基于熒光共振能量轉移的熒光適配體傳感器檢測食品中Cd2+

梁瑞瑞,白 天,金華麗*,索志光*

1.河南工業大學 糧油食品學院,河南 鄭州 450001

2.河南省食品和鹽業檢驗技術研究院,河南 鄭州 450008

鎘作為毒性最強的重金屬之一,通常經過工業排放、冶金、采礦等自然或人為活動排放到環境中,并以化合物的形式如硝酸鎘、氯化鎘和硫酸鎘等存在,水體和土壤是主要污染物[1-2]。因其生物富集性和不可降解性,常在植物和動物如大米、蝦、貝類中積累[3-5]。研究表明,鎘離子(Cd2+)的生物半衰期較長,可影響人體10～30 a[6]。長期暴露于含鎘環境中會導致骨質軟化、腎衰竭、肝病、神經系統缺陷等多種疾病[7-8]。國際癌癥研究機構(IARC)在1993年已將鎘列為第I類人類致癌物[9]。為保證食品安全,我國規定大米和糙米中鎘含量不能超過0.2 mg/kg,飲用水中最大允許量為0.005 mg/L[10]。因此,需要開發特異性好、靈敏度高的方法對Cd2+進行檢測。

傳統的重金屬檢測方法主要包括原子吸收光譜(AAS)[11]、電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)[12]、電感耦合等離子體原子發射光譜(ICP-AES)[13]和高效液相色譜[14]。上述方法雖然具有良好的準確度,但往往需要昂貴的儀器和專業的操作人員,并且無法滿足現場和快速檢測的要求。因此,建立一種簡單、快速、經濟、通用的檢測方法具有重要意義。適配體(Aptamer,Apt)是通過指數富集的配體系統進化(SELEX)技術體外篩選出的單鏈核苷酸序列(DNA或RNA),具備易于合成修飾、靶分子廣、穩定性好、成本低等優點,因其能與各種靶標分子高親和力和特異性結合,而被用作捕獲探針[15]。適配體可以與熒光基團、金納米顆粒、電化學納米復合材料等結合,兼容多種信號模式,如熒光、比色、電化學等,進而發展成多種檢測技術實現對各類靶標的檢測。Liu等[16]基于金納米顆粒(AuNPs)和殼聚糖修飾的玻碳電極以及Cd2+-適配體構建了一種簡便的電化學檢測方法,Cd2+的存在引發Apt構象變化并形成Cd2+-Apt復合物,可吸附更多電化學信號指示劑[Ru(NH3)6]3+,使峰值電流增加,對Cd2+的檢測限低至0.049 95 pmol/L,然而試驗較為耗時,長達12 h。Tao等[17]制備了AuNPs修飾的二硫化鉬納米復合材料作為酶模擬物,并將其與互補鏈連接構成信號探針。Cd2+與互補鏈競爭性地與Apt結合,最后通過TMB的顯色反應實現對目標物的檢測,操作簡單且結果肉眼可見,但是檢出限為6.23 nmol/L,靈敏度較低。Pan等[18]巧妙設計了一種無標記熒光生物傳感器,Cd2+誘導Apt形成發夾結構,暴露出引發劑序列,從而引發雙重鏈置換擴增反應,可生成大量的G-四鏈體序列,使染料NMM的熒光強度增強,可在2 h內實現5 pmol/L Cd2+的痕量檢測。

以上幾種方法相比,熒光生物傳感器在具備高靈敏度和穩定性的基礎上,還具有易于設計、操作簡單、耗時短和成本低的優點。常見的熒光分析技術基于熒光共振能量轉移效應(fluorescence resonance energy transfer,FRET)。其中,熒光供體的發射光譜與受體的吸收光譜有部分重疊,且兩個基團之間距離為1～10 nm,是此效應發生的關鍵條件[19]。Liu等[20]制備出猝滅效果較好的金納米花材料,并利用其與熒光基團FAM之間的FRET作用實現了對0.285 nmol/L Pb2+的檢測。基于FRET的熒光傳感技術因其靈敏度高、響應速度快、經濟等優點已成為現場和實時環境監測和食品安全檢測的強大工具。作者利用羧基熒光素(FAM)和黑洞猝滅劑(BHQ1)作為熒光能量供體和熒光能量受體,基于熒光共振能量轉移構建了一種步驟簡單、響應快速、靈敏度高、穩定性好的適配體傳感器。當Cd2+、Apt和cDNA三者同時存在時,Cd2+競爭性地與Apt結合形成Cd2+-Apt復合物,阻止FRET的發生,傳感器的熒光信號顯著增強。基于以上策略所設計的熒光適配體傳感器可用于多種食物樣品中Cd2+的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

