基于QuEChERS-高效液相色譜法測定油炸食品中丙烯酰胺含量

董文靜 戴盡波 聶榮榮 沈 潔 葉彩平 蔡智濤

(梅州市食品藥品監督檢驗所,廣東 梅州 514071)

丙烯酰胺(acrylamide)為不飽和酰胺[1],其單體具有多種毒性及潛在致癌性[2-3]。丙烯酰胺暴露量0.000 5 mg/kg為常人每天允許的最大暴露量。世界衛生組織(WHO)指出,丙烯酰胺對神經系統有明顯的損傷作用[4],具有神經毒性[5]。國際腫瘤機構(IARC)將其認定為2A類致癌物[6]。

丙烯酰胺廣泛存在于各種食品中,尤其是經高溫加工的富含淀粉類食品,其含量遠遠超過飲用水中規定的限量(0.5 μg/kg)[7]。2002年瑞典國家食品管理局與斯德哥爾摩大學研究人員[8]在一些油炸和燒烤的淀粉類食品中檢測到丙烯酰胺, 之后英國、挪威、美國、澳大利亞、新西蘭、加拿大等國家也報道了類似檢測結果[9-10]。2019年5月,國家食品安全風險評估中心將丙烯酰胺的風險監測納入2020年食品安全風險監測計劃之中[11]。油炸食品中丙烯酰胺含量最高[12],一般在加工溫度高于100 ℃時才會產生丙烯酰胺,且隨著高溫烹飪時間的延長丙烯酰胺的生成量逐漸增多[13]。

食品中丙烯酰胺的檢測方法通常有液相色譜法、液相色譜—質譜法、氣相色譜法、氣相色譜—質譜法、光譜法等。氣相色譜及質譜聯用技術需對分析物進行衍生化處理,前處理操作復雜,相對費時,不適宜大批量的處理分析。液相色譜—串聯質譜法可有效排除檢測物中雜質的影響,回收率較高,但對儀器要求高。液相色譜在傳統反相吸附柱中選擇性略低,適用于油炸、烘烤等丙烯酰胺含量高的食品檢測[14-21]。QuEChERS法是一種快速、簡便,對試驗器材和試劑要求不高的前處理方法。林濤等[22]使用QuEChERS結合超高效液相色譜—串聯質譜法測定了咖啡中丙烯酰胺含量;歐陽小艷等[23]使用QuEChERS結合超高效液相色譜—電噴霧串聯四極桿質譜測定了焙烤蛋糕中的丙烯酰胺含量。研究擬將新型材料碳十八碳鍵合鋯膠(Z-Sep+)與C18應用于油炸食品中丙烯酰胺測定的前處理中,建立一種采用QuEChERS方法進行前處理,高效液相色譜和二極管陣列檢測器進行測定的檢測方法,以期為油炸食品中丙烯酰胺的篩查監測工作提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈、丙酮、甲醇:色譜純,美國ACS恩科化學;

C18:40～60 μm,天津博納艾杰爾科技有限公司;

PSA:天津博納艾杰爾科技有限公司;

Z-Sep+:美國Supelco公司;

丙烯酰胺標準品:1 000 μg/mL,農業部環境保護科研監測所;

餅干中丙烯酰胺分析質控樣品:MRM0276,北京美正檢測技術有限公司;

炸薯片:樂事薯片有限公司;

炸芋圓、炸馓子、炸南瓜圓:市售。

1.2 主要儀器設備

高效液相色譜儀:LC-20AT型,配備SPD-M20A二極管陣列檢測器,日本島津公司;

電子分析天平:AUW220型,日本島津公司;

全自動平行濃縮儀:AutoEVA-60型,睿科集團股份有限公司;

高速冷凍離心機:ST16R型,美國Thermo Fisher公司;

調速多用振蕩器:HY-4型,金壇市宏華儀器廠;

超純水系統:Milli Q型,美國Millipore公司。

1.3 樣品前處理

油炸食品經高速粉碎機粉碎后過40目篩,于-18 ℃貯藏備用。稱取2 g經粉碎后的油炸食品,加入10 mL正己烷脫脂,7 000 r/min離心5 min,棄去上層清液,待樣品中殘余正己烷完全揮發后加入10 mL甲醇,振搖30 min,7 000 r/min離心5 min,吸取8 mL上清液,加入150 mg Z-Sep+及200 mg C18,渦旋凈化1 min,7 000 r/min離心5 min,吸取7 mL上清液,室溫氮吹至干,用1 mL超純水復溶,過0.45 μm尼龍66濾膜,上機待測。

