不同成熟期鮮棗香氣物質變化及相關合成酶活性研究

王麗娜 陳 川 何榮軍 孫培龍

（浙江工業大學食品科學與工程學院，浙江 杭州 310000）

棗（ZiziphusjujubaMill.），又名棗子、大棗、刺棗、貫棗，英文稱Chinese jujube 或Chinese date，屬鼠李科（Rhamnaceae）棗屬植物，含有豐富的生物活性物質，被用作傳統藥物［1］；同時還具有獨特而誘人的香氣，是廣受歡迎的鮮食水果之一。其香氣提取物作為食品工業中理想的天然香料成分，產量逐年增長［2］。

近年來，隨著儀器分析技術的發展，水果香氣成分鑒定取得了長足的進步。氣相色譜-質譜聯用技術（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）是水果和蔬菜風味分析中應用最廣泛的技術；此外，還有離子遷移色譜（ion mobiIity spectrometry，IMS）、氣相色譜-嗅聞技術（gas chromatography-olfactometry，GC-O）、電子鼻等常用儀器［3］。醛、酮、酯、酸和醇等化合物是構成不同品種棗香氣的主要成分，其中己醛、（E）-2-己醛、壬醛、正癸酸、（Z）-2-庚烯醛和苯甲醛是鮮棗果實的主要揮發性成分［4-5］；同時蒸餾萃取法可萃取較多的醛類、酯類和酸類香氣物質［6］。香氣成分的組成和含量會隨著果實成熟發生變化，金絲4 號棗在白熟期、半紅期、全紅期分別檢測到13、38、27 種香氣成分，其中酯類物質在半紅期種類和含量最多［7］；駿棗香氣成分數量隨著成熟度增加而增加［8］。成熟過程中，內在物質的變化會導致果實品質（包括顏色、硬度以及特征香氣）發生變化［9-10］。因此，研究棗成熟階段的關鍵物質變化有助于更好地了解棗的香氣形成規律。

果實香氣的形成涉及不同生物合成途徑、最終代謝物的積累及其調控［11］等方面，其中脂氧合酶（lipoxygenases，LOX）途徑對許多水果的生理代謝具有重要作用［12-13］。LOX催化亞油酸或亞麻酸轉化為氫過氧化物，過氧化氫裂解酶（hydroperoxidelyase，HPL）進一步將其還原為己醛和（E）-2-己烯醛［14］。隨后是醛的降解，在乙醇脫氫酶（alcoholdehydrogenase，ADH）的作用下生成相應的C6 醇，通過醇酰基轉移酶（alcohol acyl transferase，AAT）的催化最終生成揮發性酯［15］。Luo 等［16］發現Nanguo 梨成熟過程中LOX、ADH和AAT 活性逐漸升高。隋靜等［17］比較豐香和羅莎兩種草莓香氣成分與AAT 活性的關系，發現果實在成熟過程中香氣含量與AAT 活性密切相關，紅熟期豐香果實的AAT 活性及酯類化合物含量均高于羅莎。然而關于關鍵酶活性對棗在成熟過程中香氣成分變化的影響鮮有報道。

目前通過香氣活力值（odor active values，OAV）結合鮮棗不同成熟階段香氣特征研究較少，探究不同成熟階段鮮棗香氣成分的變化，可以為優化鮮棗的采收提供依據，同時有助于鮮棗的保鮮和加工過程中的香氣控制和調整。基于此，本研究以品質優良、市場價值高的中國國家地理標志產品壺瓶棗、板棗和贊皇大棗（均為干鮮兼用棗）為試驗品種，以4 個不同成熟階段的鮮棗為試驗材料，探究不同成熟期香氣積累與酶活性之間的關系，旨在明確成熟過程對鮮棗香氣成分的影響，解析鮮棗果實香氣形成機理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮棗來自山西農業大學果樹研究所國家棗種資源圃/國家園藝種質棗分庫，采收于2021年8—9月份，包含3 個品種（壺瓶棗-HPZ，板棗-BZ，贊皇大棗-ZHDZ）4個成熟時期（S1-青白期，S2-半紅期，S3-全紅期，S4-后熟期），選取長勢基本一致、生長發育良好的植株，進行隨機均勻采樣并混勻。鮮棗大小均勻、果形正常、無機械損傷。當日運回實驗室，置于-80 ℃冰箱保存。

試驗所需藥品、試劑均為分析純：C8-C20正構烷烴標準品，美國Sigma-Aldrich 公司；正己烷、6-甲基-5-庚烯-2-醇標準品（＞99%），信陽市中檢計量生物科技有限公司；植物中脂肪氧合酶（LOX）活力檢測試劑盒、乙醇脫氫酶（ADH）活力檢測試劑盒及乙醇酰基轉移酶（AAT）試劑盒，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

