桑葉中1-脫氧野尻霉素降糖機制研究進展

王詩睿 趙 沖

（中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是由胰島素分泌缺陷或利用障礙導致血糖代謝紊亂，進而引起一系列生理反應的代謝性疾病，主要類型有1 型糖尿病（diabetes mellitus type 1，T1DM），為胰島素依賴型，主要由遺傳因素導致胰島素分泌不足所致；2 型糖尿病（diabetes mellitus type 2，T2DM），為非胰島素依賴型，絕大部分患者（＞90%）為該類型，主要特征是胰島素抵抗（insulin resistance，IR）；以及其他如妊娠糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）等［1］。

我國最新流行病學調查研究顯示，2013—2018 年間我國糖尿病患病率顯著增加，2013 年我國成人糖尿病患病率為10.9%，2018年已達12.4%，其中前期糖尿病患病率高達38.1%［2］。在全球范圍內，預計2045 年約有6.93 億人將受糖尿病的影響［3］。由此可見，糖尿病形勢嚴峻，亟需引起重視。糖代謝紊亂是糖尿病的重要病理學基礎，調節糖代謝、維持血糖平衡是治療糖尿病的重要途徑之一。但目前并沒有針對糖尿病的特效藥，且各種藥物具有一定的副作用，而通過健康飲食指導、正確的生活方式干預是除藥物外防治糖尿病的良好辦法。開發具有降糖功效且副作用小的食源性活性成分并研制保健產品、食品和藥物已成為降糖功能因子研究的熱點。

1 桑葉及桑葉提取物

桑葉是桑科植物桑（MorusalbaL.）的干燥葉，又名“神仙草”，2015 年被列入《食藥物質目錄》［4］。消渴癥是糖尿病早期癥狀之一。在中醫中早有利用桑葉治療消渴癥的記載，如《本草綱目》中有桑葉“汁煎代茗，能止消渴”“灸熟煎飲，代茶止渴”的說法［5］。大量試驗證明，桑葉具有良好的降血糖、預防和控制糖尿病的作用。劉國艷等［6］給予四氧嘧啶誘導的糖尿病模型小鼠桑葉水提取液，結果表明桑葉提取物能顯著降低糖尿病小鼠的血糖值，且存在劑量-效應關系。一項雙盲對照試驗發現，給予桑葉提取物的受試者血液中胰島素和丙二醛水平顯著降低，并提高了高密度膽固醇水平［7］。Cui等［8］研究表明，補充桑葉或桑葉提取物可顯著降低空腹血糖、糖化血紅蛋白以及空腹血漿胰島素水平。

隨著科學技術的不斷發展，對桑葉中活性成分的研究不斷深入，發現多具有良好的降糖功效。Ge 等［9］采用氣相色譜-質譜法鑒定了桑葉的202種成分，其中22 種對糖尿病及其并發癥具有顯著療效，包括桑葉黃酮、多糖和生物堿等活性成分。1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）是桑葉降糖的主要活性成分之一。

2 1-脫氧野尻霉素（DNJ）降糖功效

DNJ 是一種多羥基生物堿，可從桑葉和根皮中提取，也存在于其他植物和微生物中，結構為（2R，3R，4R，5S）-2-羥甲基-2，4，5-三羥基哌啶，分子式為C6H13NO，結構式見圖1［10］。

圖1 DNJ的化學結構Fig.1 Chemical structure of DNJ

目前已證明DNJ具有多種生理功能，如降脂、抗病毒、抗腫瘤等，其中研究和應用較為廣泛的是降血糖作用［11］。有研究顯示，每日給予高脂血癥小鼠50 mg·kg-1b.w.的桑葉DNJ 凍干粉可顯著降低小鼠餐后血糖、總膽固醇含量以及胰島素抵抗指數，還可改善糖尿病前期小鼠的糖脂代謝，降低患T2DM 的風險［12］。在高糖高脂飼喂聯合鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）注射的高血糖SD 大鼠模型中，灌胃給予大鼠一定量DNJ 6 周后，試驗組大鼠的血糖水平、腎肥大指數以及腎臟損傷程度均低于模型組［13］。自由飲用含10% DNJ 水的T2DM 模型小鼠的肝纖維化程度顯著降低［14］。在一項前瞻性研究中發現，12 mg 桑葉DNJ 是減輕餐后高血糖的最小有效劑量，可使空腹血糖降低3.86 mg·L-1，糖化血紅蛋白降低0.11%，同時未見明顯的胃腸道反應［15］。

上述研究表明，DNJ 對糖尿病前期和患糖尿病的動物模型均有良好的降血糖功效，同時可改善糖尿病帶來的多種并發癥，如肝、腎的損傷等。

3 DNJ降糖機制

3.1 抑制α-糖苷酶

α-葡萄糖苷酶可水解葡萄糖苷鍵釋放葡萄糖，在碳水化合物的消化中起著重要作用。DNJ對小腸黏膜上的α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用，可有效阻礙糖類分解，延緩腸道內單糖的吸收與利用，從而促使餐后血糖平穩［16］。李有貴等［17］利用液相色譜-質譜法（liquid choromatography-mass spectro meter，LC-MS）分離純化得到了純度大于95%的桑葉DNJ，進一步研究發現DNJ 對α-蔗糖酶表現為非競爭性抑制作用，其半抑制濃度IC50為5.67 mg·mL-1，抑制常數Ki為6.73 mg·mL-1。DNJ 純度越高，抑制作用越強，純度在15%左右時，其對α-葡萄糖苷酶的抑制作用優于阿卡波糖片（拜糖平）［18］。

