輪葉黨參多糖的分離純化及結構研究

劉艷秋 王亞茹 毛迪銳 常 凱

(北華大學林學院,吉林 吉林 132013)

輪葉黨參(CodonopsislanceolataBenth. et. Hook. f)又稱山胡蘿卜、北沙參等,為桔梗科黨參屬多年生纏繞性藤本植物。主要分布在中國東北、華北和華東地區以及朝鮮、日本和俄羅斯等地[1]。輪葉黨參多生長在溝邊、灌木林下或闊葉林內,主要食用部位為根,具有較高的營養價值[2-3]。隨著科技的進步,輪葉黨活性成分的研究已經取得了一定進展,當前對輪葉黨參功能性成分研究主要集中在皂苷、黃酮和生物堿類物質,具有降血脂、降膽固醇、減肥、調節胃腸道和改善記憶等作用[4-6]。

多糖是由若干個單糖分子由端基碳原子連接形成的高分子化合物,分子結構含有多種苷鍵類型[7-8],具有廣泛的生物活性,是開發藥物、功能性食品的重要來源之一。多糖對保持細胞活性、增強免疫器官功能、維持細胞正常生命代謝具有重要意義。目前關于輪葉黨參的研究主要集中在粗多糖提取方法及生物活性,對輪葉黨參多糖的分離純化、結構分析以及分離組分的生物活性研究較少。根據文獻[9],利用熱水浸提得到的輪葉黨參多糖含量為8.50%。輪葉黨參粗多糖可顯著增強小鼠單核巨噬細胞系統的吞噬功能,對提高小鼠免疫力具有一定作用,2 g/kg輪葉黨參粗多糖對小鼠移植瘤S180抑制率為54%[10]。

研究擬以吉林省長白山區輪葉黨參為原料,利用水提醇沉、脫脂、脫蛋白、脫色、DEAE-纖維素陰離子柱層析、SephadexS-300葡聚糖柱層析等方法制備輪葉黨參多糖組分,利用物理、化學方法結合波譜分析揭示輪葉黨參多糖結構特征,以期為進一步研究輪葉黨參多糖結構與活性的關系提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

輪葉黨參:吉林省長白山區輪葉黨參種植基地;

L(+)阿拉伯糖、L(+)鼠李糖、D(+)木糖、D(+)半乳糖、D(+)木糖、D(+)甘露糖:優級純,美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

氣相色譜儀:GC-14C型,日本島津公司;

高效液相色譜儀:LC-10A型,日本Shimadzu公司;

數顯恒溫水浴鍋:HH-2型,江蘇省金壇市科技儀器有限公司;

旋轉蒸發器:E-52型,上海醫療器械廠;

高速離心機:LG10-2.4A型,北京醫用離心機廠。

1.3 方法

1.3.1 輪葉黨參多糖的制備

(1) 粗多糖提取:輪葉黨參多糖提取條件為超聲功率147 W、超聲時間15 min、纖維素酶酶解溫度45 ℃、加酶量0.7%、酶解pH值4.5[11],過濾后,減壓濃縮加入4倍無水乙醇沉淀,冷凍干燥得輪葉黨參粗多糖。

(2) 輪葉黨參多糖純化:將輪葉黨參粗多糖經無水乙醚脫脂、活性炭脫色、木瓜蛋白酶酶解后再用Sevag法處理4次,DEAE-52纖維素離子柱層析得到3個主要組分輪葉黨參多糖組分1(CLPS1)、輪葉黨參多糖組分2(CLPS2)和輪葉黨參多糖組分3(CLPS3),分離所得的3種多糖CLPS1占48.3%、CLPS2占40.5%、CLPS3占8.15%[12]32-40。

(3) Sephadex S-300葡聚糖凝膠柱層析:經DEAE-52纖維素離子柱層析得到的組分進一步用Sephadex S-300葡聚糖柱層析洗脫,各組分分別溶于少量蒸餾水中,裝樣,柱規格為Φ1.6 cm×30 cm,洗脫液為0.1 mol/L NaCl,洗脫速度為0.5 mL/min,分別收集洗脫液,利用苯酚—硫酸法測定多糖含量。

1.3.2 CLPS1比旋光度的測定 準確稱取一定量的 CLPS1,配制成質量濃度為1 mg/mL的多糖溶液。調節溫度20 ℃,按式(1)計算CLPS1的比旋光度。

(1)

式中:

l——旋光管長度,dm;

c——100 mL溶液中含有的樣品質量,g;

t——測定時的溫度,℃;

λ——鈉光譜的D線(589.3 nm);

a——測定的旋光度值;