DSQ II單四級桿氣相色譜質譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）聯用儀，美國Thermo 公司；DB-5（60 mm×0.25 mm，0.25 μm）石英毛細管柱，美國安捷倫公司；DVB/CAR/PDM 混合涂層纖維（50/30 μm）萃取頭，美國Supelco 公司；FA1004 電子天平（量感0.1 mg），上海茂宏電子科技有限公司；HH-2 水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司；TGL-16 湘儀冷凍離心機，浙江賽德儀器設備有限公司；T6 新世紀紫外分光光度計，鞏義市宏華儀器設備工貿有限公司；L18-Y915S九陽破壁機，九陽股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理 同一品種、同一成熟度的果實解凍后切片，去核，破碎后均勻混合，用于香氣物質測定。取3.0 g 樣品置于20 mL 頂空瓶中，密閉封口，用于揮發物萃取，每個樣品平行測定3 次。固相微萃取（solid phase micro-extraction，SPME）優化后條件：萃取時間30 min，萃取溫度50 ℃，解析時間3 min。

1.3.2 GC-MS測定方法 參考Wang等［4］和Chen等［5］的方法，并進行調整。

氣相條件：進樣口溫度250 ℃；傳遞線溫度250 ℃；升溫程序：起始溫度40 ℃，保持3 min，然后以10 ℃·min-1的速度升至200 ℃，保持5 min，再以10 ℃·min-1的速度升至240 ℃，保持10 min。質譜條件：質譜檢測器采用電子電離（electronic ionization，EI）模式；離子源溫度250 ℃；電子能量70 eV；質譜掃描范圍35～500m/z。檢測結果采用NIST（National Institute of Standard and Technology Standard Reference Database）數據庫（2.0 版）和保留指數（retention index，RI）進行香氣成分鑒定。RI的計算公式如下：

式中，t為檢測化合物的保留時間；tn為在檢測化合物前洗脫的烷烴標準物的保留時間，n為該標準物的碳數；tN為檢測化合物后洗脫的烷烴標準物的保留時間，N為標準物的碳數。以6-甲基-5-庚烯-2-醇為內標物，對香氣物質進行定量。所有樣本重復運行3次。

1.3.3 香氣活性值計算 按以下公式計算香氣活力值：

式中，Ci為香氣化合物的含量（mg·kg-1）；OTi為該化合物在水中的閾值（mg·kg-1）。

1.3.4 關鍵酶活性測定 關鍵酶LOX、ADH 及AAT活性檢測采用紫外分光光度法，具體步驟均嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.4 數據統計與分析

相關性分析采用SPSS 26.0 軟件中雙變量相關性檢測，以皮爾遜（Pearson）相關系數評估變量間的線性關系，采用雙尾檢驗。差異性采用鄧肯式多重差異分析（P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著），結果以平均值±標準差表示，并采用OriginPro 2021 軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 鮮棗成熟過程中香氣物質的變化

GC-MS 檢測結果見表1。3 個品種鮮棗中共檢測到46 種香氣物質，主要為醛類、酸類、酯類，而酮類和醇類物質含量較少。棗品種間香氣成分的組成和含量有所差異，3 個鮮棗品種成熟過程中共有的香氣成分是戊醛、己醛、（E）-2-己烯醛、苯甲醛、（E）-2-辛烯醛和1-戊烯-3-酮。

表1不同成熟期鮮棗香氣成分及其含量（鮮質量）Table 1 Aroma components and contents of fresh jujube at different maturity stages（/mg·kg-1 FW）

HPZ、BZ 和ZHDZ 中不同香氣物質種類組成和含量差異比較見圖1。

圖1 鮮棗果實成熟過程中各類香氣物質含量的變化趨勢Fig.1 Changes in contents of various classes of aroma compounds in jujube during ripening

醛類物質是鮮棗中主要香氣成分［4］，不同品種的棗在S2～S4 階段醛類物質的累積情況存在顯著差異（P＜0.05）。隨著成熟度的增加，HPZ 中的醛類物質含量逐漸增加，最高含量為5.35 mg·kg-1（S4）；而BZ 和ZHDZ 中的醛類物質含量分別在S2 （12.44 mg·kg-1）和S3 （13.94 mg·kg-1）時期達到峰值，并且隨成熟度增加而下降。（E）-2-己烯醛在HPZ（2.20 mg·kg-1）、BZ（4.67 mg·kg-1）、ZHDZ （4.20 mg·kg-1）中含量較多，與Wang等［4］在BZ中的發現一致。

