茶葉和土壤中cis-聯苯菊酯、高效氯氟氰菊酯手性對映體殘留分析

寧亞婷 王新茹 羅逢健 李建勛 張新忠，

（1中國農業科學院茶葉研究所，浙江 杭州 310008；2中國農業科學院農產品加工研究所，北京 100193）

茶葉是我國出口競爭力較強的傳統特色農產品。目前我國茶樹種植面積和產量都居全球之首，茶葉出口居世界第二。茶樹在生長過程中常遭遇茶尺蠖、茶假眼小綠葉蟬、粉虱和象甲等多種害蟲危害，嚴重影響品質和產量。目前，占世界殺蟲劑市場30%～40%的擬除蟲菊酯類農藥是防治茶園害蟲的主要農藥。例如，cis-聯苯菊酯、高效氯氟氰菊酯等是我國無公害茶園防治假眼小綠葉蟬、茶尺蠖等的推薦首選品種，為保障茶葉產量和茶農創收做出了巨大貢獻。但其在茶葉和環境土壤中的殘留，也帶來了茶葉質量安全和環境污染隱患。

1999 年，Lewis 等［1］在《Nature》上發表了環境因素對手性農藥甲基-2，4-D丙酸降解的影響，提出環境中手性農藥潛在生物效應如毒性、致癌性、致突變性、內分泌干擾性以及環境中的持久性等大都具有對映體選擇性差異，引起了各國科學家的廣泛關注。國內外在手性農藥拆分［2-5］，水生生物急性毒性［6-7］，土壤［8-9］、水［10-11］及動物［12-14］、植物［15-17］體內選擇性降解環境行為等方面的研究較多。目前市場上大多數擬除蟲菊酯類農藥多以外消旋體銷售［18-19］，其中無活性功能的對映體存在，不僅增加了農藥的使用量，導致作物和食品中殘留量加大，而且會對非靶標生物產生負面影響［20］。近年來，大量手性擬除蟲菊酯類農藥對映體在水生生物毒性選擇性研究［21-23］表明，cis-聯苯菊酯和高效氯氟氰菊酯均存在對映體毒性選擇性差異。人體是由左旋氨基酸組成的生命體，不能很好地代謝右旋分子，因此攝入含有右旋分子的食品或藥物會成為人體代謝的負擔，甚至對生命造成危害。目前世界主要茶葉生產、消費國或地區對茶葉中cis-聯苯菊酯、高效氯氟氰菊酯的殘留量均設定了最大殘留限量值（maximum residue limit，MRL），介于0.01～25 mg·kg-1之間［24］，但僅對外消旋體的總量進行了限制，并未考慮不同對映體之間的差別。降解規律的研究往往也很少考慮對映體間的差異，如鮮葉上兩種手性農藥對映體之間的降解速度是否一致？歸趨是否相同？截至目前，針對茶葉和土壤中cis-聯苯菊酯和高效氯氟氰菊酯兩種菊酯類手性農藥對映體的同時檢測方法及其在茶鮮葉中選擇性降解行為研究仍鮮見報道。

本研究通過對色譜柱和提取條件進行優化，建立起不同茶葉、土壤中cis-聯苯菊酯和高效氯氟氰菊酯農藥手性對映體的殘留分析方法，并對方法學進行全面評價，旨在為進一步研究兩種農藥對映體在茶葉生長—加工—飲用過程中的選擇性降解行為提供精準可靠的技術手段。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Varian 3800 GC 氣相色譜儀（配備電子捕獲檢測器、1077 進樣口、8410 自動進樣器和Version 6.9.1 Saturn工作站），美國Bruker公司；Sigma 3k-5高速離心機，德國Sigma 公司；DFT-200 手提式高速萬能粉碎機，浙江溫嶺市林大機械有限公司；T18 高速均質勻漿儀，德國IKA公司；電子分析天平（0.000 1 g和0.01 g），瑞士梅特勒-托利多公司；R-210 旋轉蒸發儀，瑞士BUCHI公司；KQ-250DB 型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；玻璃柱管（18 mm I.D.×200 mm L.），杭州常盛科教器具廠；0.22 μm Filter Unit 濾膜，天津博納艾杰爾科技有限公司。