[a]——比旋光度。

1.3.3 糖醛酸含量測定 采用硫酸—咔唑法。在9支刻度試管中分別加入質量濃度為0,10,20,30,40,50,60,70,80 μg/mL的半乳糖醛酸標準液2 mL,緩慢加入12 mL H2SO4,充分混勻,沸水浴加熱10 min,冷卻至20 ℃,分別取1 mL 0.15% 咔唑試劑加入到上述9支刻度試管中,混合均勻,放置30 min,在530 nm處測定吸光度,以糖醛酸濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

取樣品溶液2 mL,按照上述標準曲線測定方法,平行測定3次取平均值,根據標準曲線計算糖醛酸含量。

1.3.4 CLPS1分子量的測定 精確量取5.0 mg CLPS1溶于1 mL 0.7% Na2SO4中,充分溶解后,用直徑為0.45 μm過濾膜過濾,取10 μL糖品進樣,利用HPLC分析[12]40-72。

采用CLASS VP HPLC數據分析工作站;示差折光檢測器為SHIMADZU RID-10A;分子排阻色譜柱為G3000 PWXL 7.8 mm(ID)×30.0 cm(L);流動相為0.7% Na2SO4;流速為0.5 mL/min;柱溫為40 ℃;按上述方法進樣葡聚糖標準品。以信號強度為縱坐標和保留時間為橫坐標繪制標準曲線,按照標準曲線計算CLPS1平均相對分子質量。

1.3.5 單糖組成分析 采用氣相色譜法。根據文獻[13]修改如下:準確稱取CLPS1 30.0 mg、2 mol/L三氟乙酸(TFA)2 mL放入水解管中,真空密封,120 ℃水解3 h,取0.5 mL乙醇加入到水解液中。待水解完全后加入1 mg肌醇和1 mL 0.1 mol/L Na2CO3,30 ℃恒溫50 min,加入50 mg KBH4,25 ℃保持1.5 h,用乙酸調節pH至中性,在溫度40 ℃,真空度為0.06 MPa條件下干燥1 h,加1 mL正丙胺和1 mL吡啶,55 ℃反應30 min后干燥,再次加入0.5 mL吡啶和0.5 mL乙酸酐,90 ℃保溫1 h,然后經低溫真空干燥得到樣品,再用二氯甲烷溶解,取上清液進行氣相色譜(GC)測定。

色譜柱為Rtx2330石英毛細管柱(30 m×0.32 mm×0.2 mm);氣化室溫度為250 ℃;FID氫焰檢測器;程序升溫為170 ℃,保持2 min,以8 ℃/min升至240 ℃,保持1 min,再以8 ℃/min升至265 ℃,保持20 min;進樣溫度為275 ℃;檢測器溫度為300 ℃;進樣量1 μL;載氣為氮氣;流速為1.5 mL/min。

1.3.6 紅外光譜(FT-IR)分析 根據文獻[14]。

1.3.7 NMR分析 將10 mg CLPS1溶于1 mL D2O中,利用核磁共振儀測定1H NMR、13C NMR譜[15]。

1.3.8 部分酸水解 稱CLPS1 125 mg置于試管內,加入2.5 mL蒸餾水和2.5 mL 0.1 mol/L三氟乙酸溶液,充分混勻,95 ℃水解8 h。快速降溫至20 ℃,4 000 r/min離心10 min,干燥沉淀。上清液用蒸餾水透析24 h,袋外透析液濃縮,調整pH至中性,真空干燥。袋內液加5倍體積無水乙醇,醇沉8 h,4 000 r/min離心10 min,上清液和沉淀分別冷凍干燥,將所有干燥樣品用氣相色譜分析。

1.3.9 高碘酸氧化 根據文獻[16]修改如下:準確稱取CLPS1 10 mg,用少量蒸餾水溶解,加入30 mmol/L NaIO40.5 mL定容至10 mL,20 ℃避光反應,每隔6 h取0.1 mL樣液至氧化完全為止。反應液稀釋250倍,以蒸餾水作對照,在波長223 nm處測光密度值,計算高碘酸的消耗量。

以溴甲酚紅作指示劑,用0.005 mol/L NaOH滴定2 mL反應液,計算甲酸生成量。

1.3.10 Smith降解 溶液用流水和蒸餾水分別透析24 h,濃縮,加入NaBH4反應10 h。用50% HAc中和至pH為7,流水及蒸餾水透析24 h。取1/3干燥后用于氣相色譜分析,剩余2/3用于Smith降解。

加入1∶1體積比的1 mol/L H2SO4,20 ℃水解40 h,BaCO3調整pH為6,過濾,濾液用蒸餾水透析48 h,袋外部分干燥做氣相色譜分析,袋內加乙醇,8 h后離心,上清液及沉淀部分分別干燥后做氣相色譜分析。