酯類化合物在成熟初期較少，S4時期含量最多。這一變化規律與趙峰等［7］的發現一致。3種鮮棗酯類香氣成分總量差異明顯，HPZ中的苯甲酸乙酯、癸酸乙酯和壬酸戊酯是后熟階段（S4）新增香氣物質。月桂酸甲酯（1.01 mg·kg-1）和S4階段新增的癸酸乙酯（0.99 mg·kg-1）為ZHDZ 中含量較多的酯類。BZ 的S2～S4時期均發現癸酸乙酯（0.13～0.17 mg·kg-1）和月桂酸乙酯（0.053～0.063 mg·kg-1），其中癸酸乙酯含量最多。

酮類物質在HPZ的S4 （0.28 mg·kg-1）時期達到最大值；在BZ和ZHDZ中均隨成熟度增加呈現先上升后下降趨勢，分別在S2 （0.61 mg·kg-1）和S3 （0.67 mg·kg-1）時期達到最大值。1-戊烯-3-酮是主要酮類物質；2-壬酮是HPZ和BZ在S4時期新增香氣物質。

ZHDZ 與HPZ、BZ 在不同成熟階段酸類香氣成分差別較大。HPZ中酸類物質含量在成熟過程中逐漸下降，S1 時期最高（2.41 mg·kg-1）；其主要成分為乙酸、己酸和月桂酸。BZ 和ZHDZ 中含量最多的酸類物質為癸酸，這與Chen 等［5］的結果一致，其最高含量分別為1.76 mg·kg-1（S2）和1.49 mg·kg-1（S3）。BZ在S2時期開始檢測到酸類物質（4.64 mg·kg-1）并在成熟后期有所下降，而ZHDZ在S3 （3.57 mg·kg-1）時期酸類物質達到最大值。但S1 時期酸類物質占總香氣成分的百分比最大。

2.2 鮮棗香氣活性物質

香氣活性值（OAV）［23］可以分析比較不同香氣成分在食品中的貢獻度。通常揮發性化合物的OAV值＞1被定為香氣活性物質［24］。根據閾值計算，鮮棗中OAV＞1的物質有23 種，香氣活性物質主要為醛類、酯類和酮類物質。

根據表2，在HPZ、BZ 和ZHDZ 中分別鑒定到21、18和19種關鍵香氣成分，其中共有的香氣活性物質為己醛、（E）-2-己烯醛、（E）-2-辛烯醛、1-戊烯-3-酮和月桂酸。香氣活性值較高的成分己醛（OAV167-280）、（E）-2-己烯醛（OAV83-118）、（E）-2-辛烯醛（OAV11-28）、（Z）-2-庚烯醛（OAV321-1327）、1-戊烯-3-酮（OAV29-122）和月桂酸（OAV38-162）對HPZ整體香氣貢獻較大。己醛（OAV154-255）、（E）-2-己烯醛（OAV123-275）、（E）-2-辛烯醛（OAV19-392）、（E）-2-壬烯醛（OAV504）、1-戊烯-3-酮（OAV45-306）和月桂酸（OAV67-618）對BZ 整體香氣貢獻較大。己醛（OAV151-265）、（E）-2-己烯醛（OAV122-247）、（Z）-2-庚烯醛（OAV26-82）、（E）-2-辛烯醛（OAV26-33）、（E）-2-壬烯醛（OAV484-7149）、1-戊烯-3-酮（OAV56-408）、月桂酸（OAV72-144）和月桂酸甲酯（OAV87-383）為ZHDZ中貢獻較大的香氣活性物質。

表2 不同成熟期各鮮棗香氣活性值Table 2 Aroma activity value of fresh jujube at different maturity stages/（mg·kg-1）

香氣活性值可以作為評價該香氣成分對樣品貢獻度的標準指標。在所有棗中醛類物質香氣值最大，這與在檸檬［25］和蔓越莓［26］中的發現相似。BZ 中己醛香氣活性值在成熟過程逐漸降低，在成熟初期香氣活性值最大，這與其他品種變化相反。呈清新、黃瓜味的（E）-2-壬烯醛僅在BZ 的S2 時期有貢獻，在ZHDZ 的S3 時期貢獻最大。醛類中的癸醛僅在ZHDZ 的S4 時期有貢獻。酯類中關鍵香氣成分主要為月桂酸甲酯，也集中在成熟后期。