Cd2+的核酸適配體(Apt-FAM)：5’-GGA CTG TTG TGG TAT TAT TTT TGG TTG TG-FAM-3’,源自之前篩選出的最優適配體Cd-4[21]。互補鏈1(cDNA1-BHQ1)(5’-BHQ1-CAC TAC CTA AAA TAT TAC CTC A-3’)、互補鏈2(cDNA2-BHQ1)(5’-BHQ1-CAC AAC CTA AAA TAT TAC CAC A-3’)、互補鏈3(cDNA3-BHQ1)(5’-BHQ1-CAC AAC CAA AAA TAA TAC CAC A-3’)：均由上海生工生物工程有限公司合成。自來水：校區實驗室;綠茶飲料、麥片：鄭州永輝超市。大米粉(編號CFAPA-QCB56A-1)和茶葉樣品(編號CFAPA-QC485A)：河南省產品質量監督檢驗研究院。

1.2 試劑與設備

20 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液：20 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L MgCl2、140 mmol/L NaCl,pH 7.4;Cd(NO3)2·4H2O：上海金山亭新化工試劑廠;G9800A熒光分光光度計：安捷倫(馬來西亞)。

1.3 試驗方法

1.3.1 傳感器的制備及檢測Cd2+

將10 μL Apt-FAM(1 μmol/L)加入200 μL離心管中,隨后依次加入10 μL cDNA-BHQ1(1 μmol/L)和10 μL終濃度100 nmol/L的Cd2+溶液,充分渦旋混勻并置于37 ℃振蕩孵育1.5 h,使得Cd2+競爭性與Apt-FAM結合,而多余的Apt-FAM通過堿基互補配對與cDNA-BHQ1形成雙鏈結構。向離心管中補充Tris-HCl緩沖溶液至200 μL,室溫下進行熒光掃描。設置激發波長490 nm,發射波長510～600 nm,在520 nm處記錄熒光強度,傳感器的響應值為熒光強度差值ΔF=F-F0,其中F和F0分別為含Cd2+和無Cd2+時傳感體系的熒光強度。

1.3.2 實際樣品處理

自來水和綠茶飲料不進行預處理。麥片充分研磨成粉后,采用微波消解法進行預處理。準確稱取0.500 0 g麥片,與8 mL硝酸和2 mL過氧化氫一同加入微波消化爐的消化罐中。設置反應溫度180 ℃,壓力2.8×106Pa,加熱時間12 min,保溫時間10 min。消化過程結束后,將含有消化溶液的消化罐置于160 ℃電加熱板上加熱,排酸,然后在室溫下冷卻,并用超純水定容至10 mL。最后,將Cd2+標準溶液與自來水、綠茶飲料及麥片樣品充分混合,使傳感體系中Cd2+的終濃度均為10、100、1 000 nmol/L,然后進行加標回收試驗。

1.4 數據處理與分析

使用Origin 2021處理和分析數據。

2 結果與分析

2.1 基于熒光共振能量轉移的熒光適配體傳感器檢測食品中Cd2+的原理

圖1為熒光適配體傳感器檢測Cd2+的設計原理。該傳感策略是基于適配體與Cd2+的特異性結合,以及Apt-FAM與cDNA-BHQ1之間的熒光共振能量轉移作用。首先,分別在適配體的3’端修飾FAM,其互補鏈的5’端標記BHQ1。當Cd2+不存在時,cDNA與Apt通過堿基互補配對形成雙鏈DNA,此時FAM與BHQ1之間的距離小于10 nm[22],FRET效率明顯提高,FAM熒光被猝滅,傳感器的熒光強度顯著降低(圖1(a))。其次,將Cd2+、cDNA和Apt三者同時孵育,Cd2+會優先與Apt特異性結合,形成具有特殊結構的Cd2+-Apt復合物,主要是因為Cd2+與鳥嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)堿基上的O和N形成了配位鍵[23]。Cd2+誘導的特殊結構阻止了cDNA與Apt的結合,保護FAM的熒光不被猝滅,傳感器的熒光信號增強(圖1(b))。最后,通過FAM熒光強度的變化可以實現對Cd2+的定量分析。