1.4 色譜條件

色譜柱為Capcell PAK C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相A為甲醇,流動相B為超純水;柱溫25 ℃;流速1 mL/min;進樣量10 μL;檢測波長197 nm;等度洗脫比例:5% A+95% B。

2 結果與分析

2.1 凈化材料的選擇

采用Plackett-Burman試驗(n=12),考察PSA用量、C18用量、Z-Sep+用量 3個因素在QuEChERS前處理方法中的凈化效果,試驗因素水平見表1,試驗設計及結果見表2。

表1 Plackett-Burman試驗設計因素與水平

由表2可知,單獨使用PSA凈化時,回收率最低,甚至低于未使用凈化材料的對照組,隨著Z-Sep+和C18的加入,回收率有不同程度的上升,Z-Sep+和C18配合使用的回收率高于單獨使用時的。為了更直觀地體現3種凈化材料的使用對回收率的影響,運用Minitab 18軟件對表2數據進行分析處理,以回收率作為響應值,結果用標準化帕累托圖表示(見圖1)。

基準參照線表示99%置信區間(P<0.01)

由圖1可知,C18和Z-Sep+的標準化效應值超過了基準參照線,表明這兩個因素對回收率影響顯著,影響丙烯酰胺回收率因素顯著性為C18> Z-Sep+。與未使用Z-Sep+的處理組相比,使用Z-Sep+處理后的色譜圖雜質峰更小;而使用PSA處理后,在緊挨著丙烯酰胺色譜峰的位置之后出現了一個巨大的雜質峰,可能是PSA本身引入的雜質,導致信噪比與回收率降低。后續試驗以C18和Z-Sep+兩種因素作為主要因素進行優化。

2.2 凈化材料比例與提取溶劑的選擇

在單因素試驗基礎上,對C18用量、Z-Sep+用量、提取溶劑的選擇進行正交試驗設計。由于丙烯酰胺屬于食品中內源性污染物[24],為充分考察待優化因素的真實提取效率和凈化效果,使用丙烯酰胺分析質控樣品作為試驗樣品,以測量值與質控樣品真實值間的誤差準確度,誤差越小,代表準確度越高。試驗因素水平見表3,試驗設計及結果見表4。

表3 正交試驗設計因素與水平

表4 正交試驗設計與結果

由表4可知,以乙腈作為提取溶劑時誤差普遍偏高,說明以丙酮或甲醇作為提取溶劑更合適。當C18用量提高時,誤差的變化趨勢逐漸減小;當Z-Sep+用量變化時,誤差的變化趨勢不易直觀看出。為了更直觀地體現兩種凈化材料在不同用量時對誤差的影響,以及不同提取溶劑對試驗結果影響的優劣程度,使用SPSS軟件對試驗結果進行方差分析,以準確度的估算邊際均值為縱坐標,單因素變量為橫坐標,繪制方差的單變量分析圖如圖2所示。

圖2 準確度與提取溶劑、C18用量、Z-Sep+用量的方差分析圖

由圖2可知,當Z-Sep+用量增大時,誤差反而升高,可能是由于過量Z-Sep+吸附了部分待測物使結果偏離真值。當C18用量為50～200 mg時,誤差隨C18用量的增加而減小,說明C18對油炸食品中雜質的吸附效果較好,在此范圍內增加C18用量可以有效減少結果誤差。C18和Z-Sep+吸附的雜質種類不同,配合使用時可凈化樣品中大部分雜質,凈化效果優于單獨使用。使用甲醇作為提取溶劑時,提取效率最高,誤差最小,丙酮其次,乙腈的提取效率最低。因此,最佳提取條件為甲醇為提取溶劑,Z-Sep+用量75 mg, C18用量200 mg。

2.3 流動相比例的選擇

預試驗發現,甲醇—水、乙腈—水均有較好的分離效果,試驗選擇甲醇—水為流動相,通過考察不同體積比(V甲醇∶V水為30∶70,20∶80,10∶90,5∶95,2∶98)下甲醇—水的分離效果來確定最佳的流動相比例。

由圖3可知,隨著流動相中水所占比例的升高,丙烯酰胺的保留時間也逐漸后移,當V甲醇∶V水為30∶70～10∶90時,丙烯酰胺的保留時間為2～4 min;當V甲醇∶V水上升至5∶95時,丙烯酰胺的保留時間為4.302 min;當V甲醇∶V水為2∶98時,丙烯酰胺的保留時間為4.928 min。由圖4可知,樣品中的雜質峰主要集中在2～4 min,丙烯酰胺保留時間若晚于4 min有利于待測物與雜質更好的分離。當V甲醇∶V水為5∶95時,丙烯酰胺峰面積最大,響應值最高。常立偉等[25]采用高效液相色譜法測定薯條中的丙烯酰胺,所用流動相V甲醇∶V水為0.5∶99.5,與試驗結果接近。但試驗發現,水的比例并非越高越好,結合保留時間與響應值,選擇V甲醇∶V水為5∶95作為丙烯酰胺檢測的流動相。