2.3 鮮棗成熟過程中關鍵酶活性變化

目前從棗中檢測到的醛類和酯類物質的合成主要與LOX途徑有關［27-28］。LOX、ADH和AAT是LOX途徑的3 個關鍵酶，是大多數植物形成香氣物質的主要途徑之一［29］。由圖2可知，鮮棗成熟過程中酶活性變化也不同，LOX、ADH和AAT最高值出現的時間有差異。

圖2 鮮棗果實成熟過程中酶活性變化趨勢Fig.2 Changes trend of enzyme activity during jujube fruit ripening

根據試驗結果所示，LOX 途徑3 個關鍵酶在不同成熟期的活性均存在較明顯的差異。3 種鮮棗果實在成熟過程中的LOX活性均高于ADH和AAT。LOX酶催化產物為后續短鏈醛、醇和酯的形成提供原料［30］。HPZ和ZHDZ 的酶活性變化趨勢相似，其LOX 活性均在S3時期達到最大值，分別為1 168.37 和1 834.43 U·g-1；AAT 活性也同樣在該時期達到最大值；ADH 活性變化趨勢有所不同，ADH 活性在HPZ 成熟過程中不斷增加，在S4 達到最大，而ZHDZ 則在S2 下降至最低值后迅速增加，在S3 時期達到最大值（0.79 U·g-1）。BZ 的LOX 活性在S2 時期達到最大值，為1 462.38 U·g-1，隨后開始迅速下降；ADH 活性隨著果實成熟呈現整體逐漸下降趨勢，最低值為0.08 U·g-1，和其余2 種鮮棗果實變化相反；AAT 活性從S1～S2時期迅速增加，而后變化緩慢，到S4時期有所下降。

2.4 LOX途徑關鍵酶與香氣物質之間的相關性

對3種棗各個成熟階段LOX 關鍵酶和主要香氣物質以及關鍵呈香物質己醛進行相關性分析，結果如圖3 所示。不同品種果實的關鍵酶與香氣物質之間相關性存在差異。LOX與醛類相關性分析中，僅BZ中醛類物質與LOX 活性有顯著相關性（r=0.764，P＜0.05）。在對LOX活性與己醛相關性分析中發現，己醛在BZ（r=0.748）和ZHDZ（0.690）中與其呈現顯著相關性（P＜0.05），這與張曾等［30］對獼猴桃的研究結果一致。ZHDZ 的酮類物質與LOX、ADH 和AAT 活性均有相關性。除ZHDZ的AAT活性與醛類物質呈極顯著相關（r=0.980）外，其余品種ADH和AAT活性與醛類物質無明顯相關性。HPZ 中ADH 活性與酯類物質相關性最強（r=0.914）。在ZHDZ 中，AAT 活性與醛、酮和醇類有顯著相關性，與酯類物質無相關性；相反的是，HPZ 和BZ的AAT活性與酯類物質有顯著相關性。

圖3 不同成熟期鮮棗果實LOX途徑與香氣物質相關熱力圖Fig.3 The LOX pathway of fresh jujube fruit at different maturity stages and the heat map related to aroma substances

3 討論

香氣是水果品質的重要指標之一，影響關鍵香氣成分的主要因素是果實的成熟度。隨著果實的生長，香氣化合物的種類和含量會發生變化［29］。以芒果為例，在成熟初期酸類和萜類香氣化合物含量最多，而隨著果實成熟酯類化合物含量逐漸增加［31］；杏果實在發育過程中醛類和萜類含量顯著減少，而酯類含量則隨著果實成熟急劇增加［32］。本研究同樣發現，在鮮棗成熟過程中，酯類化合物的含量逐漸上升。王淑貞等［33］對不同成熟期魯北冬棗的研究發現，酯類是青白期和半紅期主要揮發性物質，全紅期中含量仍然最多但總體含量開始下降，這與本研究中3 種鮮棗的酯類含量變化不同。鮮棗品種間基因差異也會影響酯類含量變化，可能的原因是，果實底物的可利用性隨成熟度而增加，導致酯類化合物積累，并且與AAT 活性相關［31］。許多研究表明，醛類物質是最豐富的香氣成分［4，5，33］。本研究中，BZ醛類化合物在半紅期（S2階段）積累達到最高峰，隨后逐漸下降；而HPZ 和ZHDZ 醛類化合物的含量則在后熟期（S4 階段）達到最高。該趨勢與Song等［8］的研究結果基本一致。C6 醛是未成熟果實香氣的主要貢獻者［34］，隨著果實成熟，蘋果［34］、草莓［35］、鱷梨［36］中的C6醛含量逐漸下降。與之相反，本研究發現在鮮棗成熟期內，己醛和（E）-2-己烯醛的含量顯著增加，與Song 等［8］的研究結果一致，即：（E）-2-己烯醛的含量在新疆駿棗不同成熟階段顯著增加（20.88%～36.70%），但除GM 階段外，其余3 個成熟期的己醛含量變化并不顯著，這可能也與棗的品種和產地環境因素有關。此外，在BZ 的半紅期（S2），C6 醛物質種類較另外兩種更為多樣，因此，不同品種的鮮棗在果實成熟過程中的醛類化合物變化趨勢可能受到其自身代謝合成差異的影響［37］。

