3種培養基對雞肉產品中兩類耐藥菌培養的影響

黃柳娟 樊彥莉 鐘 海 蔣 靜 邵 毅

(1. 上海市農業科學院農產品質量標準與檢測技術研究所,上海 201403;2. 上海海關動植物與食品檢驗檢疫技術中心,上海 200135;3. 上海海關,上海 200135)

養殖業抗生素的濫用導致農業生產成為抗生素耐藥菌(Antimicrobial risistant bacteria, ART)的一大來源[1],農業源ART菌可能通過食物鏈傳播至人類[2]。水平基因遷移(Horizontal gene transfer, HGT)是耐藥基因在各類細菌中擴散的重要方式[3],但相較于致病菌,數量龐大、遺傳背景豐富、可能更頻繁地參與HGT的非致病菌的耐藥性尚未受到系統監測和研究[4]。其中標準化、批量化培養、分離ART菌技術的缺乏,是制約非致病菌耐藥性研究的瓶頸問題之一。

活細菌的分離檢測對于細菌種類的進一步表征至關重要[5]。培養基類型和成分濃度[6]會影響可培養細菌群落構成[7]和單類細菌的生長速率[8],以及對抗生素的耐受性[9-10]。針對未知耐藥細菌群落的初步篩查或耐藥基因的遷移研究,科研人員使用腦心浸液肉湯(BHI)[11-12]、麥康凱瓊脂[13]、胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)[14]、LB[15]、平板計數瓊脂(PCA)[16]等培養基,但這些培養基對不同基質中的不同ART菌的培養效果并未得到評估。

培養基營養物質的豐富度對可培養細菌的種類和數量的影響尚無定論[17],鑒于BHI、TSA和PCA培養基對細菌培養的普適性或在標準化操作中的廣泛應用[18-19],研究擬以這3種培養基為例,基于高通量測序技術,分析在不同培養基上培養獲得的冷鮮雞和雞肉熟食表面四環素耐藥(Tetracycline resistant,Tr)菌和磺胺耐藥(Sulfamethoxazole resistant,Sr)菌的菌群結構和菌屬豐度,為評估培養基對不同基質上不同ART菌的培養效果提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

4份冷鮮雞產品(整雞、雞胸肉、雞腿肉和雞翅,編號分別為F1、F2、F3和F4)和 3份散裝雞肉熟食制品(白斬雞、鹽水雞和烤雞,編號分別為R1、R2和R3):無菌袋包裝后置于冰袋中,3 h內送回實驗室,市售;

PCA培養基、BHI培養基及TSA培養基:英國OXOID公司;

真菌抑制劑放線菌酮(Cyc):分析純,美國AMRESCO公司;

四環素(Tet)、磺胺甲惡唑(Sul)、甲氧芐啶(Tri):分析純,美國 SIGMA公司;

生理鹽水:廣東環凱微生物科技有限公司;

醫用酒精:國藥集團化學試劑有限公司;

細菌基因組提取試劑盒:德國QIAGEN公司;

聚合酶鏈式反應(PCR)試劑盒、瓊脂糖電泳試劑盒:北京全式金生物技術有限公司;

PCR產物電泳凝膠回收試劑盒:美國 Thermo Scientific公司;

PCR引物:生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

均質機:BAGMIXER400型,法國Interscience公司;

水平核酸電泳系統:Mini-Sub cell GT型,美國Bio-Rad公司;

凝膠成像系統:Criterion Stain Free型,美國Bio-Rad公司;

超微量分光光度計:NanoDrop 2000c型,美國Thermo公司;

高壓滅菌鍋:SX-500型,日本TOMY公司。

1.2 方法

1.2.1 Tr菌和Sr菌的培養 根據GB 4789.2—2016和Huang等[11]的方法從雞肉樣品表面初步培養出對四環素或磺胺甲惡唑耐藥的細菌。無菌條件下將樣品表面(深度不超過5 mm)的組織剪碎,混勻,準確稱量25 g于無菌袋中,加入225 mL 0.9%無菌生理鹽水,用均質機拍打2 min制成均質液。吸取200 μL均質液分別均勻涂布于3種培養基(BHI、TSA、PCA)平皿上,每種培養基平皿中含有16 μg/mL Tet和100 μg/mL Cyc(分別記為BHItet組、TSAtet組和PCAtet組),或152 μg/mL Sul、8 μg/mL Tri和100 μg/mL Cyc(分別記為BHIsul組、TSAsul組和PCAsul組),或僅含有100 μg/mL Cyc(分別記為BHIcyc組、TSAcyc組和PCAcyc組),分別對樣品中的可培養Tr菌、可培養Sr菌和可培養總菌進行培養。每個處理重復3次。所有平皿于(30±1) ℃下倒置培養48 h,將同組的3個平皿中的菌體全部刮取并混合,提取細菌總脫氧核糖核酸(DNA)后進行菌群多樣性分析。

