調(diào)控配位不飽和位點(diǎn)增強(qiáng)鋯基金屬有機(jī)框架納米酶的蛋白水解酶活性及應(yīng)用

許珂宇 夏利偉 邢克宇 程云輝,2 許 宙

(1. 長(zhǎng)沙理工大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 410114;2. 齊魯工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 濟(jì)南 250353)

微生物蛋白酶是食品工業(yè)中的主要酶類之一,占整個(gè)酶類市場(chǎng)的65%[1-3]。然而,微生物生產(chǎn)蛋白酶仍存在許多問(wèn)題,如菌種培育操作復(fù)雜、環(huán)境要求嚴(yán)格、純化過(guò)程繁瑣、生產(chǎn)成本高昂等。此外,在貯藏和應(yīng)用過(guò)程中,pH值和溫度條件更是嚴(yán)重限制了微生物蛋白酶在工業(yè)中的發(fā)展[4]。由于納米酶不具有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),所以各種環(huán)境因素(如pH值和溫度)對(duì)納米酶的催化活性中心造成的破壞性較小。因此,納米酶具有高選擇性[5]、穩(wěn)定性和潛在可回收性[6-7],可以降低食品工業(yè)中酶催化的經(jīng)濟(jì)成本[8]。

蛋白水解酶納米酶是一種具有蛋白水解酶活性的納米酶,已在寡肽和蛋白質(zhì)水解過(guò)程中顯示出高選擇性[9-10]。然而,這些蛋白水解酶納米酶的活性相對(duì)較低,嚴(yán)重阻礙了蛋白水解酶納米酶的實(shí)際應(yīng)用。

金屬有機(jī)框架(MOFs)是一種新興的多孔納米材料[11-12],是由金屬離子或金屬團(tuán)簇和多種有機(jī)配體通過(guò)配位構(gòu)建的[13-14]。因此,通過(guò)改變金屬團(tuán)簇和有機(jī)配體類型,MOFs的結(jié)構(gòu)和性能(如納米級(jí)孔隙率、高表面積、良好的熱穩(wěn)定性和均勻的空腔結(jié)構(gòu))可以被調(diào)整。目前,Zr-MOFs作為催化劑已被用于肽鍵的水解[15-17]。然而,大多數(shù)Zr-MOFs中金屬離子與有機(jī)配體完全配位,這種微觀結(jié)構(gòu)阻礙了Zr-MOFs對(duì)肽的吸附,嚴(yán)重影響了Zr-MOFs的催化性能。有研究[18-19]表明,MOFs的催化性能可以通過(guò)改變?nèi)毕荻惶岣?而不同的缺陷可以通過(guò)調(diào)整配位不飽和金屬位點(diǎn)(CUSs)來(lái)實(shí)現(xiàn)。最常見(jiàn)的CUSs調(diào)控方法是在MOFs合成過(guò)程中使用不同的有機(jī)配體[20]。

研究擬通過(guò)簡(jiǎn)便的水熱法制備3種具有不同配位不飽和位點(diǎn)的Zr-MOFs納米酶(12-配位Zr-MOF、6-配位Zr-MOF和4-配位Zr-MOF),利用掃描電子顯微鏡(SEM)、動(dòng)態(tài)光散射(DLS)、傅里葉變換紅外光譜(FTIR)和X射線衍射(XRD)來(lái)表征Zr-MOF納米酶的特征。以雙甘肽(Gly-Gly)水解率為指標(biāo),評(píng)估3種Zr-MOFs納米酶的蛋白水解酶活性,并于食品工業(yè)中3種常見(jiàn)的蛋白質(zhì)(大豆蛋白、魚糜蛋白和酪蛋白)中驗(yàn)證Zr-MOFs納米酶的實(shí)際應(yīng)用能力,以期為食品工業(yè)中蛋白水解提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

四氯化鋯(ZrCl4)、八水合二氯氧化鋯(ZrOCl28H2O)、對(duì)苯二甲酸(BDC)、均苯三甲酸(H3BTC)、[1,1′:4′,1″]三聯(lián)苯-3,3″,5,5″-四甲酸(TPTC):北京百靈威科技有限公司;

大豆分離蛋白、酪蛋白、魚糜蛋白、N,N-二乙基甲酰胺(DEF)、苯異硫氰酸酯(PITC):上海麥克林科技有限公司;