2.2 熒光適配體傳感器檢測Cd2+的可行性分析

利用不同條件下的熒光光譜驗證該傳感器檢測Cd2+的可行性。如圖2所示,初始狀態下,單獨Apt-FAM在溶液中的熒光強度為513(曲線a)。繼續向其中加入Cd2+標準溶液,傳感體系的熒光強度基本保持不變(曲線b),表明Cd2+所誘導的Apt的構象變化并不會影響FAM的熒光強度。當僅含Apt-FAM的傳感體系中加入cDNA-BHQ1后,熒光強度降低至128(曲線d),說明Apt與cDNA所形成的雙鏈結構使FAM與BHQ1距離縮短,誘發熒光共振能量轉移效應,能量供體FAM的熒光強度極大地被猝滅。而當傳感體系中同時引入100 nmol/L Cd2+和cDNA-BHQ1后,熒光強度為235(曲線c),明顯較強,說明Apt與Cd2+的高親和力結合誘導熒光探針形成Apt-Cd2+復合物,導致部分cDNA-BHQ1處于游離狀態,保護了FAM的熒光強度,充分表明該傳感器的熒光強度變化是由Cd2+決定的。

注：曲線a—d分別為Apt-FAM、Apt-FAM+100 nmol/L Cd2+、Apt-FAM+cDNA-BHQ1+100 nmol/L Cd2+、Apt-FAM+cDNA-BHQ1,a與b重合。圖2 傳感體系在不同條件下的熒光光譜Fig.2 Fluorescent spectra of the sensing system under different conditions

2.3 傳感器的試驗條件優化

為了獲得最佳的Cd2+檢測結果,優化了結合方式、互補鏈序列、cDNA與Apt的濃度比、孵育時間和溫度。前期試驗發現Apt、cDNA和Cd2+按照不同的方式進行孵育時得到不同的檢測結果。因此,首先探討了不同結合方式對目標物檢測的影響。圖3(a)顯示在3種不同結合方式下,加入Cd2+前后傳感器的熒光強度變化情況。由圖3(b)可知,Apt、cDNA和Cd2+同時進行孵育前后,ΔF最大。然而,當Apt先與cDNA孵育,再引入靶標Cd2+后,ΔF最小,是因為形成的雙鏈結構較為牢固,不會被Cd2+輕易破壞;當Apt先與Cd2+進行孵育,后加入cDNA,此時ΔF明顯比Apt先與cDNA孵育時的ΔF要大,而且比三者同時進行孵育時的ΔF要小,主要是因為相比于cDNA,Cd2+會優先與Apt特異性結合,已知Cd-4適配體對Cd2+的解離常數為34.5 nmol/L,對Cd2+具有較高的親和力[21]。因此,選擇Apt、cDNA和Cd2+同時進行孵育的方式進行以下試驗。

圖3 結合方式的優化Fig.3 Optimization of the binding mode

其次對互補鏈cDNA進行優化,最大限度地提高傳感器的分析性能。設計了3種不同的cDNA,其中cDNA1與Apt互補18個堿基,間隔4個A-T堿基對;cDNA2與Apt互補20個堿基,間隔2個A-T堿基對;cDNA3與Apt連續互補22個堿基。同時,在線預測了Apt和cDNA1、cDNA2、cDNA3在37 ℃形成的雙鏈DNA的二級結構(http：//www.nupack.org/)(圖4)。從圖5(a)可以看出,使用cDNA2制備的傳感器具有較低的背景熒光信號F0,引入Cd2+后,該傳感器的熒光信號也有較大的恢復。從圖5(b)可以看出,使用cDNA2制備的傳感器的ΔF最大。因此,選擇cDNA2作為后續試驗的互補鏈,并進一步研究了cDNA與Apt的濃度比對傳感器的影響。如圖5(c)所示,在保持Apt濃度不變的情況下,逐漸增加cDNA的濃度,熒光信號F0隨之降低。當引入Cd2+時,熒光信號F均有所增強。從圖5(d)可以看出,隨著cDNA與Apt的濃度比逐漸增加,ΔF逐漸增大,當濃度比為1∶1時,ΔF達到最大值,之后,過量的cDNA使ΔF有所降低,傳感器性能下降,主要因為均相體系中游離cDNA上的BHQ1會影響FAM的熒光強度。因此,選擇cDNA和Apt的濃度比為1∶1進行以下試驗。

圖4 Apt和3種不同互補鏈cDNA1、cDNA2、cDNA3形成的二級結構Fig.4 Secondary structures formed by Apt and three different complementary strands,cDNA1、cDNA2、cDNA3

注：(a)和(b)分別為不同互補鏈條件下的熒光光譜及熒光強度差值的變化;(c)和(d)分別為不同濃度比下的熒光光譜及熒光強度差值的變化。圖5 互補鏈和cDNA與Apt濃度比的優化Fig.5 Optimization of the complementary chain and the concentration ratio of cDNA to Apt