DNJ主要通過與糖苷酶結合抑制其酶活性。有研究表明，DNJ 可與α-葡萄糖苷酶的Asp202、Glu271 和Asp333 殘基形成穩定的氫鍵，同時存在與Asn331 和His332 殘基的疏水作用和靜電吸引增強作用力，從而牢牢結合在α-葡萄糖苷酶口袋內部［19］。也有研究表明，DNJ 分子與α-葡萄糖苷酶中的Gln438、Arg437 和Phe455 結合位點相互作用形成6 個氫鍵，也能與異麥芽糖酶中的Gln279 和Val216 結合位點形成4 個氫鍵，抑制異麥芽糖酶的活性，但對α-葡萄糖苷酶的抑制作用強于對異麥芽糖酶的作用［20］。

郭時印等［21］模擬了生理條件下DNJ 與α-糖苷酶的相互作用，運用紫外光譜法、熒光光譜法、圓二色光譜法獲取蛋白質主鏈的二級構象信息，結果顯示DNJ能使α-糖苷酶的α-螺旋結構含量降低，而β-折疊、β-轉角和無規卷曲含量不同程度上升，即二級結構發生重排，誘導活性位點關閉，使底物與酶的結合作用減弱。

因此，DNJ 抑制α-葡萄糖苷酶活性的主要機制可能是與酶上的一些氨基酸殘基以氫鍵的形式結合，并通過疏水相互作用和靜電吸引加強作用力，改變了α-糖苷酶二級結構構象，發生重排，導致活性位點關閉、分解能力減弱。

3.2 影響肝臟糖脂代謝

肝臟是糖代謝的核心器官，具有雙向調節作用，能通過肝糖原的合成與分解、糖異生等途徑調節血糖。在正常情況下糖異生能補充糖供應的不足，維持血糖水平的穩定，但肝糖異生紊亂導致的葡萄糖生產和輸出增加，是糖尿病發病的重要原因。因此，抑制過度糖異生、減少內源性葡萄糖的生成對糖尿病的治療具有重要意義［22-23］。

胡雪芹［24］對DNJ 處理和未處理的db/db 小鼠肝臟基因表達情況進行分析，發現兩組小鼠基因表達的差異富集于42個信號通路217個代謝途徑，包括碳代謝、能量代謝通路等；同時利用定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）方法對糖、脂代謝有關的12 個基因和其他6 種酶蛋白基因進行驗證，結果顯示，DNJ可以顯著降低糖異生限速酶葡萄糖-6-磷酸酶（glucose-6-phosphatase，G6P）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK）的基因表達，同時上調己糖激酶（hexokinase，HK） mRNA表達。這3 個基因表達的變化表明DNJ 可以促進糖酵解、抑制糖異生。對高脂飼料誘導的高脂血癥小鼠灌胃DNJ 也有類似結果，且上調線粒體脂肪酸氧化限速酶肉堿棕櫚酰轉移酶1（carnitine palmitoyltransferase1，CPT1）活性，顯著減少了肝臟脂滴數量［25-26］。Li 等［27］利用LC-MS分析小鼠尿液，發現DNJ處理組尿液中3-磷酸甘油醛、半乳糖醇的含量顯著低于未處理組，而順烏頭酸的含量有所提高，表明DNJ 促進了葡萄糖進入三羧酸循環。在細胞水平也觀察到DNJ增加了HepG2細胞葡萄糖攝取［28］。上述結論與曾藝濤等［29］的研究結果一致，即DNJ 是通過上/下調肝臟中糖代謝限速酶的表達，而非直接激活來促進肝臟中葡萄糖的吸收和降解，減少葡萄糖的生成從而調節血糖。

3.3 保護胰島β細胞，降低胰島素抵抗

胰島素抵抗是指機體對胰島素生物調節作用的敏感性和/或反應性降低，也是T2DM 的主要病因［30］。T2DM早期細胞對葡萄糖的敏感性下降，胰島β細胞為代償則分泌更多的胰島素，增加β細胞負荷，易發生內質網蛋白錯誤折疊，引起內質網應激加速細胞凋亡和功能的衰竭［31］。DNJ 作用于糖尿病小鼠后，蘇木精-伊紅染色結果顯示胰島損傷減輕，并且內質網應激標志蛋白p-PERK 和p-eIF2Α 表達下降，表明DNJ 可抑制內質網應激直接保護胰島β 細胞，維持胰島素分泌功能［32］。