正己烷、丙酮（色譜純），美國Honeywell 公司；NaCl、無水Na2SO4（分析純），上海試四赫維化工有限公司；硅鎂型吸附劑（Florlisil 填料，60～100 目，使用前650 ℃烘4 h，冷卻后按10%比例加入純凈水密封振蕩混勻4 h，放置干燥器中備用），溫州市化學用料廠；Florisil 與GCB 混合柱：取5.0 g Florlisil 與0.10 g GCB混合均勻得混合物，按照1 g Na2SO4、Florisil+GCB 混合物、1 g Na2SO4，從下往上先后裝入玻璃柱管中，10 mL正己烷+丙酮（95∶5，V/V）預淋洗。

cis-聯苯菊酯和高效氯氟氰菊酯外消旋體標準品（R體∶S體=1∶1，98%），德國Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 色譜條件

色譜柱：Daicel ChiralPak?AS-H手性色譜柱（4.6 mm ID×250 mm×5 μm，日本Daicel 公司），Phenomenex?Cellulose-1 手性色譜柱和Phenomenex?Cellulose-3 手性色譜柱（4.6 mm ID ×250 mm×5 μm，美國Phenomenex公司），BGB-172 手性氣相色譜柱（30 m×0.25 mm ID×0.25 μm，瑞士BGB Analytik AG 公司），Cyclosil-B 手性氣相色譜柱（30 m×0.32 mm ID ×0.25 μm，美國安捷倫科技有限公司）；載氣為N2，流量2.0 mL·min-1；進樣口溫度：260 ℃；進樣量：1 μL；進樣方式：不分流進樣；ECD 檢測器溫度：300 ℃，CAP 模式；尾吹氣N2，流量50 mL·min-1；色譜柱升溫程序：初始180 ℃，保持5 min；以5 ℃·min-1升至230 ℃，保持80 min。

1.3 樣品處理

分別取粉碎后的茶葉（綠茶、紅茶、普洱茶、茶鮮葉）和土壤樣品，稱取5.00 g，加入正己烷+丙酮（4+1，V/V）混合溶液50 mL浸泡過夜，15 000 r·min-1均質勻漿提取1 min，加入2.0 g NaCl，混勻超聲10 min，過濾提取液轉移至圓底燒瓶，并用30 mL 提取溶劑重復提取殘渣1 次，合并2 次提取液，濃縮近干，5 mL 正己烷+丙酮（95+5，V/V）溶解上樣至Florlisil+GCB 混合柱，繼續用30 mL 正己烷+丙酮（95+5，V/V）洗脫接收，濃縮近干，環己烷+丙酮（70+30，V/V）超聲溶解定容1.5 mL，進樣1 μL，氣相色譜-電子俘獲檢測器（gas chromatographyelectron capture detector，GC-ECD）測定，外標法定量。

1.4 標準曲線與檢出限

分別稱取0.010 0 gcis-聯苯菊酯和高效氯氟氰菊酯外消旋體標準品至燒杯中，正己烷溶解并轉移到50 mL 容量瓶定容，配制成200 mg·L-1（對映單體濃度為100 mg·L-1）標準儲備液，-18 ℃下避光保存。將儲備液用正己烷稀釋成對映單體濃度為800、400、200、100、50、25、12.5、5.0、2.5 μg·L-1系列標準工作溶液，GC-ECD 進樣1 μL，以濃度為橫坐標x，對映體重復測定3 次色譜峰面積平均值為縱坐標Y，獲得cis-聯苯菊酯和高效氯氟氰菊酯兩對對映體溶劑標準曲線、線性相關系數及儀器檢出限。

