籽提取物低劑量組及葡萄籽提取物高劑量組,每組10只。模型組、葡萄籽提取物低劑量組及葡萄籽提取物高劑量組參考文獻[9]中的方法,采用改良線栓法建立腦缺血再灌注損傷模型。大鼠腹腔麻醉,固定于實驗臺,仰臥位,取頸正中切口,切開皮膚,鈍性分離各層組織,分離右側頸總動脈,向上分離右頸外動脈、頸內動脈,在近右側頸總動脈分叉處約6 mm處結扎右頸外動脈,于右側頸總動脈近心端夾動脈夾,在右頸外動脈近分叉處留置一打好結的絲線,不收緊線結,在右頸外動脈結扎處與分叉處之間做一直徑約0.20 mm的V型切口,將尼龍線于結扎切口處輕輕插入,輕輕收緊線結,松動脈夾,將尼龍線順大腦中動脈經頸內動脈送入顱內,插入深度約19 mm,微遇阻力時停止,使尼龍線頭端位于大腦中動脈起始處,阻斷大腦中動脈的血流。收緊絲線,海綿膠止血,縫合傷口,單籠飼養。對照組只進行麻醉和血管分離術,不結扎血管及導入線栓。采用Zea-Longa分級評分篩選造模成功的大鼠。葡萄籽提取物低劑量組、葡萄籽提取物高劑量組于建模成功后分別給予70、140 mg/kg葡萄籽提取物灌胃,對照組和模型組以2 mL/kg生理鹽水灌胃,每日1次,連續灌胃7 d。

1.4 大鼠神經缺損情況

參照5分制評分法[10]評估各組大鼠神經功能變化情況,0分為活動基本正常,無明顯神經病學癥狀;1分為左側前爪無法完全伸展;2分為爬行時向左側轉圈;3分為行走時向偏癱側傾倒;4分為不能自動行走,有意識障礙。

1.5 大鼠腦組織病理改變觀察

各組大鼠藥物灌胃結束24 h后麻醉處死,取大腦組織,用4%多聚甲醛溶液浸泡24 h,按照常規方法制成石蠟切片,使用HE染色觀察大鼠腦組織病理切片。

1.6 ELISA法檢測相關炎性因子水平

收集各組大鼠腦組織,轉移至含1 mL蛋白酶抑制劑的PBS中,勻漿機研磨后充分勻漿,以12 000 r/min離心20 min,收集上清液,按ELISA說明書檢測IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

1.7 蛋白免疫印跡(Western Blot)法檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3、TLR4和NF-κB蛋白表達量

將大腦組織剪碎,完成消化、電泳、轉膜,加入一抗(Bcl-2、Bax、Caspase-3、TLR4和NF-κB蛋白)孵育,第2天加入二抗孵育2 h,通過吸光度,以內參為β-actin獲得Bcl-2、Bax、Caspase-3、TLR4和NF-κB蛋白表達水平。

1.8 統計學處理

2 結 果

2.1 各組大鼠精神狀態及神經缺損評分比較

對照組大鼠活動正常,精神狀態良好;模型組和葡萄籽提取物低劑量組大鼠精神狀態不佳、不活躍,經常靜止于角落;葡萄籽提取物高劑量組大鼠精神狀態有較好改善,有少量活動。與對照組比較,模型組、葡萄籽提取物低劑量組、葡萄籽提取物高劑量組大鼠神經缺損評分升高,差異均有統計學意義(P<0.05);與模型組比較,葡萄籽提取物低劑量組、葡萄籽提取物高劑量組大鼠神經功能缺損評分明顯降低,差異均有統計學意義(P<0.05);與葡萄籽提取物低劑量組比較,葡萄籽提取物高劑量組大鼠神經功能缺損評分降低,差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠神經缺損評分比較(±s) 單位:分

表2 各組大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較(±s) 單位:pg/mL

2.2 各組大鼠腦組織病理變化比較

HE染色結果顯示,對照組大鼠腦細胞正常;模型組大鼠腦細胞部分壞死,正常細胞大量減少,炎性細胞增多,出現脫片現象;葡萄籽提取物低劑量組與葡萄籽提取物高劑量組大鼠腦組織有脫片現象,與模型組比較,脫片現象、炎性細胞浸潤明顯減少。詳見圖1。

圖1 各組大鼠腦組織病理變化(HE染色,×400)

2.3 各組大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較

與對照組比較,模型組、葡萄籽提取物低劑量組、葡萄籽提取物高劑量組大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯升高,差異均有統計學意義(P<0.05);與模型組、葡萄籽提取物低劑量組比較,葡萄籽提取物高劑量組大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯降低,差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表 2。