1.3.11 酯化還原反應 準確稱取N-環已基-3-(2-嗎林代已基)碳二亞胺對甲苯黃酸鹽0.75 g加入30 mL 1 mg/mL CLPS1水溶液中,用0.01 mol/L HCl調pH至4.75。反應3 h后,加入15 mL 2 mol/L KBH4,用4 mol/L HCl調pH值至中性,蒸餾水透析3 d,減壓干燥,重復反應,直至還原產物無半乳糖醛酸。將干燥過的還原產物甲基化3次,至甲基化完全,得到N-環已基-3-(2-嗎林代已基)碳二亞胺酯化還原后的甲基化產物。

1.3.12 甲基化分析 根據文獻[17]修改如下:

(1) CLPS1-二甲亞砜溶液的制備:稱取CLPS1 20.0 mg,溶于6 mL二甲亞砜(DMSO)中,充入惰性氣體N2封管,使CLPS1充分溶解。

(2) NaOH-DMSO混懸液的制備:將240 mg的NaOH與6 mL DMSO,充N2密封,研磨充分形成混懸液。

(3) 甲基化:將NaOH-DMSO混懸液加入CLPS1-DMSO溶液中,充N2密封,磁力攪拌1.5 h,加入3.6 mL碘甲烷,密封,反應7 min后加入6 mL蒸餾水,產物流水透析24 h,蒸餾水透析24 h。

(4) 萃取甲基化多糖:將反應液濃縮至10 mL,加入10 mL CHCl3,充分振蕩30 min,萃取甲基化多糖。用蒸餾水充分洗滌萃取液,真空干燥除去CHCl3至1 mL。

(5) 水解反應:將甲基化的多糖,加1 mL 85% HCOOH,充N2封管,沸水反應5 h,然后加調整pH為中性,低溫真空干燥,再加入2 mL 2 mol/L C2HF3O2,沸水水解6 h,調整pH為中性后除去乙醇。

(6) 還原反應:加入70 mg NaBH4反應24 h,常溫攪拌;然后加入少量強酸型陽離子交換樹脂,攪拌2 h后過濾,向濾液中加入甲醇去除硼酸至pH 7,低溫真空干燥。

(7) 乙酰化:加乙酐0.5 mL、吡啶0.5 mL,100 ℃反應2 h后低溫真空干燥。

1.3.13 數據分析 利用Excel整理數據,采用Microsoft Visio軟件繪圖,IBM SPSS Statistics25軟件對數據進行分析處理,各試驗重復3次。

2 結果與討論

2.1 Sephadex S-300葡聚糖凝膠柱層析

圖1～圖3為輪葉黨參多糖經DEAE-52纖維柱層析后,由Sephadex S-300葡聚糖柱色譜用蒸餾水洗脫得到的3個洗脫峰,分別對應CLPS1、CLPS2、CLPS3 3種多糖,其保留率分別為94.12%,92.31%,90.50%。CLPS1、CLPS2、CLPS3多糖洗脫曲線均為單一洗脫峰,并且峰形呈對稱狀態,證明每種組分為均一多糖。經前期試驗[18]得出,CLPS1、CLPS2、CLPS3組分對DPPH·清除能力的IC50值分別為(3.04±0.35),(3.87±0.36),(4.21±0.12) mg/mL,CLPS1的抗氧化性強于CLPS2和CLPS3。

圖1 CLPS1、CLPS2和CLPS3 Sephadex S-300葡聚糖凝膠層析曲線

2.2 糖醛酸含量測定

圖2為所得的半乳糖醛酸標準曲線。回歸方程為:Y=0.007 8X-0.018 5,R2=0.999 2。經測得CLPS1總糖含量為97.6%,糖醛酸為13.18%,說明得到的CLPS1組分純度較高。溫度20 ℃時,光源為D鈉光,波長589.3 nm,CLPS1比旋光度為右旋44.0。

圖2 半乳糖醛酸標準曲線

2.3 CLPS1相對分子質量分析

多糖的相對分子質量是影響多糖活性、水溶液狀態及其構型主要因素之一,由圖3可知,在保留時間為11.156 min時出峰,洗脫峰所對應的相對分子質量為91.7,此時色譜圖峰型呈對稱狀態,較狹窄,說明純度較高,相對分子質量分布范圍較小。