除成熟度外，香氣活性值和特有香氣活性物質也是香氣的重要影響因素。本研究香氣活性值分析中，共有23 種香氣化合物OAV 值在棗果實中大于1。其中，己醛（青草味）和（E）-2-己烯醛是3 個品種鮮棗中共有的特征香氣成分，并且己醛、（E）-2-己烯醛、（Z）-2-庚烯醛、（E）-2-壬烯醛、（E）-2-辛烯醛、1-戊烯-3-酮和月桂酸是鮮棗中的特征香氣成分，而Zhu等［38］對干棗OAV 值研究發現，己醛（OAV：39～85）和（E）-2-辛烯醛（OAV：32～70）是干棗中最主要的兩種風味物質，這也證明醛類物質對棗香氣的貢獻度較大。然而，不同品種的鮮棗OAV 值在不同成熟階段有所不同。在HPZ 和ZHDZ 的S4 時期，己醛和（Z）-2-庚烯醛分別達到最大香氣值，而BZ 則在S2 時期達到最大，這與香氣成分成熟期變化規律相符。月桂酸和1-戊烯-3-酮含量在3 種果實成熟過程中逐漸降低，（E）-2-己烯醛含量在HPZ 和ZHDZ 成熟過程逐漸增加，在S4 時期香氣值達到最大，而BZ 則在S2 時期達到最大，隨后在成熟過程中下降；（E）-2-辛烯醛在3 種果實的S2 時期達到最大，隨后逐漸下降；而（Z）-2-庚烯醛香氣值變化在3種果實中均不同，最大香氣值出現時期也不同。

酶活性也是決定香氣的重要因素之一，LOX、ADH和AAT 是LOX 途徑中香氣物質形成的3 種關鍵酶［12］。本研究結果表明，在4個成熟階段中，LOX 活性均高于ADH和AAT活性。此外，不同品種之間LOX活性也具有顯著差異，其中ZHDZ品種的LOX活性最高。3種果實的ADH 活性變化趨勢不同，HPZ 和BZ 的變化趨勢相反。在成熟過程中3種鮮棗果實AAT活性變化趨勢相同，均在S3 階段達到最大值。在LOX 途徑中，ADH活性在成熟過程中的變化趨勢與醇類物質含量變化趨勢相反，可能是由于反應過程中底物醛含量不足，該結果與金橘不同成熟期ADH 活性的變化趨勢相似［39］，這是ADH 在部分水果成熟過程中的變化特點。當BZ 和ZHDZ 進入LOX 活性達到最大時期時，會增加己醛、（E）-2-己烯醛、（E，E）-2，4-戊烯醛和（E）-2-辛烯醛等醛類物質的含量。然而，HPZ 醛類物質含量的快速增加則發生在S4 時期。這一結果表明醛類物質的生成不僅與酶活性有關，還與LOX 底物含量及其專一性相關［40-42］。并且不同品種間的編碼基因表達可能會導致相關性的差異［43］，因此有必要進一步研究果實成熟過程中香氣成分變化與脂肪酸途徑相關基因表達的關系。綜上所述，LOX 在決定果實中直鏈揮發性化合物的形成中起著重要作用；而ADH 活性與醇類物質含量呈現負相關，這可能是由過量產物對酶活性的反饋抑制所致［39，44］。

4 結論

本研究對不同品種鮮棗果實成熟過程中的揮發性化合物和代謝途徑關鍵酶進行分析，結果發現醛類物質在3 種果實香氣成分中含量最高。隨著成熟度的增加，己醛、（E）-2-己烯醛、苯甲醛、癸酸等香氣物質含量增加。月桂酸、1-戊烯-3-酮、（E）-2-己烯醛、（Z）-2-庚烯醛和（E）-2-辛烯醛是影響不同成熟期特征香氣的主要物質。同時發現LOX 途徑關鍵酶活性對香氣成分的影響在品種之間存在差異，BZ 和ZHDZ 中LOX活性與醛類物質含量呈正相關，HPZ和BZ中AAT活性與酯類物質含量呈正相關，ADH 活性僅在HPZ 中與酯類物質含量呈顯著正相關。