基于海藻酸的包衣劑對(duì)甜玉米種子活力、抗氧化酶系統(tǒng)和產(chǎn)量的影響

吉狀狀 譚 韻 黃眾基 丁云倩 朱慶祥 金 鵬 王曉敏 趙光武

（浙江農(nóng)林大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)學(xué)院，浙江省農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)改良技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300）

甜玉米（ZeamaysL.）因種皮較薄、內(nèi)溶物質(zhì)均一、含糖量高等突出的食味品質(zhì)而廣受全球多個(gè)地區(qū)人們的喜愛(ài)。甜玉米的獨(dú)特風(fēng)味是由于胚乳基因發(fā)生了隱性突變，使淀粉積累少于普通玉米，同時(shí)導(dǎo)致種子活力較普通玉米更容易降低。較低的種子活力表現(xiàn)為發(fā)芽率低、苗期生長(zhǎng)弱、抗逆能力差等［1］，對(duì)甜玉米的品質(zhì)和產(chǎn)量造成更為嚴(yán)重的影響?；钚匝酰╮eactive oxygen species，ROS）是種子活力降低的主要因素之一。ROS 在種子中的積累會(huì)氧化損傷脂質(zhì)、DNA 和蛋白質(zhì)，進(jìn)而影響種子活力［2］。為應(yīng)對(duì)ROS 積累對(duì)細(xì)胞的損傷，植物體會(huì)啟動(dòng)抗氧化酶清除系統(tǒng)以保持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定微環(huán)境，該系統(tǒng)主要包括過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、抗壞血酸過(guò)氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）和過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）等［3］。目前，甜玉米種子活力低是制約甜玉米產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵問(wèn)題。

研究表明，種子包衣技術(shù)是一種提高種子活力的常用技術(shù)手段［4］。種子包衣中的功能成分包括多種物質(zhì)，如生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、殺蟲(chóng)劑、化肥和微生物。包衣劑可使有效成分精準(zhǔn)作用于種子周圍，提高功能物質(zhì)利用率，降低田間農(nóng)藥的噴施和大量肥料的施用，減少環(huán)境污染。種子包衣技術(shù)的合理利用對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、環(huán)境保護(hù)等具有重要意義。種子包衣處理有效減少了病蟲(chóng)害的發(fā)生，提高了作物產(chǎn)量和質(zhì)量［5］。

隨著現(xiàn)代種業(yè)技術(shù)的發(fā)展，包衣劑的種類和包衣方法呈多樣化趨勢(shì)，尤其是機(jī)械包衣技術(shù)的不斷改進(jìn)，使得種子包衣質(zhì)量及工作效率得到進(jìn)一步提高。但使用化學(xué)物質(zhì)作為種子包衣添加劑時(shí)極易對(duì)土壤、水資源和生物造成不利影響［6］，因此，開(kāi)發(fā)一種對(duì)環(huán)境友好的包衣劑配方以替代化學(xué)物質(zhì)是未來(lái)研究的重要方向。海藻酸是一種從褐藻等藻類中提取的天然多糖。該材料無(wú)毒、可生物降解，易于制備［7］。海藻酸及其衍生鹽在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用較為廣泛，主要是作為肥料被廣泛用于小麥［8］、水稻［9］、玉米［10］等作物上，能夠顯著促進(jìn)作物生長(zhǎng)發(fā)育、增加產(chǎn)量、改善品質(zhì)，最終提高經(jīng)濟(jì)效益。有研究表明海藻酸可促進(jìn)種子萌發(fā)和幼苗形態(tài)建成［11］。鑒于此，本研究以海藻酸為主要成分設(shè)計(jì)甜玉米包衣劑，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗(yàn)、抗氧化酶測(cè)定和田間驗(yàn)證等試驗(yàn)確定最佳方案，以期為甜玉米高質(zhì)量生產(chǎn)提供有效的播前處理技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)用甜玉米品種為浙江省推廣品種浙甜2088（ZT2088）和浙甜11（ZT11），均購(gòu)于杭州市臨安區(qū)綠娃娃種子有限公司。

