一株不動桿菌JBX-006對聚丙烯酰胺的降解特性研究*

王 睿 朱子恒 舒文明 余維初 孫文秀#

(1.長江大學生命科學學院,湖北 荊州 434025;2.長江大學化學與環境工程學院,湖北 荊州 434025)

聚丙烯酰胺(PAM)是一種線型水溶性高分子聚合物,是丙烯酰胺均聚物與共聚物的統稱,溶于水后具增稠性、減阻性、增黏性、助留性等性能,被廣泛應用在石油開采、水處理、紡織和造紙等領域[1-4]。研究表明,PAM在油田生產提高開采率后大量殘存于廢棄的采出液中,排放入土壤環境后會緩慢降解為丙烯酰胺,進而改變地下水的理化性質,對人和動物的大腦造成毒害作用[5-6]。然而,如何高效降解PAM仍是目前亟需解決的問題。

近年,PAM污染土壤的修復主要采用化學降解法[7]。化學降解法能夠將大部分PAM降解成小分子有機物,但投資和運行成本較高,易造成二次污染[8-9]。生物降解因其無污染、低成本的特點成了聚合物無害化處理的新途徑,受到了很多研究者的關注[10-11]。因此,從不同環境中分離微生物來降解PAM也就成了該領域的研究熱點[12]。從含PAM的廢水及污泥中分離到的芽孢桿菌(Bacillussp.)[13]72,[14]、克雷伯氏菌(Klebsiellasp.)[15]、梭菌(Clostridiumbifermentans)[16]等可以在一定程度上降解PAM,但降解率不高。改變培養時的營養條件等可以促進微生物對PAM的降解[17-18]。夏彥淵等[19]發現優化碳源、氮源、培養溫度后,混合菌對PAM的降解率明顯提高,可達到32.6%。李淑芹等[20]發現在以PAM為唯一碳氮源條件下,優化培養溫度和初始pH可以提高枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)對PAM的降解率,最高降解率可達45.04%。但實際上上述研究中的微生物降解PAM的效率仍然偏低,難以在實際應用中達到長效修復的目的。有研究發現,金屬離子可以與PAM鏈上的羧酸根陰離子發生靜電相互作用,也可以與水中溶解氧共同作用斷裂PAM骨架,從而使PAM降解[21],這為進一步提高微生物對PAM的降解率提供了新的思路。

因此,本研究從大慶油田周邊土壤樣品中分離出1株PAM降解效果最好的細菌,采用單因素和正交試驗分析了外碳源、外氮源、金屬離子等因素對其降解PAM的影響,弄清其降解特性,以期為提高微生物降解PAM提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌種來源

菌種分離自大慶油田周邊土壤。

1.1.2 培養基

富集培養基:酵母粉5.00 g/L,胰蛋白胨10 g/L,NaCl 10.0 g/L,調pH為7。

馴化培養基:一定濃度的PAM,酵母粉0.05 g/L,NaCl 0.5 g/L,K2HPO41.0 g/L,MgSO40.1 g/L,調pH為7。

基礎培養基:PAM 300 mg/L,NaCl 5.0 g/L,K2HPO40.5 g/L,KH2PO40.5 g/L,MgSO40.1 g/L,調pH為7。

營養培養基:PAM 300 mg/L,酵母粉5.00 g/L,胰蛋白胨10.0 g/L,NaCl 10.0 g/L,瓊脂15 g/L,調pH為7。

牛肉膏蛋白胨固體培養基:牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5.0 g/L、瓊脂15 g/L,調pH為7。不加瓊脂則為牛肉膏蛋白胨液體培養基。

1.2 方 法

1.2.1 PAM降解菌的分離、富集和馴化

稱取3 g土壤接種于100 mL富集培養基中,在30 ℃、140 r/min的振蕩條件下培養48 h得到富集菌液。取5 mL富集菌液接種于100 mL含0.6 g/L PAM的馴化培養基中,同樣在30 ℃、140 r/min的振蕩條件下培養7 d,再取5 mL馴化液依次轉接到含0.9、1.2、1.5、1.8、2.0 g/L PAM馴化培養基中,逐級馴化培養。取最終馴化液1 mL涂布在營養培養基上,30 ℃下倒置培養24 h。挑取平板上不同菌落在牛肉膏蛋白胨固體培養基中進行劃線培養,將純化的單菌落接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基中,30 ℃培養24 h,加入與菌液體積相同的30%(質量分數)無菌甘油,分裝至菌種保存管(1 mL/管),-80 ℃保存備用。