N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、無(wú)水乙醇、溴化鉀、甲醇、甲酸、乙腈、三乙胺、正己烷、醋酸:分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

管式爐:GSL-1600X型,鄭州博科儀器公司;

電子分析天平:FA2004N型,上海精密科學(xué)儀器有限公司;

數(shù)顯恒溫磁力攪拌器:85-2型,天津市泰斯特儀器有限公司;

臺(tái)式高速離心機(jī):TG16-WS型,湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司;

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱:DHG-9246A型,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;

高效液相色譜:E2695型,美國(guó)沃特世公司;

激光粒度儀:Zetasizer nano型,英國(guó)Malvern公司;

掃描電子顯微鏡:JEOLJEM-2100型,日本電子株式會(huì)社;

傅立葉紅外光譜儀:Nicolet6700型,美國(guó)Thermo Nicolet公司;

X-射線衍射儀:smartlab9型,日本理學(xué)公司。

1.2 方法

1.2.1 Zr-MOFs納米酶的合成

(1) 12-配位Zr-MOF的制備:將60.6 mg ZrCl4和0.423 g BDC溶于15 mL DMF和0.447 mL冰醋酸混合溶液中,置于聚四氟乙烯內(nèi)膽(20 mL)中,120 ℃加熱24 h。冷卻,8 017×g離心15 min。將得到的產(chǎn)物分別用DMF和甲醇洗滌3次,后續(xù)試驗(yàn)前,于室溫下真空活化12-配位Zr-MOF[14]。

(2) 6-配位Zr-MOF的制備:將40.3 mg ZrOCl2·8H2O和26.2 mg H3BTC溶于5 mL DMF和5 mL甲酸混合溶液中,置于聚四氟乙烯內(nèi)膽(20 mL)中,130 ℃加熱48 h。冷卻,12 333×g離心10 min。將得到的產(chǎn)物用DMF和乙醇分別洗滌3次,并于150 ℃活化20 h后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)[21]。

(3) 4-配位Zr-MOF的制備:將42.8 mg ZrOCl2·8H2O溶于4 mL DEF和2.5 mL甲酸混合溶液中,置于聚四氟乙烯內(nèi)膽(20 mL)中,80 ℃加熱1 h,冷卻,加入13.6 mg TPTC和200 μL去離子水,超聲處理20 min,于130 ℃加熱48 h,14 800×g離心10 min,用DMF和丙酮洗滌3次,并于80 ℃真空干燥[22]。

1.2.2 Zr-MOFs納米酶的表征 使用Malvern Zetasizer Nano-ZS測(cè)量Zr-MOFs的DLS,通過(guò)SEM觀察Zr-MOFs的形貌,使用FTIR分析Zr-MOFs的化學(xué)結(jié)構(gòu),通過(guò)XRD獲取Zr-MOFs的晶體結(jié)構(gòu)信息,并通過(guò)高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定Gly-Gly和Gly含量。

1.2.3 Zr-MOFs納米酶的蛋白水解酶活性分析

(1) 雙甘肽的水解:將2.0 μmol Zr-MOFs和50 μL Gly-Gly溶液(40 mmol/L)加入到950 μL 超純水中,60 ℃攪拌。Gly-Gly被Zr-MOFs水解后,混合物于14 800×g離心20 min以去除Zr-MOFs[23],通過(guò)HPLC檢測(cè)水解產(chǎn)物,并通過(guò)Gly產(chǎn)率計(jì)算Zr-MOF水解Gly-Gly的催化速率。

(2) 蛋白水解酶活性測(cè)定:以雙甘肽(Gly-Gly)水解率為指標(biāo),評(píng)估Zr-MOFs納米酶的蛋白水解酶活性。將200 μL樣品溶液、100 μL三乙胺乙腈溶液和100 μL PITC乙腈溶液混合,室溫放置1 h,向混合物中加入400 μL正己烷,室溫靜置10 min,過(guò)濾,濾液用800 μL超純水稀釋。流動(dòng)相A為0.1 mol/L乙酸—乙酸鈉緩沖溶液(pH 6.5);流動(dòng)相B為乙腈;洗脫流速1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm;柱溫40 ℃;上樣量10 μL。梯度洗脫條件:0～7 min,100% A,7～15 min,85% A、15～18 min,100% A。