1.2.2 細菌總DNA的提取 用2 mL生理鹽水重懸刮取培養皿上的菌體,充分混勻,取100 μL菌懸液,用細菌基因組提取試劑盒提取細菌總DNA。經1%瓊脂糖凝膠電泳和超微量分光光度計測定后,對16S rRNA基因的V3～V4區域進行擴增,上游引物為341F:5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′,下游引物為 806R:5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′。用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物質量后,委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行高通量測序。

1.2.3 高通量測序 基于IonS5TMXL測序平臺進行測序,使用Cutadapt(V1.9.1)[20]對reads進行低質量部分剪切,得到最終的有效數據(Clean Reads)。利用Uparse軟件(Uparse v7.0.1001)[21]對所有樣品的全部Clean Reads 進行聚類,默認以97%的一致(Identity)將序列聚類成為OTUs,對OTUs序列進行物種注釋。對各樣品的數據進行均一化處理,以樣品中數據量最少的為標準進行均一化處理,最終確定各物種的相對豐度。基于均一化處理后的數據,利用β多樣性分析中的主坐標分析(PcoA)比較樣本之間的差異,并用MetaStat方法對組間的物種豐度數據進行假設檢驗得到P值,根據P值篩選具有顯著性差異的物種。

2 結果與分析

2.1 兩類可培養ART菌的菌群結構及可培養總菌的差異

由圖1、圖2可知,不論使用哪種培養基,每個樣品中的兩類ART菌與總菌相比,排名前十的優勢菌屬在種類和豐度上均有差異,甚至在冷鮮雞和雞肉熟食樣品中分別有5(樣品F2,用PCA培養)～30(樣品F1,用BHI培養)、8(樣品R2,用PCA培養)～20(樣品R2,用BHI培養)個屬的耐藥細菌在對應的可培養總菌(從不含抗生素的培養基上培養獲得)中并未得到鑒定,說明冷鮮雞和雞肉熟食表面各類耐藥細菌菌群的組成各不相同。因此,有必要研究不同培養基對某類ART菌菌群培養效果的影響。

圖2 3種培養基上的可培養總菌(C)、Tr菌和Sr菌的種屬數維恩圖

2.2 3種培養基對兩類可培養ART菌組分的影響

由表1、表2可知,冷鮮雞表面共鑒定出78個屬的Tr菌和77個屬的Sr菌,多于前期研究[22]及單一BHI培養基中的。其中34個種屬的Tr菌和33個種屬的Sr菌在3種培養基上被鑒定出,而僅在BHI、TSA和PCA培養基上鑒定出的特有Tr菌屬各有30,5,3個,Sr菌屬為9,8,14個。

表1 3種培養基特異性培養的Tr菌

在雞肉熟食樣品表面共鑒定出28個屬的Tr菌和43個屬的Sr菌,其中3種培養基的共有菌屬分別為19,28個,特有Tr菌屬分別為3,2,1個,Sr菌屬分別為1,6,0個。微生物菌群中某個菌株或某類菌屬是否能獲得培養,除受培養基質能提供的營養支持及抗生素抑制外,還受到周邊菌群的協同促進或競爭抑制。雞肉熟食表面只在PCA培養基上得到培養的Tr菌為環絲菌屬(Brochothrixspp.),只在BHI培養基上得到培養的Sr菌為乳桿菌屬(Lactobacillusspp.),只在TSA培養基上得到培養的Sr菌為擬桿菌屬(Bacteroidesspp.)和肉桿菌屬(Carnobacteriumspp.),但這些菌屬在冷鮮雞樣品中的3種培養基上均能得到培養;而冷鮮雞表面只在PCA培養基上得到培養的Sr菌Cetobacteriumspp.在雞肉熟食樣品中的3種培養基上均能得到培養,慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobiumspp.)在雞肉熟食樣品中用TSA培養基也能得到培養。因此,培養基對表1、表2中涉及的菌屬的培養偏好性還需進一步驗證。