以海藻酸（上海源葉生物科技有限公司）為主要成分設(shè)計(jì)三種包衣劑，包衣劑是以功能成分與成膜劑（北京禾泰華生物技術(shù)有限公司）按照1∶2.5 的比例組配；以未處理種子為對(duì)照。具體成分見(jiàn)表1。吡蟲(chóng)啉、噻蟲(chóng)嗪購(gòu)于先正達(dá)（蘇州）作物保護(hù)有限公司，MnSO4和6-芐氨基嘌呤（6-benzylaminopurine，6-BA）購(gòu)于南京化學(xué)試劑股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

智能光照培養(yǎng)箱，寧波賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司；恒溫烘箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰公司；熒光定量PCR儀，美國(guó)伯樂(lè)公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗(yàn) 室內(nèi)發(fā)芽試驗(yàn)在人工氣候培養(yǎng)箱中進(jìn)行，嚴(yán)格控制溫度和濕度。氣候條件設(shè)為：晝夜平均溫度均為25 ℃，12 h光照（光照強(qiáng)度150 μmol·m-2·s-1）/12 h黑暗交替培養(yǎng)，相對(duì)濕度在50%～60%左右。玉米種子平鋪在潤(rùn)濕的發(fā)芽紙上，卷起后放入自封袋中進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。該試驗(yàn)設(shè)置3 次重復(fù)。每個(gè)重復(fù)100 顆玉米種子。每天統(tǒng)計(jì)萌發(fā)種子數(shù)（以根達(dá)到種子長(zhǎng)、芽達(dá)到種子長(zhǎng)的一半為標(biāo)準(zhǔn)），到第7 天時(shí)統(tǒng)計(jì)發(fā)芽數(shù)后剪下幼苗烘干稱重，按照公式計(jì)算發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)（germination index，GI）和活力指數(shù)（vital index，VI）：

式中，Dt 為發(fā)芽日數(shù)；Gt 為與Dt 相對(duì)應(yīng)的每天發(fā)芽種子數(shù)。

式中，S 為一定時(shí)期內(nèi)（7 d）幼苗干重（g）；GI 為發(fā)芽指數(shù)。

1.3.2 抗氧化酶活性及MDA 含量測(cè)定 在種子萌發(fā)第7 天，取新鮮幼苗液氮冷凍備用，測(cè)定SOD、CAT、APX、POD 活性和丙二醛（malonaldehydic acid，MDA）含量，在1 g 冷凍組織中加入提取緩沖液（0.05 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液（pH值7.8）、0.1 mmol·L-1乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）和1% 聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）充分研磨。然后將勻漿轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，在4 ℃、10 000 r·min-1下離心15 min，吸取上清液到一個(gè)干凈的試管中，冰浴備用。SOD 活性通過(guò)氯化硝基四氮唑藍(lán)法測(cè)定［12］；CAT 活性根據(jù)Piechowiak 等［13］的方法進(jìn)行測(cè)定；POD活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定［14］；MDA 含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定［15］；APX活性采用抗壞血酸法測(cè)定［16］。

1.3.3 基因表達(dá)量測(cè)定 樣品處理同上，測(cè)定SC3中抗氧化酶相關(guān)基因的表達(dá)量，以未處理的種子為對(duì)照。RNA 的提取使用RNA 提取試劑盒（北京全式金生物技術(shù)公司）。使用Hifair Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix去除殘留基因組并合成cDNA（上海翌圣生物科技有限公司），實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative realtime PCR，qRT-PCR）采用SYBR qPCR 預(yù)混液（南京諾唯贊生物科技有限公司），每個(gè)樣本分3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，使用玉米管家基因ZmGAPDH作為內(nèi)參基因，檢測(cè)種子抗氧化酶相關(guān)基因ZmCAT1、ZmMSD3.4、ZmPOD5、ZmAPX1的相對(duì)表達(dá)量，具體引物信息見(jiàn)表2。相對(duì)表達(dá)量采用2-△△CT法計(jì)算。

表2 qRT-PCR引物Table 2 Primers for qRT-PCR

1.3.4 田間發(fā)芽率、產(chǎn)量及產(chǎn)量構(gòu)成測(cè)定 田間試驗(yàn)設(shè)置在浙江農(nóng)林大學(xué)天目山玉米育種基地。試驗(yàn)基地土壤以黃壤和紅壤為主，該地交通便利，地理坐標(biāo)為北緯30°19′～30°93′，東經(jīng)119°45′～120°92′。年平均氣溫18.9 ℃，年均降雨量1 613.9 mm，無(wú)霜期為324 d 左右。播種前包衣處理采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，小區(qū)面積為20 m2。種子于2022年4月7日直播，7月8日收獲玉米穗。播種間距為33.3 cm × 60.0 cm，單粒播種，每個(gè)小區(qū)96 穴。以未處理（CK1）和商品包衣劑噻蟲(chóng)嗪（CK2）為對(duì)照。水肥管理遵循當(dāng)?shù)氐牧?xí)慣和作物需求。播種14 d 后統(tǒng)計(jì)田間出苗率。在收獲階段，對(duì)玉米產(chǎn)量及產(chǎn)量構(gòu)成進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