1.2.2 測定并計算PAM降解率

采用淀粉-碘化鎘分光光度法[22]測定PAM并計算降解率。

1.2.3 PAM降解菌的形態學與生理生化鑒定

將分離得到的單菌落接種到牛肉膏蛋白胨固體培養基上30 ℃恒溫培養24 h后,觀察菌落的大小、形狀等特征[23]。同時,把上述分離得到的單菌制備成涂片標本,經革蘭氏染色后觀察細菌形態;進行葡萄糖產酸、H2S產生、檸檬酸鹽利用、淀粉利用、硝酸鹽還原實驗、VP實驗、吲哚實驗、甲基紅實驗、明膠利用、蔗糖利用、鼠李糖利用等生理生化鑒定[24]。

1.2.4 PAM降解菌的分子生物學鑒定

采用TIANGEN細菌基因組脫氧核糖核酸(DNA)試劑盒提取供試菌株的DNA,利用通用引物16F(5’-AGAGTTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和16R(5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’)對細菌的16S rDNA進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增,擴增體系(50 μL):2×Taq PCR Master Mix 25 μL,引物16F和16R(10 μmol/L)各2 μL,模板DNA 2 μL,雙蒸水19 μL;擴增條件:95 ℃預變性5 min后,95 ℃變性30 s,53 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,34個循環,再72 ℃延伸10 min。通過瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像檢測條帶大小,擴增產物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序,所得結果經美國國家生物信息中心(NCBI)數據庫比對后,挑選相關序列,在MEGA 7.0軟件中采用鄰近法構建系統發育樹。

1.2.5 不同外碳源對降解PAM的影響

以營養培養基中酵母粉的濃度為參考,分別在基礎培養基中加入5 g/L葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖、乙酸鈉作為外碳源,并以原基礎培養基作為對照。準確量取50 mL上述基礎培養基置于150 mL錐形瓶中,接種2%(體積分數,下同)菌液后置于30 ℃、140 r/min搖床中振蕩培養5 d,測定PAM并計算降解率。

1.2.6 不同外氮源對降解PAM的影響

以營養培養基中胰蛋白胨的濃度為參考,分別在基礎培養基中加入10.0 g/L脲、硝酸鉀、酵母粉、蛋白胨、氯化銨作為外氮源,并以原基礎培養基作為對照。準確量取50 mL上述基礎培養基置于150 mL錐形瓶中,接種2%菌液后置于30 ℃、140 r/min搖床中振蕩培養5 d,測定PAM并計算降解率。

1.2.7 金屬離子對降解PAM的影響

以不加金屬離子的基礎培養基為對照,分別在基礎培養基中添加Fe3+、Mn2+、Fe2+、Cu2+(金屬離子質量濃度均為30 mg/L[25]115)。準確量取50 mL上述基礎培養基置于150 mL錐形瓶中,接種2%菌液后置于30 ℃、140 r/min搖床中振蕩培養5 d,測定PAM并計算降解率。

1.2.8 單因素試驗初步探究外碳源、外氮源和金屬離子的量

準確量取50 mL基礎培養基置于150 mL錐形瓶中,接種2%菌液后分別加入1、3、5、7、9 g/L的最優外碳源,置于30 ℃、140 r/min搖床中振蕩培養5 d,研究影響降解PAM的最優外碳源量。同樣的方法考察不同最優外氮源、最優金屬離子的量,最優外氮源考察了2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 g/L,最優金屬離子考察了10、20、30、40、50 mg/L。

1.2.9 正交試驗確認外碳源、外氮源和金屬離子的量

在單因素試驗初步確定外碳源蔗糖、外氮源硝酸鉀和金屬離子Fe2+的量基礎上,采用正交試驗設計進一步確認它們的量。正交試驗的因素和水平設計如表1所示。

表1 正交試驗因素和水平

2 結果與分析

2.1 PAM降解菌的分離與鑒定

從大慶油田周邊土壤中分離到11株PAM降解菌,分別命名為JBX-001～JBX-011,它們的原始PAM降解率依次為29.59%、22.66%、33.78%、21.64%、40.56%、42.24%、39.30%、28.62%、23.08%、29.93%、28.03%,可見JBX-006的原始PAM降解率最高,因此以JBX-006為PAM優勢降解菌,因此對JBX-006進一步富集和馴化。

通過牛肉膏蛋白胨固體培養基培養觀察發現,JBX-006菌落呈圓形,大小2～3 mm,表面濕潤有隆起,菌落淡黃,不透明,邊緣光滑平整。

生理生化鑒定表明,JBX-006的革蘭氏染色、葡萄糖產酸、H2S產生、硝酸鹽還原實驗、VP實驗、吲哚實驗、甲基紅實驗均為陰性,能夠利用檸檬酸鹽和淀粉,不能利用明膠、蔗糖和鼠李糖。由菌落形態學與菌株生理生化鑒定結果可初步判定JBX-006為不動桿菌屬(Acinetobacter)。

瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像檢測發現,在1 500 bp左右有一特異性條帶。測序結果表明,菌株JBX-006的16S rDNA長度為1 493 bp,經NCBI 數據庫比對,與不動桿菌屬的相似度達到99%。采用鄰近法構建系統發育樹(見圖1),JBX-006與不動桿菌屬聚為一類,根據距離可確定為瓊氏不動桿菌(Acinetobacterjunii)。該菌在30 ℃、pH 7.0左右時,7 d可對水體中十六烷烴降解率高達75%[26]。

圖1 JBX-006的系統發育樹

2.2 PAM優勢降解菌JBX-006的降解特性

2.2.1 外碳源對不動桿菌JBX-006降解PAM的影響

碳是構成生物體的必需元素,碳源是影響PAM降解菌生長和降解性能的重要營養物質。PAM是高分子有機物,微生物利用外碳源才能更好地釋放特定酶使PAM酰胺鍵斷裂,變為小分子物質[27]。從圖2可以看出,不同外碳源會影響JBX-006對PAM的降解效果。加入蔗糖、可溶性淀粉和乙酸鈉可以提高JBX-006對PAM的降解率,降解率分別為70.66%、59.17%、44.41%,比對照分別增加27.54、16.07、1.30百分點,而加入葡萄糖和乳糖后,JBX-006對PAM的降解率反而降低,因此蔗糖可作為最優外碳源。

圖2 不同外碳源對PAM降解的影響

2.2.2 外氮源對不動桿菌JBX-006降解PAM的影響

氮亦是構成生物體的必需元素,氮源影響著PAM降解菌的生長和降解性能。有研究發現,當含有PAM的環境中添加外氮源后,微生物會利用添加的外氮源快速生長,釋放酰胺酶切斷PAM的酰胺鍵,然后再利用由此產生的氮源大量繁殖,加快降解PAM的速度[28]。從圖3可以看出,不同氮源也會影響JBX-006對PAM的降解效果。加入硝酸鉀可以提高JBX-006對PAM的降解率,降解率為52.18%,比對照增加9.08百分點,但加入脲、蛋白胨、酵母粉、氯化銨后,JBX-006對PAM的降解率降低。因此,硝酸鉀為最優外氮源。

圖3 不同外氮源對PAM降解的影響

2.2.3 金屬離子對不動桿菌JBX-006降解PAM的影響

金屬離子是影響微生物降解PAM的一個重要因素,特別是無機鹽可為微生物機體提供生命活動必需的無機離子,起到參與酶合成、調節滲透壓平衡等作用[25]117。由圖4可知,不同的金屬離子對PAM降解有較大影響。加入Cu2+、Mn2+、Fe3+后,JBX-006對PAM的降解率降低,這可能是因為金屬離子與PAM發生化學交聯,形成不溶的聚合物膠團,使得JBX-006不能很好地利用PAM。但是,Fe2+可以促進JBX-006降解PAM,使PAM降解率相比對照提高25.08百分點,這與卞立紅等[25]116報道的研究結果基本一致。由此確定Fe2+為最優金屬離子。

圖4 不同金屬離子對PAM降解的影響

2.2.4 單因素試驗結果

由圖5可見,在試驗范圍內,當基礎培養基中加入不同濃度的蔗糖、硝酸鉀和Fe2+時,JBX-006對PAM的降解率均呈先升高后降低的趨勢,可以發現最優蔗糖添加量為5 g/L、最優硝酸鉀添加量為10.0 g/L、最優Fe2+添加量為30 mg/L。

圖5 蔗糖、硝酸鉀、Fe2+添加量對PAM降解的影響

2.2.5 正交試驗結果

JBX-006降解PAM的正交試驗結果見表2,通過極差分析發現,蔗糖的影響最大,Fe2+的影響最小,蔗糖、硝酸鉀、Fe2+的最優添加量分別為5 g/L、10.0 g/L、30 mg/L,與單因素試驗結果一致。在正交試驗得到的最佳條件下,驗證發現,JBX-006對PAM的降解率可達81.65%,遠高于對照,也高于前人報道的不同細菌對PAM的降解率[13]74。

表2 正交試驗結果

3 結 論

在大慶油田周邊土壤中富集、馴化、分離獲得1株可高效降解PAM的優勢菌JBX-006,經形態學、生理生化和分子生物學鑒定為瓊氏不動桿菌。該菌株生長的最優外碳源、最優外氮源和最優金屬離子分別是蔗糖、硝酸鉀和Fe2+,在5 g/L蔗糖、10.0 g/L硝酸鉀、30 mg/L Fe2+的最優條件下,30 ℃培養5 d對300 mg/L的PAM的降解率可達81.65%。