1.5 添加回收率、精密度與方法定量限

分別稱取經測定不含cis-聯苯菊酯和高效氯氟氰菊酯殘留的空白綠茶（綠茶、紅茶、普洱茶、茶鮮葉）和土壤樣品5.00 g，分別添加外消旋體濃度為0.050、0.50 和5.00 mg·L-1標準溶液1.00 mL，相當于對映單體0.005、0.05 和0.50 mg·kg-1的3 個添加濃度水平，每個添加濃度平行試驗6 份，渦旋混勻后放置過夜以達到更接近于實際樣品，另外各自進行4 份空白試驗，按照1.3節進行提取凈化，其中3份空白用于配制對應濃度的基質標準溶液，作為基質標準進行測定，計算添加回收率、相對標準偏差及方法定量限，并通過基質標準溶液與溶劑標準溶液響應對比基質效應（matrix effect，ME），計算公式如下：

式中，A代表在純溶劑中對映單體的響應值；B代表基質標準溶液中對映單體的響應值。

2 結果與分析

2.1 手性色譜分離條件的選擇優化

為了實現cis-聯苯菊酯和高效氯氟氰菊酯兩對對映體一次進樣拆分并獲得對映單體，本研究首先對比了正相液相色譜條件下，20 ℃時不同類型色譜柱（Daicel ChiralPak?AS-H、Phenomenex?Lux 5 μm Cellulose-1和Phenomenex?Lux 5 μm Cellulose-3 柱）、不同流量（0.20～1.00 mL·min-1）及不同比例正己烷和異丙醇（99∶1～80∶20，V/V）對cis-聯苯菊酯和高效氯氟氰菊酯對映體的拆分效果。結果表明，Cellulose-1柱對cis-聯苯菊酯沒有拆分效果，對高效氯氟氰菊酯有一定的拆分效果，在1%異丙醇條件下即可拆分高效氯氟氰菊酯為兩個峰。增加異丙醇的比例可以改善峰型、減小峰寬、縮短保留時間，但會降低分離度，在20%異丙醇時僅能夠基本拆分高效氯氟氰菊酯。AS-H能拆分高效氯氟氰菊酯對映體，但對cis-聯苯菊酯無拆分效果。Cellulose-3 對cis-聯苯菊酯、高效氯氟氰菊酯對映體均有一定拆分效果，在20%異丙醇時實現對cis-聯苯菊酯對映體的拆分，但無法拆分高效氯氟氰菊酯對映體；隨著異丙醇比例和流動相流量的降低，高效氯氟氰菊酯對映體逐漸實現分離，cis-聯苯菊酯和高效氯氟氰菊酯對映體保留時間（retention time，tR）延長、分離度（resolution，Rs）增加、色譜峰變寬（表1）。在一定流動相條件下，干擾峰（tR=4.92 min）會對cis-聯苯菊酯-1（tR=5.32 min）造成干擾（圖1）。最終選取Phenomenex?Lux 5 μm Cellulose-3柱作為分析柱，正己烷+異丙醇（95∶5，V/V）在0.80 mL·min-1流量下進行拆分，0.25 mg·L-1標準溶液拆分效果見圖1，cis-聯苯菊酯兩個對映體tR分別為5.32和5.98 min，高效氯氟氰菊酯兩個對映體tR分別為11.22 和12.39 min，對映體分數（enantiomer fractions，EFs）分別為0.513和0.493。但本試驗對5 g茶葉樣品進行凈化后分析發現（圖1），正相液相色譜紫外檢測器法（normal high performance liquid chromatographyultra-violet，NHPLC-UV）雖然可以滿足對映體拆分的需要，但是茶葉基質富含咖啡堿等在紫外下強響應的雜質，前處理無法完全除去，導致背景響應高，對cis-聯苯菊酯和高效氯氟氰菊酯對映體掩蓋干擾嚴重，從而無法滿足殘留分析的需要。

表1 不同條件下Cellulose-3柱對cis-聯苯菊酯、高效氯氟氰菊酯對映體的拆分結果Table 1 The separation results for the enantiomers of cis-bifenthrin and lambda-cyhalothrin on Cellulose-3 column under different conditions

圖1 凈化后茶葉基質溶液與0.25 mg·L-1 cis-聯苯菊酯和高效氯氟氰菊酯對映體標準溶液對比HPLC-UV色譜圖Fig.1 The HPLC-UV chromatograms of purified tea matrix solution and 0.25 mg·L-1 solvent standard solution for enantiomers of cis-bifenthrin and lambda-cyhalothrin