此外，DNJ 可增強靶器官對胰島素的敏感性。視黃醇結合蛋白-4（retinol-binding protein 4，RBP4）可作為胰島素抵抗的生物標志物，結合珠蛋白（haptoglobin，Hp）增加反映機體處于應激狀態。有研究表明，DNJ長期干預者的血漿RBP4和Hp水平更低，胰島素抵抗和炎癥降低［33］。骨骼肌是胰島素刺激狀態下葡萄糖吸收的主要部位，DNJ 提高了骨骼肌中葡萄糖攝取的蛋白表達，db/db 小鼠骨骼肌PI3K/AKT 信號通路被激活，從而促進葡萄糖轉運蛋白Glut4向膜的轉運，糖原合成酶激酶（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）增加，糖原合酶（glycogen synthase，GS）蛋白水平提高，肌肉的胰島素抵抗得以緩解［34-35］。脂肪細胞分化障礙可能引起胰島素抵抗的發生。過氧化物酶增殖體激活受體γ（peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ）是主要表達于脂肪組織的一種核轉錄因子，可調節脂肪細胞分化，在糖尿病的信號傳導中具有重要作用，DNJ 可增加脂肪細胞3T3-L1 中PPARγ 表達，促進分化［36］。同時，DNJ可促進多種細胞胰島素受體（insulin receptor，IR）和胰島素受體底物 1（insulin receptor substrate-1，IRS-1）蛋白磷酸化，激活胰島素信號通路［37］。

綜上所述，DNJ 可保護胰島β 細胞，維持胰島素分泌功能正常，同時影響胰島素靶器官相關因子的表達，調節胰島素信號通路相關蛋白，增強靶器官對胰島素的敏感性，從而促進糖脂代謝，維持血糖平衡。DNJ的主要降糖機制見表1。

表1 DNJ的主要降糖機制Table 1 Factors of response surface test design

4 結論與展望

桑葉作為藥食兩用的物質，具有很高的營養、保健和藥用價值，其獨特的功能作用吸引了越來越多人的關注。作為降血糖的功能性食品，多種形式以桑葉為原料的食品，如桑葉面、桑葉餅干、桑葉酒、桑葉飲料（例如：桑葉茶）等不斷上市，具有良好的研發前景［39］。但仍存在利用效率不高、效果不明顯或副作用強等現象。針對上述問題，提出以下幾點解決方法。

4.1 與其他物質協同作用

不同物質之間因作用方式、作用靶點不同，聯合使用后可能產生協同增效，同時可降低使用劑量，減少副作用。有研究發現，將DNJ 與葫蘆巴籽按一定比例混合后，可以上調PPARγ 的蛋白表達，進一步增加GLUT4 蛋白表達水平，協同促進細胞葡萄糖攝取，降低胰島素抵抗［40］。DNJ與黃芩素組合表現出明顯的協同抑制α-糖苷酶的作用，由于黃芩素作為變構抑制劑與α-糖苷酶發生非競爭位點結合，改變了蛋白活性位點構型，增加了DNJ 與酶的親和力［41］。同時，除DNJ外，桑葉中還含有許多其他降糖物質，如桑葉多糖具有抗氧化能力，可促進胰島β細胞修復，同時可促使肝糖原合成增加；DNJ-多糖可通過調節肝糖代謝降低高脂-鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠血糖［42］。目前，針對DNJ與其他活性成分相互作用是否具有協同或降低副作用的效果，以及如何配伍以起到精準降糖的作用仍有待深入研究。

4.2 更有效的DNJ提取方法

目前常用的DNJ 提取方法包括化學方法，如酸提法、醇提法等，但存在提取率低、對DNJ 破壞與分解的可能性大、費時費力等問題，因此，開發更高效、安全、提取率高的方法可能成為開發DNJ 相關產品的瓶頸。谷緒頂等［43］采用發酵里氏木霉提取桑葉DNJ，微生物預處理降解桑葉細胞壁纖維素的無定形區域，破壞細胞壁，使細胞中的DNJ易于釋放，提取率較蒸餾水浸泡組增加了18.20 倍，但該法會增加工業化生產提取桑葉DNJ 的成本。使用纖維素酶、果膠酶等酶可使植物細胞壁疏松、破裂，加速細胞內有效成分的釋放，提高植物活性物質的提取效率［44］。此外，為克服桑葉中DNJ 含量低以及化學合成困難等問題，微生物生產因其安全性高、生產成本低以及周期短等優勢，正成為一大趨勢［45］。

4.3 藥物緩釋，延長作用時間

DNJ 由消化道完整吸收再通過尿液進行排泄，在體內的半衰期僅約2 h，釋放不平穩，不僅藥效小，增加劑量還易導致胃腸道反應或血糖過度降低等副作用［46］。有研究表明，以羥丙基甲基纖維素酞酸酯或鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素為控釋包衣材料制成控釋微丸，可在設定時間內自動以設定的速度在體內進行釋放，增強DNJ的生物利用度［47-48］。因此，如何利用可生物降解機制延緩DNJ 的釋放時間，維持腸道DNJ 濃度，對提升DNJ的藥用價值具有重要意義。