圖3 不同流動相比例下液相色譜圖

圖4 QuEChERS法提取炸芋圓中丙烯酰胺的高效液相色譜圖

2.4 檢測波長的選擇

由圖5可知,丙烯酰胺在190～250 nm處均有吸收,最大吸收波長為197.56 nm。通過不同波長下標準曲線的響應值與信噪比也可看出,197 nm下丙烯酰胺的峰面積與信噪比最大。因此,選用197 nm作為丙烯酰胺的檢測波長。

圖5 丙烯酰胺在190～300 nm的吸收光譜圖

2.5 方法學驗證

2.5.1 線性關系、檢出限和定量限 配制質量濃度為0.1～2.0 mg/L的一系列丙烯酰胺標準溶液,按1.4的色譜條件進行測定。以丙烯酰胺峰面積為縱坐標,質量濃度為橫坐標,繪制丙烯酰胺的標準曲線方程為Y=92 039.8X+1 068.39,R2=0.999 4,檢出限為0.007 mg/kg,定量限為0.02 mg/kg,與GB 5009.204—2014中規定的定量限(0.01 mg/kg)接近,且大大簡化了使用儀器和前處理過程,可以滿足日常油炸食品中丙烯酰胺含量的篩查與監測。

2.5.2 精密度和穩定性 稱取6份丙烯酰胺質控樣,按1.3的方法進行前處理,結果表明,該方法相對標準偏差為0.66%,重復性良好。

選取一份待測樣品,分別在制備后的0,2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,22,24 h時進樣測定,結果顯示丙烯酰胺的日內精密度為1.00%,表示樣品溶液在24 h內基本穩定。選取一份待測樣品,分別在制備后的0,1,2 d進樣測定,結果顯示丙烯酰胺的日間精密度為0.14%,表示樣品溶液可在3 d內保持穩定。

2.5.3 回收率 在丙烯酰胺質控樣中添加丙烯酰胺標準溶液,根據國家食品安全風險評估中心發布的《食品中丙烯酰胺的危險性評估》中列出的不同食品的丙烯酰胺含量可知,大部分油炸食品的丙烯酰胺含量為0.2～1.0 mg/L。試驗在0.2,0.5,1.0 mg/L 3個水平下進行加標回收試驗,結果見表5。

表5 丙烯酰胺的回收率和相對標準偏差

由表5可知,當加標量為0.2～1.0 mg/L時,樣品回收率均>90%,RSD均<2%,說明試驗方法回收率良好,精密度高,結果穩定。

2.6 實際樣品測定

由表6可知,4種不同食品基質的油炸食品中,以土豆片為基質的炸薯片中的丙烯酰胺含量最高,其次是以南瓜絲為基質的炸南瓜圓,兩種炸品的丙烯酰胺含量均>0.5 mg/kg。以芋頭絲為基質的炸芋圓中的丙烯酰胺含量相對較低,含量最低的為以小麥粉面團為基質的炸馓子。食品原料對油炸食品中丙烯酰胺含量的影響為土豆片>芋絲>南瓜絲>面團。由于南瓜含有天然色素,導致炸南瓜圓的樣品提取液顏色較黃,經凈化后顏色變淺,并未影響試驗結果,說明試驗方法對含有一定量色素的樣品同樣具備較好的檢測能力,可以適應多種不同油炸食品中丙烯酰胺含量的檢測。

表6 不同油炸食品中丙烯酰胺含量

3 結論

研究采用新型材料碳十八鍵合鋯膠(Z-Sep+)結合C18作為凈化材料應用于油炸食品中丙烯酰胺含量的測定,建立了一種簡便、高效的QuEChERS前處理方法。與傳統方法相比,試驗方法打破了丙烯酰胺檢測中使用QuEChERS前處理必須配備質譜檢測器的固定模式,在簡化前處理過程的同時,降低了對儀器的要求,可以滿足日常對油炸食品中丙烯酰胺的篩查監測工作,尤其適合儀器條件有限的基層檢測單位和一些經費有限的研究機構進行油炸食品中丙烯酰胺含量的科研監測工作。后續可以此為延伸,對凈化材料進行更多的調整,為其他食品中丙烯酰胺含量的測定提供依據。