ECD為破壞性檢測器，無法獲得對映體單體，但擬除蟲菊酯類農藥在GC-ECD 上有高靈敏度的響應，適合殘留分析。有研究表明，BGB-172 GC柱能很好地分離cis-聯苯菊酯手性對映體，并利用GC-ECD進行了環境水［25］、生物樣本［22］中的對映體殘留分析。在此基礎上，本研究對比了BGB-172 GC 柱和Cyclosil-B GC 柱對cis-聯苯菊酯和高效氯氟氰菊酯兩組手性對映體拆分的效果，優化了色譜升溫程序，對茶葉和土壤中cis-聯苯菊酯、高效氯氟氰菊酯手性對映體進行了殘留分析研究。結果表明，同樣條件下，Cyclosil-B GC柱無法拆分對映體，BGB-172 GC柱在不同升溫程序下有不同的分離效果，改變載氣類型氦氣（He）或氮氣（N2），BGB-172 GC 柱下對兩組手性對映體分離效果無明顯差別，最終選擇1.2 節色譜條件中色譜升溫程序，能實現對映體的基本分離用于殘留分析，色譜圖見圖2，此時cis-聯苯菊酯對映體tR分別為42.88 和43.32 min，高效氯氟氰菊酯對映體tR分別為59.69 和60.45 min，既能實現cis-聯苯菊酯和高效氯氟氰菊酯兩組手性對映體的同時拆分，又能滿足殘留分析的靈敏度需要，同時相對于文獻［26-27］縮短了對映體拆分時間。

圖2 空白紅茶樣品、0.005 mg·kg-1水平下紅茶添加樣品和0.016 7 mg·L-1紅茶基質標準溶液GC-ECD色譜圖Fig.2 The GC-ECD chromatograms of blank black tea，spiked black tea at 0.005 mg·kg-1，and black tea matrix standard solution sample at 0.016 7 mg·L-1 for cis-bifenthrin and lambda-cyhalothrin enantiomers

2.2 提取凈化方法的優化

進行手性農藥對映體殘留分析時，既要盡量完全分離對映異構體，又要避免雜質干擾。當采用GCECD 分析茶葉樣品時，由于ECD 是選擇性的高靈敏度檢測器，只對如含鹵素、硫、磷、氮的電負性物質有信號，而對電中性（無電負性）的物質，如烷烴等無信號，因此，茶葉和土壤中未凈化完全的大多數雜質在ECD上無明顯信號或者能被分離開，從而不會像在液相紫外檢測中那樣造成背景干擾。

本試驗用丙酮提取目標物，提取液濃縮近干后，采用5.0 g Florisil與0.10 g GCB混合柱凈化，加入0.10 g的GCB 用來吸附除去部分色素，既能節省試驗成本（相對于QuEChERs 等方法凈化），又能更多地去除咖啡堿、兒茶素等雜質共提物，在保證凈化效果的同時降低了后期ECD儀器的維護。由圖3可知，正己烷+丙酮（95+5，V/V）洗脫時回收率和凈化效果最佳。最終選擇對5 g 茶葉或土壤樣品加入正己烷+丙酮（4+1，V/V）混合溶液提取后，再利用5.0 g Florisil+0.10 g GCB 混合柱凈化，30 mL 正己烷+丙酮（95+5，V/V）作為洗脫劑進行洗脫接收，濃縮近干后，定容，GC-ECD檢測。

2.3 標準曲線、添加回收率、精密度和定量限

在1.2節色譜條件下，2.5～800 μg·L-1（2.5、5、12.5、25、50、100、200、400和800 μg·L-1）濃度范圍內，cis-聯苯菊酯對映體色譜峰面積（Y）與濃度（x）之間分別滿足線性方程Y=15 381.1x-279 657.5（r=0.996 7）和Y=17 387.6x-399 048.0（r=0.993 7），對映體分數EFs=0.489±0.017；在2.5～200 μg·L-1（2.5、5、12.5、25、50、100和200 μg·L-1）濃度范圍內，高效氯氟氰菊酯對映體色譜峰面積（Y）與濃度（x）之間分別滿足線性方程Y=22 083.8x-161 004.3（r=0.992 3）和Y=23 001.1x-167 694.8（r=0.992 2），對映體分數EFs=0.492±0.008。