百分率數(shù)值在進(jìn)行方差分析前需進(jìn)行反正弦平方根的轉(zhuǎn)換。采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行處理間差異的方差分析，采用最小顯著差異法（least significant difference，LSD）進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。應(yīng)用Origin 2021 軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 包衣處理對(duì)甜玉米種子活力的影響

由表3 可知，種子包衣處理可以提高種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)。在所用處理中SC3對(duì)種子活力的提高效果最明顯（圖1），SC3 處理較CK1顯著提高了ZT2088 和ZT11 種子的各項(xiàng)指標(biāo)，其中，ZT2088 的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率較CK1 分別提高11.4 和15.7 個(gè)百分點(diǎn)，發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)分別提高19.1%和53.9%，三個(gè)包衣劑處理的發(fā)芽勢(shì)之間無(wú)顯著差異，SC3 處理的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均顯著高于SC1 和SC2，但SC1 和SC2 之間無(wú)顯著差異。SC1 處理可以顯著提高ZT2088種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和活力指數(shù)，發(fā)芽指數(shù)雖未達(dá)到顯著水平但高于CK1。ZT11 中各指標(biāo)的變化趨勢(shì)與ZT2088基本一致。

圖1 ZT2088萌發(fā)表型Fig.1 Germination phenotype of ZT2088

表3 包衣處理對(duì)甜玉米種子活力的影響Table 3 Effect of coating treatment on seed vigor of sweet corn

2.2 包衣處理對(duì)甜玉米種子抗氧化酶系統(tǒng)的影響

由表4 可知，種子包衣處理可以提高種子的POD、CAT、SOD 和APX 活性，其中SC3 處理的提高效果整體最明顯，SC3處理較CK1整體提高了ZT2088和ZT11種子的抗氧化酶活性。對(duì)于ZT2088，經(jīng)SC3 處理后，POD、CAT、SOD和APX活性較CK1分別提高了74.5%、137.3%、29.5%和42.0%；SC1包衣處理可以顯著提高種子的POD、CAT 和APX 活性，相對(duì)于CK1 分別提高29.2%、84.7%和23.7%，SOD雖未達(dá)到顯著水平但高于CK1；SC2處理POD 活性最高，為452.6 U·g-1FW，顯著高于其他處理，相對(duì)于CK1提高74.5%；包衣處理可有效降低甜玉米種子MDA 含量，SC1、SC2 和SC3 相對(duì)于CK1 分別降低23.1%、35.9%和43.6%，SC3 中MDA 含量最低，為2.2 μmol·kg-1FW。ZT11 中各指標(biāo)的變化趨勢(shì)與ZT2088基本一致。

表4 包衣處理對(duì)甜玉米種子抗氧化酶活性及MDA含量的影響Table 4 Effects of coating treatment on antioxidant enzyme activity and MDA content of sweet corn seeds

由圖2可知，ZmAPX1在兩個(gè)品種的種子中的表達(dá)量高于其他基因。ZmMSD3.4在種子中的表達(dá)量最低。在ZT2088中，SC3處理種子中ZmAPX1、ZmMSD3.4、ZmCAT1和ZmPOD5的表達(dá)量較CK1分別升高55.6%、35.8%、74.7%和31.3%；SC3 處理種子中ZmCAT1的表達(dá)量提高幅度最大，ZmPOD5的表達(dá)量提高幅度最小。在ZT11 中，SC3 處理種子ZmAPX1、ZmMSD3.4、ZmCAT1和ZmPOD5的表達(dá)量較CK1分別升高74.2%、42.5%、57.9%和21.8%，其中ZmAPX1的表達(dá)量增加量最高，ZmPOD5的表達(dá)量增加量最低。