(3) Zr-MOFs納米酶(6-配位Zr-MOF)的異質(zhì)性:將2.0 μmol 6-配位Zr-MOFs和50 μL Gly-Gly溶液(40 mmol/L)加入到950 μL水中,于60 ℃孵育催化3 h,離心去除6-配位Zr-MOF,并使剩余溶液進(jìn)一步反應(yīng)。

(4) Zr-MOFs納米酶(6-配位Zr-MOF)的可重復(fù)使用性:采用溶劑洗滌法進(jìn)行再生[23]。150 ℃真空條件下,將6-配位Zr-MOF活化24 h,繼續(xù)用于催化反應(yīng)。

(5) Zr-MOFs納米酶(6-配位Zr-MOF)對(duì)3種蛋白質(zhì)的水解:將大豆蛋白、魚糜蛋白和酪蛋白分別與6-配位Zr-MOF于60 ℃孵育。于不同的時(shí)間間隔內(nèi),采用SDS-PAGE分析3種蛋白質(zhì)的分子量和水解產(chǎn)物。分離的條帶用Kemas Brilliant Blue R-250染色。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 每組數(shù)據(jù)3次重復(fù),利用Origin 2017軟件處理數(shù)據(jù)與作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Zr-MOFs納米酶的表征

在聚四氟乙烯內(nèi)膽中,使用不同的有機(jī)羧酸作為連接劑,與Zr團(tuán)簇配位連接,分別合成了3種Zr-MOFs納米酶,即12/6/4-配位的Zr-MOFs納米酶(圖1)。

圖1 不同配位數(shù)的Zr-MOFs結(jié)構(gòu)示意圖

由圖2和圖3可知,12-配位Zr-MOF納米酶是一種具有光滑表面的規(guī)則球體,直徑為100 nm;6-配位Zr-MOF納米酶是一種規(guī)則的八面體納米材料,直徑為2 μm;4-配位Zr-MOF納米酶呈圓形,直徑為150 nm,與文獻(xiàn)[24-25]的結(jié)果一致。因此,3種Zr-MOFs被成功合成。

圖2 不同配位數(shù)的Zr-MOFs的水合粒徑

圖3 不同配位數(shù)的Zr-MOFs的SEM圖像

圖4 不同配位數(shù)的Zr-MOFs的FTIR圖像

圖5 不同配位數(shù)的Zr-MOFs的XRD圖像

2.2 Zr-MOFs納米酶的蛋白水解酶活性

由圖6(a)可知,6-配位Zr-MOF和4-配位Zr-MOF納米酶的蛋白水解酶活性明顯高于12-配位Zr-MOF的,6-配位Zr-MOF對(duì)雙甘肽的水解率達(dá)52%,而4-配位Zr-MOF和12-配位Zr-MOF的水解率分別為6.15%,45.8%。天然蛋白酶通過(guò)Zn2+裂解肽鏈而水解雙甘肽[31-32]。因此,Zr-MOF的活性中心被認(rèn)為是CUSs。CUSs模擬了Zn2+在天然鋅金屬蛋白酶中的作用,更多的CUSs將有助于提高Zr-MOF納米酶的水解性能。然而,4-配位Zr-MOF納米酶的催化活性低于6-配位Zr-MOF納米酶的,是因?yàn)?-配位Zr-MOF納米酶的小孔尺寸阻礙了雙甘肽與CUSs的結(jié)合[22,33]。綜上,6-配位Zr-MOF納米酶對(duì)雙甘肽的催化活性最高。

圖6 Zr-MOFs納米酶的蛋白水解酶活性

6-配位Zr-MOF納米酶水解雙甘肽的一階反應(yīng)速率常數(shù)為2.64×10-5s-1,在沒(méi)有Zr-MOF納米酶存在的情況下,雙甘肽的水解恒定速率為7.4×10-9s-1[34],表明使用6-配位Zr-MOF納米酶時(shí),雙甘肽的水解反應(yīng)速率增加了2.63×103倍,說(shuō)明6-配位Zr-MOF對(duì)雙甘肽具有較好的水解性能。

由圖6(b)可知,當(dāng)從水解體系中去除6-配位Zr-MOF納米酶后,雙甘肽的水解率幾乎不變,表明雙甘肽不再被水解。該測(cè)試異質(zhì)性的熱過(guò)濾試驗(yàn)表明,在雙甘肽水解體系中具有催化活性的是6-配位Zr-MOF納米酶。