在0.005、0.050和0.50 mg·kg-1（低、中、高）3個添加濃度水平下，按照1.5 節進行試驗，不同空白茶葉、土壤樣品中添加回收率和精密度結果見表2。結果表明，cis-聯苯菊酯、高效氯氟氰菊酯兩對手性對映體在不同茶葉、土壤中的平均添加回收率（average spiked recovery，A.R.）為61.6%～123.4%，相對標準偏差（relative standard deviations，RSDs）為2.5%～14.6%。其中綠茶中回收率為63.0%～88.3%，RSDs為5.7%～13.8%；紅茶中回收率為81.4%～121.7%，RSDs為2.5%～14.6%；普洱茶中回收率為61.6%～123.4%，RSDs為3.5%～11.7%；茶鮮葉中回收率為75.6%～102.6%，RSDs為4.6%～12.9%；土壤中回收率為68.3%～98.5%，RSDs為4.5%～14.2%。紅茶空白、低濃度添加和基質標準溶液色譜圖見圖2，儀器檢測限均低于1 μg·L-1，方法定量限均低于0.005 mg·kg-1。說明該方法能夠滿足茶葉和土壤中cis-聯苯菊酯、高效氯氟氰菊酯殘留檢測的需要。通過3 個濃度下基質標準與溶劑標準響應對比，未見到明顯的基質增強或減弱效應。因此，在實際測定時，可直接用溶劑標準進行定量，亦能確保定量準確度。

表2 GC-ECD測定不同茶葉和土壤樣品中cis-聯苯菊酯和高效氯氟氰菊酯對映體的平均添加回收率、相對標準偏差和定量限Table 2 The average spiked recoveries，relative standard deviations （RSDs） and limits of quantifications （LOQs） of cis-bifenthrin and lambda-cyhalothrin enantiomers in different tea，and soil samples by GC-ECD determination

2.4 兩組對映體在茶鮮葉中的降解實際樣品測定

利用建立的不同茶葉中手性農藥cis-聯苯菊酯和高效氯氟氰菊酯對映體殘留GC-ECD 分析方法，研究了茶園鮮葉噴藥cis-聯苯菊酯和高效氯氟氰菊酯農藥后，噴藥后分別間隔2 h 和1、2、3、5、7、10、14、21 d 后采樣，測定茶葉鮮葉中cis-聯苯菊酯和高效氯氟氰菊酯兩組手性對映異構體的殘留量，獲得其降解規律，結果表明，茶鮮葉中cis-聯苯菊酯兩個對映體殘留量（Y，mg·kg-1）與時間（X，d）之間的關系分別符合曲線Y=4.857 3e-0.2048X，R2=0.911 9，半衰期t1/2=3.38 d和Y=5.153 5e-0.2012X，R2=0.897 4，半衰期t1/2=3.44 d；高效氯氟氰菊酯兩個對映體殘留量（Y，mg·kg-1）與時間（X，d）之間的關系分別符合曲線Y=0.409 8e-0.2166X，R2=0.964 2，半衰期t1/2=3.20 d 和Y=0.401 7e-0.2164X，R2=0.963 6，半衰期t1/2=3.20 d，見圖4，通過半衰期可知，兩種菊酯類農藥對映體在茶鮮葉生長過程中的降解無明顯的選擇性差異。

圖4 茶鮮葉中cis-聯苯菊酯和高效氯氟氰菊酯對映體降解曲線Fig.4 The enantioselective degradation curve of cis-bifenthrin and lambda-cyhalothrin in fresh tea leaves