圖2 SC3處理對(duì)甜玉米ZmAPX1、ZmMSD3.4、ZmCAT1和ZmPOD5基因表達(dá)量的影響Fig.2 Effects of SC3 treatment on the expression levels of ZmAPX1、ZmMSD3.4、ZmCAT1 and ZmPOD5 genes in sweet corn

2.3 種子包衣對(duì)甜玉米田間出苗、產(chǎn)量及產(chǎn)量構(gòu)成的影響

由圖3可知，甜玉米種子包衣處理可提高種子的田間發(fā)芽率。SC3處理ZT11和ZT2088的田間出苗率最高，分別為84.4%、86.5%，相對(duì)于CK1和CK2分別提高9.3～11.7和2.8～5.1個(gè)百分點(diǎn)。由表5可知，對(duì)于ZT2088，SC3 處理的產(chǎn)量最高，為709.0 kg·667 m-2，相對(duì)于CK1 和CK2 分別提高7.3%和2.5%；包衣處理與CK2之間無(wú)顯著差異；SC3 處理穗數(shù)最高，為3 133.9，相對(duì)于CK1和CK2分別提高7.0%和1.9%，顯著高于SC1和SC2。品種中各處理之間單穗重均無(wú)顯著差異；SC3處理的產(chǎn)量和穗數(shù)均最高，且顯著高于CK1。

圖3 包衣處理對(duì)甜玉米種子田間出苗率的的影響Fig.3 Effect of coating treatment on field emergence rate of sweet corn seeds

表5 包衣處理對(duì)甜玉米產(chǎn)量及產(chǎn)量構(gòu)成的影響Table 5 Effects of coating treatment on yield and yield components of sweet corn

3 討論

3.1 種子包衣對(duì)甜玉米種子活力的影響

種子包衣處理可刺激種子的萌發(fā)和生長(zhǎng)，增強(qiáng)作物對(duì)逆境的抗性［17］。使用功能物質(zhì)包衣可以保護(hù)種子免受病原體的影響，同時(shí)保障營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)以促進(jìn)植物發(fā)育［18］。本研究以海藻酸為主要包衣成分對(duì)甜玉米種子進(jìn)行包衣處理，發(fā)現(xiàn)經(jīng)海藻酸包處理后可以提高種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和活力指數(shù)，其中ZT2088 活力指數(shù)較CK1提高了28.9%，發(fā)芽指數(shù)與CK1之間差異不顯著。與Afzal等［19］的研究結(jié)果類似，即包衣可以改善種子的出苗率。目前已有許多研究表明海藻提取物可以促進(jìn)種子萌發(fā)［20］。如Fu等［21］研究表明，海藻酸鹽包衣減少了苜蓿種子和幼苗的細(xì)菌攜帶量；Sarrocco等［22］研究發(fā)現(xiàn)，使用海藻酸鈉進(jìn)行種子包衣能提高種子耐貯性和田間出苗率。結(jié)合本研究結(jié)果，推測(cè)海藻提取物對(duì)種子萌發(fā)的促進(jìn)作用可能與其含有海藻酸有關(guān)。

加入微量元素、植物激素和吡蟲(chóng)啉后種子各項(xiàng)活力指標(biāo)均有提高，以SC3 效果最好，且顯著高于SC1 處理。可能是由于抗病蟲(chóng)害藥劑和微量元素的加入提高了種子的田間抗逆能力，種子包衣劑中的抗病蟲(chóng)藥劑和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)會(huì)直接釋放到種子周邊土壤中，可有效防止種傳病害和土傳病害的傳播，同時(shí)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，保障植株的生長(zhǎng)和發(fā)育［23］。相關(guān)研究表明，簡(jiǎn)單的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包衣對(duì)種子的活力改善不明顯，但與殺菌劑聯(lián)合使用后可達(dá)到顯著效果［24］。可見(jiàn)，多種功能成分的共同作用對(duì)種子活力的提高要顯著高于單一成分的使用，后續(xù)研究中可增加其他功能物質(zhì)以驗(yàn)證各種成分之間的協(xié)同作用對(duì)種衣劑作用效果的影響，最終形成更為高效、環(huán)保的種子包衣劑。