由圖6(c)可知,以6-配位Zr-MOF納米酶含量為橫坐標(biāo),一階反應(yīng)速率常數(shù)為縱坐標(biāo)繪制曲線,并由偽Michaelis-Menten模型[式(1)]進(jìn)行擬合。6-配位Zr-MOF納米酶對(duì)雙甘肽的水解反應(yīng)符合Michaelis方程。當(dāng)6-配位Zr-MOF納米酶含量為4.0 μmol時(shí),水解雙甘肽的速率常數(shù)達(dá)到最大為7.4×10-9s-1,說(shuō)明使用4.0 μmol 6-配位Zr-MOF可以實(shí)現(xiàn)良好的水解效果。

(1)

式中:

kobs——一階反應(yīng)速率常數(shù);

kmax——最大反應(yīng)速率常數(shù);

[MOF]——MOF催化劑的濃度,mol/L;

KM——米氏常數(shù)。

由圖6(d)可知,在重復(fù)使用5次后,Gly-Gly的轉(zhuǎn)化率未明顯下降,說(shuō)明6-配位Zr-MOF的水解活性未受到較大影響,表明6-配位Zr-MOF具有較高的穩(wěn)定性,在實(shí)際應(yīng)用中具有較大的重復(fù)利用潛力。

2.3 Zr-MOF納米酶水解蛋白質(zhì)

由圖7可知,隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng),3種蛋白的條帶逐漸變淺,表明Zr-MOF納米酶可以同時(shí)水解3種蛋白質(zhì),展現(xiàn)出廣泛的蛋白酶活性。Zr-MOF納米酶對(duì)大豆蛋白和魚糜蛋白顯示出較高的催化活性,對(duì)酪蛋白的催化活性較低。如圖7(a)所示,水解過(guò)程中沒(méi)有低分子量(<14.4 kDa)的條帶,可能是由于Zr-MOF納米酶將大豆蛋白的長(zhǎng)肽水解為短肽。由于短鏈多肽容易從SDS-PAGE凝膠中漏出,所以無(wú)法被觀察到。由圖7(b)可知,隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng),大豆蛋白的長(zhǎng)肽條帶逐漸變淺,短肽條帶逐漸變深,說(shuō)明Zr-MOF納米酶對(duì)魚糜蛋白具有較好的水解效果。由圖7(c)可知,酪蛋白的長(zhǎng)肽條帶逐漸變淺,短肽條帶逐漸變深,但變化不明顯,表明Zr-MOF納米酶可以催化大豆蛋白、魚糜蛋白和酪蛋白水解,展現(xiàn)出廣泛的蛋白酶活性,且對(duì)大豆蛋白和魚糜蛋白顯示出較高的催化活性。

圖7 6-配位Zr-MOF水解3種蛋白質(zhì)的SDS-PAGE圖

3 結(jié)論

通過(guò)調(diào)節(jié)鋯基金屬有機(jī)框架的配位不飽和金屬位點(diǎn)制備了3種具有不同蛋白水解酶活性的納米酶,證明了一種可以調(diào)節(jié)鋯基金屬有機(jī)框架納米酶的蛋白水解酶活性的方法。以雙甘肽水解率為指標(biāo),評(píng)估了具有不同配位不飽和金屬位點(diǎn)的鋯基金屬有機(jī)框架納米酶的蛋白水解酶活性,其中6-配位的鋯基金屬有機(jī)框架納米酶對(duì)雙甘肽的蛋白水解酶活性最高,對(duì)雙甘肽的水解率達(dá)52%,證實(shí)了鋯基金屬有機(jī)框架的蛋白酶活性可以通過(guò)調(diào)整配位不飽和金屬位點(diǎn)而被提高,同時(shí)具有良好的異質(zhì)性和可重復(fù)利用性。此外,鋯基金屬有機(jī)框架納米酶可以分別水解3種常見(jiàn)的蛋白質(zhì)(大豆蛋白、魚糜蛋白和酪蛋白),展現(xiàn)出廣泛的蛋白酶活性,表明鋯基金屬有機(jī)框架作為蛋白水解酶納米酶具有較好的實(shí)際應(yīng)用潛力。研究中蛋白催化水解溫度較高,后續(xù)需進(jìn)一步研究鋯基金屬有機(jī)框架納米酶結(jié)構(gòu)對(duì)催化溫度的影響機(jī)理,以期降低鋯基金屬有機(jī)框架納米酶高效水解蛋白時(shí)的溫度。