2.3 3種培養基對兩類可培養ART菌豐度的影響

主坐標分析結果表明,經3種培養基培養后,冷鮮雞和雞肉熟食樣品表面兩類可培養ART菌的主要群落結構差異不大。進而用Metastat法分析經3種培養基培養后豐度產生差異的ART菌菌屬,即在BHItet組、TSAtet組和PCAtet組之間分別進行兩兩比較。組間聚類結果表明,BHI和TSA對所培養細菌的豐度具有較高的相似性。由圖3、圖4可知,冷鮮雞表面有5個屬的Tr菌和3個屬的Sr菌在不同培養基上產生了顯著差異。其中,4種Tr菌(氣單胞菌屬Aeromonasspp.、水棲菌屬Enhydrobacterspp.、乳桿菌屬Lactobacillusspp.和泛菌屬Pantoeaspp.)和2種Sr菌(腸球菌屬Enterococcusspp.和乳桿菌屬Lactobacillusspp.)在PCA培養基上能獲得培養的穩定性及豐度均較高,而1種Tr菌(漫游菌屬Vagococcusspp.)和1種Sr菌(類香味菌屬Myroidesspp.)在BHI培養基上獲得培養的穩定性及豐度均顯著較高。上述菌屬中,腸球菌屬、乳桿菌屬、漫游菌屬和類香味菌屬曾被報道是冷鮮雞肉產品表面的優勢菌屬[23],腸球菌屬和乳桿菌屬的細菌還被證實較多地參與了耐藥基因的水平遷移[24]。因此,當研究對象包含上述菌屬時,可針對性地選擇更適合的培養基以獲得更多的目標菌株。

圖4 冷鮮雞表面差異耐藥菌菌屬的豐度

由圖5、圖6可知,雞肉熟食樣品表面有1個屬的Tr菌和5個屬的Sr菌在3種培養基上產生了顯著差異。其中,對四環素耐藥的庫特氏菌屬Kurthiaspp.在BHI培養基上的豐度顯著高于PCA培養基上的;而2種Sr菌(依格納季氏菌屬Ignatzschineriaspp.和未知的毛螺菌科Lachnospiraceae屬)在BHI培養基上的豐度顯著較高,3種Sr菌(經黏液真桿菌屬Blautiaspp.、巨球菌屬Macrocuccusspp.和未知的瘤胃球菌科Ruminococcaceae屬)在TSA培養基上的豐度較高。

圖5 雞肉熟食表面耐藥菌經不同培養基培養后的差異菌屬

圖6 雞肉熟食表面差異耐藥菌菌屬的豐度

營養物質可用性的差異會影響菌落形成的程度[25],可能是造成3種培養基對雞肉產品中兩類耐藥菌培養效果差異的原因。由于可能高達99.999%的微生物物種無法通過常規的培養方法獲得[26],因此,突破現有常用培養基的局限、優化培養基成分是微生物菌種分離領域的重要研究方向。其中,稀釋傳統培養基[27]或添加細菌來源環境成分作為培養基補充物[28]是提高可培養細菌的物種數量乃至發現新物種的有效途徑。這些方法在雞肉可培養耐藥菌多樣性的提高方面的可用性,以及適宜的稀釋倍數或添加物濃度還需更加深入的研究。

3 結論

研究基于高通量測序技術,以腦心浸液肉湯培養基、胰蛋白胨大豆瓊脂培養基和平板計數瓊脂培養基3種培養基為例,分析比較了不同培養基上培養獲得的冷鮮雞和雞肉熟食表面四環素耐藥(Tr)菌和磺胺耐藥(Sr)菌的菌群結構。結果表明,3種培養基上均能獲得培養的菌屬數僅為總可培養的抗生素耐藥菌屬數的43.59%(34/78,冷鮮雞Tr菌),42.86%(33/77,冷鮮雞Sr菌),67.86%(19/28,雞肉熟食Tr菌)和65.12%(19/28,雞肉熟食Sr菌)。3種培養基對冷鮮雞和雞肉熟食樣品表面兩類可培養抗生素耐藥菌的主要菌落結構的影響不大,但對部分菌屬的豐度產生了顯著影響,這些菌屬可能在數量或特性上是耐藥研究需要重點關注的菌群。因此,匯總多種培養基上獲得的菌群信息可以更完善地描述雞肉樣品表面抗生素耐藥菌的組成。