圖3 CLPS1高效液相色譜圖橫坐標

2.4 單糖組成分析

采用氣相色譜法對CLPS1單糖組成進行分析(圖4),CLPS1水解后檢測出5種單糖成分,根據保留時間判斷單糖分別是阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸和甘露糖,其摩爾比為2.7∶3.4∶2.3∶1.1∶0.5。葡萄糖和阿拉伯糖為主要成分,甘露糖含量最低,與對照組相比純化后的多糖沒有雜質。

圖4 CLPS1的氣相色譜圖

2.5 CLPS1的紅外光譜分析

由圖5可知,CLPS1紅外光譜圖出現與糖類結構相關的特征吸收峰,3 388 cm-1處的強吸收峰為O—H伸縮振動,因為多糖分子含有大量羥基,形成的分子內和分子間氫鍵使在3 388 cm-1處的峰特別寬。2 911 cm-1處出現的吸收峰為C—H伸縮振動,1 371 cm-1處吸收峰為C—H的特征吸收峰,在1 636 cm-1處強吸收峰為羧基離子的特征吸收峰,在1 415 cm-1的弱吸收峰是C—H的變角振動,說明有醇類物質存在,表明在CLPS1中存在糖醛酸。在1 061 cm-1處出現的吸收峰是糖環骨架C—O和C—O—C的伸縮振動為吡喃糖特征吸收峰。在842,889 cm-1處出現特征吸收峰說明存在α-構型和β-構型。根據紅外光譜特征峰表明CLPS1為酸性均一吡喃糖,結構中含有半乳糖醛酸、β-構型的多糖抗氧化能力可能顯著提高[19]。

2.6 CLPS1的1H NMR分析

采用核磁共振對CLPS1碳的基本骨架分析,由圖6可知,CLPS1化學位移在δH0與δH5.0 之間。高場區為δH2.11與δH2.12,說明結構中有O-乙酰基,在低場區δH5.19有強信號,為呋喃型的a-L-阿拉伯糖異頭質子,阿拉伯糖質子信號主要集中在δH5.1與δH5.5。在δH5.05左右處為a-D-半乳糖醛酸異頭質子。δH3.90處的強信號為半乳糖醛酸的異頭質子信號,這與單糖測定及紅外光譜檢測到的半乳糖醛酸在1 636,1 415 cm-1處出現吸收峰結果一致,均證實了有半乳糖醛酸和阿拉伯糖的存在,CLPS1為酸性多糖。

圖6 CLPS1的1H NMR圖譜

2.7 CLPS1的13C NMR分析

由圖7可知,高場區出現甲基峰其化學位移δC17.603,δC21.709出現信號峰說明有乙酰基,δC26.013 出現信號峰說明存在O-乙酰基,表明乙酰基取代在CLPS1殘基的不同位置,δC77.745 表明半乳糖中存在C-4取代。

圖7 CLPS1的13C NMR圖譜

2.8 部分酸水解產物分析

利用部分酸水解法對CLPS1組成進行分析,部分酸水解后結果如圖8所示。對CLPS1部分酸水解液直接離心,沉淀中有半乳糖、阿拉伯糖和微量的半乳糖醛酸,說明CLPS1主鏈主要由阿拉伯糖和半乳糖組成;從袋外透析液中檢測出半乳糖和葡萄糖,說明支鏈和主鏈的末端殘基是半乳糖和葡萄糖;經袋內醇沉后,在上清液中檢出半乳糖、葡萄糖和微量的半乳糖醛酸,證明CLPS1支鏈或主鏈邊緣含有半乳糖和葡萄糖;袋內醇沉、離心后,沉淀中檢出半乳糖和阿拉伯糖,說明CLPS1主要結構是由半乳糖和阿拉伯糖組成的。研究[20]證明,單糖種類較多的多糖可能對神經炎起到對抗作用,琵琶甲多糖由甘露糖、鼠李糖、氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸等10種單糖組成,10 μg/mL的琵琶甲多糖對脂多糖誘導的小鼠小膠質瘤細胞有一定抑制作用。

圖8 CLPS1酸水解氣相色譜分析

2.9 CLPS1高碘酸氧化與Smith降解

由表1可知,經完全酸水解后,水解液中檢測出甘油、赤蘚醇、半乳糖和半乳糖醛酸,未檢測到赤蘚酸、阿拉伯糖和葡萄糖,高碘酸能氧化葡萄糖和阿拉伯糖鍵型,存在甘油和赤蘚醇,說明CLPS1結構中有1→4,6、1→、1→2,6、1→2、1→6、1→4鍵型。半乳糖中有1→2,3,4、1→2,3、1→3、1→2,4、1→3,4、1→3,6;半乳糖醛酸為1→2,3,4、1→3,4、1→3、1→2,3、1→2,4;經Smith降解后袋內無沉淀,上清液中沒有檢測出目標物,說明主鏈部分已經氧化完全,袋外部分沒有檢測出赤蘚醇、阿拉伯糖和葡萄糖,檢測出半乳糖和半乳糖醛酸,說明半乳糖醛酸和半乳糖中不能被高碘酸氧化的鍵型與能被高碘酸氧化的鍵型間隔排列。

表1 CLPS1高碘酸氧化及Smith降解產物分析?