2.4 各組大鼠TLR4、NF-κB蛋白表達水平比較

與對照組比較,模型組、葡萄籽提取物低劑量組、葡萄籽提取物高劑量組大鼠TLR4蛋白和NF-κB蛋白相對表達水平明顯升高,差異均有統計學意義(P<0.05);與模型組比較,葡萄籽提取物低劑量組、葡萄籽提取物高劑量組大鼠TLR4蛋白和NF-κB蛋白相對表達水平明顯降低,差異均有統計學意義(P<0.05);與葡萄籽提取物低劑量組比較,葡萄籽提取物高劑量組大鼠TLR4蛋白和NF-κB蛋白相對表達水平明顯降低,差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表3、圖2。

圖2 各組大鼠TLR4、NF-κB蛋白表達條帶圖(A為對照組,B為模型組,C為葡萄籽提取物低劑量組,D為葡萄籽提取物高劑量組)

表3 各組大鼠TLR4、NF-κB蛋白表達水平比較(±s)

2.5 各組大鼠Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達水平比較

與對照組比較,模型組、葡萄籽提取物低劑量組、葡萄籽提取物高劑量組大鼠Bcl-2蛋白表達水平明顯降低,Bax、Caspase-3蛋白表達水平明顯升高,差異均有統計學意義(P<0.05);與模型組比較,葡萄籽提取物低劑量組、葡萄籽提取物高劑量組大鼠Bcl-2蛋白表達水平明顯升高,Bax、Caspase-3蛋白表達水平明顯降低,差異均有統計學意義(P<0.05);與葡萄籽提取物低劑量組比較,葡萄籽提取物高劑量組大鼠Bcl-2蛋白表達水平明顯升高,Bax、Caspase-3蛋白表達水平明顯降低,差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表4。

表4 各組大鼠Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達水平比較(±s)

3 討 論

缺血性腦血管疾病為臨床常見疾病,復發率較高,嚴重威脅病人的身心健康和生命安全,且炎性因子對腦損傷具有重要影響[11-13]。腦缺血再灌注損傷防治一直是臨床研究的重點和難點。本研究探討葡萄籽提取物調控NF-κB/TLR4信號通路對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織的保護作用。腦組織短暫缺血會引起腦缺血損傷,但當血液供應恢復后出現的炎性反應會對腦組織造成缺血再灌注損傷[14]。相關研究指出,NF-κB是重要的核轉錄因子,與局灶性腦缺血再灌注損傷后的免疫炎性反應密切相關,其作為炎癥反應過程的調節中介物可介導TNF-α、IL-1β和IL-6等炎性因子的合成,促使局灶性腦缺血再灌注后腦組織損傷加重[15]。炎癥反應是腦缺血再灌注損傷的病理機制基礎,也是腦卒中發生的十分危險因素[16]。腦缺血再灌注后腦組織細胞受損,刺激分泌大量的炎性因子[17-18]。IL-1β是炎性反應中標志性的炎性因子,對炎癥反應具有促進作用,當缺血性腦損傷發生時,激活免疫反應,進而誘發一系列級聯反應,如炎性反應中TNF-α和IL-1β等的表達,加劇腦損傷[19]。IL-6由多類細胞分泌,也是一類促炎因子,在腦組織損傷中發揮作用[20-21]。TNF-α在腦缺血的早期介導炎癥反應的發生[22]。本研究發現,低、高劑量的葡萄籽提取物能負調控腦組織中IL-1β、IL-6及TNF-α水平,表明葡萄籽提取物有一定的抗炎作用。

NF-κB在真核細胞內廣泛存在,其對于機體的基因轉錄過程有重要調控作用,且與機體炎性反應、免疫應答、細胞凋亡等病理生理過程均密切相關[23]。研究顯示,TLR4/NF-κB信號通路能刺激Bax蛋白表達,抑制Bcl-2蛋白表達,加快細胞凋亡[24]。本研究結果顯示,葡萄籽提取物可以降低TLR4、NF-κB的蛋白表達,說明葡萄籽提取物可以負調控TLR4/NF-κB信號通路表達,降低凋亡蛋白表達,對損傷的大鼠腦組織具有保護作用,防止損傷病情的加重。研究表明,葡萄籽提取物具有調控TLR4/NF-κB信號通路的作用,與本研究結果[25]一致。Caspase家族是調控細胞凋亡的主要蛋白,包括Caspase-9、Caspase-3等[26]。當細胞凋亡程序啟動,Caspase-3開始活化,進入細胞核,執行降解蛋白的作用,加快細胞凋亡[27]。本研究結果顯示,與模型組比較,葡萄籽提取物低劑量組、葡萄籽提取物高劑量組大鼠腦組織中Caspase-3蛋白表達降低。李浩等[27]實驗研究顯示,原花青素可負調控凋亡相關蛋白表達,減少腦細胞凋亡,達到保護腦組織損傷的作用,與本研究結論一致。

綜上所述,葡萄籽提取物可能通過調控NF-κB/TLR4信號通路促進Bcl-2蛋白表達,抑制Bax、Caspase-3蛋白表達,減少炎性因子TNF-α、IL-6和IL-1β的釋放,從而改善大鼠神經功能缺損及腦組織病理損傷,發揮其腦保護作用。