3 討論

目前針對擬除蟲菊酯類農藥對映異構體的分析通常是采用不同的色譜條件。Ye 等［3］系統總結了正相液相色譜條件下，單手性中心擬除蟲菊酯類農藥采用Chiralcel OD 柱和多手性中心擬除蟲菊酯類農藥采用串聯Chirex 00G-3019-OD 柱拆分的效果；劉一平等［28］采用Chiralcel?OD-H 色譜柱拆分了高效氯氟氰菊酯對映體；陸嫻婷等［26］采用Chiralcel OJ-H 柱拆分了cis-聯苯菊酯對映體；文獻［27，29］報道了采用手性氣相色譜柱BGB-172 分離氯氰菊酯對映體，但目前還未見采用一根色譜柱同時對cis-聯苯菊酯和高效氯氟氰菊酯對映體拆分的報道。本研究通過對比液相和氣相色譜條件下不同色譜柱分離測定效果，優化分析條件，最終實現了cis-聯苯菊酯和高效氯氟氰菊酯對映體的同時拆分。

茶葉基質復雜，富含咖啡堿、色素等雜質，因此，在對殘留農藥分析前進行提取、濃縮和凈化十分重要。目前，茶葉中cis-聯苯菊酯和高效氯氟氰菊酯殘留測定中前處理技術主要是固相萃取法和QuEChERS 方法，如王艷麗等［30］采用固相萃取結合氣相色譜-三重四極桿串聯質譜法測定茶葉中45 種農藥殘留；許芮菡等［31］采用QuEChERS 方法，即乙腈提取后多壁碳納米管凈化，最后采用氣相色譜-串聯質譜分析了茶葉中的擬除蟲菊酯類農藥殘留；國標GB 23200.113—2018［32］中也規定了茶葉中cis-聯苯菊酯和高效氯氟氰菊酯殘留分析的固相萃取法和QuEChERS前處理方法。相比固相萃取法，QuEChERS 方法較為簡單，應用性也更廣泛。本研究方法和許芮菡等［31］方法中測定cis-聯苯菊酯和高效氯氟氰菊酯的定量限（均為0.005 mg·kg-1）均低于國標GB 23200.113—2018（0.005 mg·kg-1），表現出良好的檢測靈敏度。而許芮菡等［31］采用改進的QuEChERS 方法提取凈化，采用乙腈提取茶葉樣品，乙腈會溶解并提取出各種極性與非極性目標物及雜質，雜質過多容易污染ECD 檢測器，同時乙腈還會損壞氣相色譜柱，需要轉換進樣溶劑為正己烷。而cis-聯苯菊酯和高效氯氟氰菊酯是弱極性農藥，本研究根據茶葉基質和待測成分理化特性，采用正己烷和丙酮混合溶劑作為提取溶劑，能夠有效減少極性雜質的提取量，利用正己烷與待測成分之間的相似相溶原理及丙酮的強浸潤性，從而保證了目標物的提取回收率和平行性，同時也降低了對ECD 檢測器的污染。此外，本研究方法可以明確分析兩種菊酯類農藥對映單體的含量，而許芮菡等［31］的方法和國標GB 23200.113—2018 均無法實現。

cis-聯苯菊酯和高效氯氟氰菊酯對映體在茶鮮葉生長過程中的降解無明顯的選擇性差異，主要是因為鮮葉基體作用下的對映體降解差異不顯著。鮮葉采摘后的加工過程復雜，溫度、濕度、pH、微生物等作用都可能導致對映體的選擇性降解，這將是后續研究的重點，即通過系統研究兩種菊酯類農藥對映體在茶葉生長-加工-飲用過程中的選擇性降解行為，為其更精準的風險評價提供基礎數據和技術支撐。

4 結論

本研究首次對比分析了正相液相色譜條件下，Daicel ChiralPak?AS-H、Phenomenex?Cellulose-1 和Cellulose-3 柱對cis-聯苯菊酯和高效氯氟氰菊酯兩組手性對映體的拆分效果，以及利用氣相色譜BGB-172柱同時分離測定效果，建立了茶葉和土壤中手性農藥cis-聯苯菊酯和高效氯氟氰菊酯對映體殘留同時分析的GC-ECD檢測方法，并應用于田間實際樣品檢測，結果發現本方法靈敏度高、穩定性好，能夠滿足茶葉和土壤中cis-聯苯菊酯和高效氯氟氰菊酯手性對映體殘留檢測的需要。