3.2 種子包衣對(duì)甜玉米種子抗氧化酶系統(tǒng)的影響

針對(duì)種子活力的影響因素研究較多，目前認(rèn)為ROS 是影響種子活力形成和保持的重要因素［2］。本研究測(cè)定了以海藻酸為主的甜玉米包衣處理后種子中的抗氧化酶活性，研究發(fā)現(xiàn)SC1 處理有效提高了POD、CAT、APX 的活性，SC2 的POD 活性最高；SC2、SC3 的SOD、CAT 和APX 活性較高，均顯著高于對(duì)照處理。Fang 等［25］的研究同樣表明包衣劑能夠提高植物抗氧化酶的活性，增強(qiáng)幼苗根系的活性。李防洲等［26］研究表明，種子包衣處理增加了SOD、CAT 和POD 活性，降低了低溫脅迫下植物細(xì)胞中ROS 水平。MDA 是脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，會(huì)損傷生物膜結(jié)構(gòu)，抑制其正常功能［27］。種子中MDA 的含量在一定程度上反映了種子脂質(zhì)過(guò)氧化程度。本研究表明，SC3 處理后ZT2088 種子中MDA 含量相對(duì)CK1 顯著降低43.6%。說(shuō)明SC3 處理后種子膜脂過(guò)氧化程度較低，有利于保持種子活力。在SC3 處理下，與抗氧化能力有關(guān)的基因ZmAPX1、ZmMSD3.4、ZmCAT1、ZmPOD5的表達(dá)量增加，且與酶活性數(shù)據(jù)吻合，說(shuō)明該處理通過(guò)調(diào)節(jié)基因表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育以及防御機(jī)制。前人研究表明，與抗氧化酶相關(guān)的基因ZmAPX1［28］、ZmMSD3.4［29］、ZmCAT1［30］、ZmPOD5［31］表達(dá)量升高會(huì)進(jìn)一步提高APX、SOD、CAT、POD 活性，減少細(xì)胞內(nèi)ROS 含量，增強(qiáng)植物抗逆能力，與本研究結(jié)果一致。綜上，增加抗氧化酶活性是SC3 處理提高甜玉米種子活力的重要因素。

3.3 包衣處理對(duì)甜玉米田間發(fā)芽率、產(chǎn)量及其構(gòu)成的影響

種子包衣是在種子中形成一層含有特定功能成分（如殺蟲(chóng)劑、生物和微量營(yíng)養(yǎng)素）的包膜，本研究使用組合包衣劑可有效提高種子田間發(fā)芽率，以SC3 效果最好，顯著高于CK1，高于CK2 但未達(dá)到顯著差異。SC3的產(chǎn)量顯著高于對(duì)照。種子包衣處理對(duì)單穗重影響較小，但對(duì)每畝穗數(shù)影響較大，SC3 較CK1 顯著提高了甜玉米的穗數(shù)。Dawid 等［32］研究發(fā)現(xiàn)海藻酸復(fù)合包衣可刺激玉米的早期生長(zhǎng)，從而提高作物產(chǎn)量，與本研究結(jié)果相似。Szparaga［33］研究發(fā)現(xiàn)，包衣處理可顯著增加大豆的產(chǎn)量（提高10%以上）和產(chǎn)量構(gòu)成（單株莢數(shù)、每莢粒數(shù)）。此外，包衣處理在水稻等作物中同樣具有較好的應(yīng)用效果［34］。綜上所述，種子包衣處理在多種作物上均取得良好效果。因此，結(jié)合海藻酸理化性質(zhì)、生物活性與本研究結(jié)果，進(jìn)一步研究以海藻酸為主的配套栽培措施具有重要實(shí)踐意義。

4 結(jié)論

本研究表明，SC3（海藻酸、硫酸錳、6-BA 和吡蟲(chóng)啉）包衣處理可以提高甜玉米種子活力，使得甜玉米的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均有一定程度提高。同時(shí)大田試驗(yàn)表明，包衣處理可有效提高甜玉米的田間出苗率，且ZT2088 的SC3 田間出苗率比商用包衣劑高出6.4%，SC3 處理甜玉米產(chǎn)量（鮮重）顯著高于CK1。包衣處理可提高甜玉米種子中抗氧化酶活性（POD、SOD、CAT 和APX），同時(shí)提高種子中抗氧化酶相關(guān)基因的表達(dá)。SC3 對(duì)種子活力的提高可能與較高的抗氧化酶活性有關(guān)，同時(shí)良好的幼苗建成為產(chǎn)量提高提供了前提條件。