經過高碘酸氧化72 h,試樣和高碘酸用量分別為0.14 mmol,高碘酸和己糖消耗量摩爾比為0.98,生成0.04 mmol甲酸,甲酸生成量和己糖摩爾比為0.28。氧化反應結束后檢測出甲酸,說明半乳糖、葡萄糖存在1→或1→6鍵型。高碘酸反應量多于甲酸生成量,說明存在1→2、1→2,6、1→4、1→4,6鍵型。平均每摩爾己糖殘基產生0.291 mol甲酸,每10個己糖殘基有1→6糖苷鍵。

2.10 甲基化與酯化分析

由表2可知,CLPS1末端殘基為葡萄糖,半乳糖分支點是葡萄糖(1→4,6)、半乳糖(1→3,6);半乳糖有1→、1→3、1→4、1→6、1→3,6鍵型;葡萄糖有1→、1→4、1→4,6鍵型;阿拉伯糖只有1→5一種鍵型,其中阿拉伯糖(1→5)摩爾比為4.02,其次是半乳糖(1→6)摩爾比為1.60。半乳糖酯化前和酯化后數量增量差是因為半乳糖醛酸還原成了半乳糖。由表3可知,葡萄糖(1→)摩爾比為1.02,說明葡萄糖少數以端基碳原子的形式存在,葡萄糖(1→4)摩爾比為0.83,葡萄糖(1→4,6)摩爾比為1.10,說明多數葡萄糖以側鏈的形式存在,半乳糖多數以側鏈的形式存在,少數以端基碳原子形式存在,阿拉伯糖(1→5)全部以側鏈的形式存在,不存在端基碳原子。從表4可知,半乳糖(1→3)由還原前0.56增加到還原后的1.77,說明半乳糖醛酸可能含有1→3鍵型。半乳糖酯化前和酯化后數量差為半乳糖醛酸還原成半乳糖后的增量。由表5可知,半乳糖(1→3)數量增加,說明半乳糖醛酸可能含有1→3鍵型。

表2 CLPS1甲基化產物分析

表3 酯化還原后CLPS1甲基化產物分析

表4 CLPS1甲基化產物和酯化還原甲基化產物中半乳糖的對比分析

表5 CLPS1 甲基化糖摩爾比

3 結論

輪葉黨參經水提取醇沉、純化分離后得到輪葉黨參多糖組分1,其總糖含量為97.6%,糖醛酸為13.18%,相對分子質量為91.7。氣相色譜分析表明,輪葉黨參多糖組分1為一種結構復雜的酸性多糖,主要單糖組成為阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、甘露糖,其中葡萄糖含量最高。紅外光譜掃描發現,輪葉黨參多糖組分1具有多糖的特征吸收峰,含有α-和β-兩種苷鍵構型,主鏈由阿拉伯糖和半乳糖組成,半乳糖和葡萄糖形成支鏈和主鏈的末端殘基。β-構型吡喃糖且含有糖醛酸可能有助于提高多糖抗氧化能力[21],輪葉黨參多糖組分1結構中存在β-構型可能是輪葉黨參多糖組分1抗氧化能力較強的原因之一。另外,輪葉黨參多糖組分1結構中存在羧基、羥基、醛基和酮基等吸電子基團,能提供更多的氫離子中和自由基也提高了多糖的抗氧化能力。

多糖的結構決定著多糖的生物活性,已經證實一些植物多糖的抗氧化能力與單糖和糖苷鍵連接方式、空間構象、相對分子質量、官能團和支鏈的分支化程度以及單糖組成有關。有研究[22]表明,多糖活性與降解產生的多糖相對分子質量大小有關,輪葉黨參多糖組分1進一步降解產生低相對分子質量多糖可能會提高其抗氧化性。多糖的糖醛酸數量也與抗氧化能力呈正相關[23],輪葉黨參多糖組分1中糖醛酸的存在增加了其抗氧化能力。因此,研究多糖結構對分析多糖生理功能具有重要意義。后續將依據輪葉黨參多糖組分1結構特征對其生理活性展開深入研究。