最后,為了節省時間和獲得最佳檢測結果,對孵育時間和溫度進行優化。如圖6(b)所示,當孵育60 min時,ΔF達到最大值,進一步增加孵育時間,ΔF沒有明顯增大。因此,將60 min選為最佳時間進行孵育。進一步考察了該傳感器在25、37、45 ℃下對Cd2+的檢測情況,從圖6(d)可以看出,37 ℃時傳感器的ΔF較大。當溫度升至45 ℃時,響應值略有下降,這可能與高溫導致復雜二級結構的解纏有關[24]。因此,選擇37 ℃為最佳孵育溫度。

注：(a)和(b)分別為不同孵育時間下的熒光光譜及熒光強度差值的變化;(c)和(d)分別為不同孵育溫度下的熒光光譜及熒光強度差值的變化。圖6 孵育時間和孵育溫度的優化Fig.6 Optimization of the incubating time and incubating temperature

2.4 基于熒光共振能量轉移的熒光適配體傳感器檢測食品中的Cd2+

在最佳條件下,研究了Cd2+濃度與FAM熒光強度之間的關系。由圖7(a)可知,隨著Cd2+濃度的增加,傳感器的熒光信號逐漸增加。由圖7(b)可知,在5～5 000 nmol/L范圍內,FAM的熒光強度差值ΔF與lg(CCd2+)的線性方程為ΔF=54.6 lgC+484.4 (R2=0.992),檢出限(LOD)為0.94 nmol/L,遠低于世界衛生組織和美國環境保護署設定的最大限制濃度27 nmol/L和44.5 nmol/L[25-26]。將該熒光適配體傳感器的檢測結果與之前檢測Cd2+的方法進行比較,如表1所示,與其他適配體傳感器相比,該試驗步驟簡單、檢測時間較短、檢測限較低,具有靈敏、方便、快速的優點。

表1 傳感器與其他檢測Cd2+的方法比較Table 1 Comparison of the sensor with other methods for detection of Cd2+

注：(a)不同Cd2+濃度(0、5、10、50、100、500、1 000、5 000、10 000 nmol/L)下傳感器的熒光光譜;(b)傳感器與不同濃度Cd2+(5、10、50、100、500、1 000、5 000、10 000 nmol/L)孵育后熒光強度差值的變化,插圖：FAM的ΔF與lg(CCd2+)的線性曲線(Cd2+濃度5～5 000 nmol/L)。圖7 Cd2+的標準曲線及對應的熒光光譜Fig.7 Standard curves and corresponding fluorescence spectra of Cd2+

2.5 傳感器的特異性研究

在最佳的試驗條件下,用該傳感器分別測定了10倍于Cd2+濃度的不同干擾離子(Mn2+、Zn2+、Cu2+、Mg2+、K+、Ba2+、Ni2+、Co2+、Li+、Pb2+)、所有干擾離子的混合樣、Cd2+以及Cd2+與所有干擾離子的混合樣。由圖8可知,盡管干擾離子的濃度是Cd2+濃度的10倍,傳感器的響應值ΔF仍然有極顯著差異(P<0.001)。單獨干擾離子的存在以及各種干擾離子的同時存在均不會使傳感器的響應值ΔF增大,只有當Cd2+存在于傳感體系中時,FAM的熒光強度才會發生顯著增強,表明該傳感器對Cd2+具有良好的特異性。

注：***表示差異極顯著(P<0.001);CCd2+=100 nmol/L。圖8 傳感器對Cd2+的特異性Fig.8 Specificity of the sensors for Cd2+

2.6 傳感器的重復性和再現性研究

在相同的試驗條件下,使用同一個傳感器對不同濃度的Cd2+(終濃度為10、100、1 000 nmol/L) 分別測定3次,以測試該傳感器的批內差異;同時,分別使用3個相同的傳感器對不同濃度的Cd2+(終濃度為10、100、1 000 nmol/L)進行檢測,以測試該傳感器的批間差異。結果表明檢測批內和批間無顯著性差異(P>0.05),說明該熒光適配體傳感器具備可接受的重復性和再現性。

2.7 實際樣品檢測

為了評估該傳感器的實用性,對自來水、綠茶飲料及麥片樣品進行加標檢測,結果如表2所示,Cd2+的回收率為90.3 %～110.7 %,RSD均低于10 %。另外,對質控樣品大米粉和茶葉中的Cd2+進行檢測,結果見表3,使用單一樣本T檢驗法對數據進行分析,大米粉樣品的t為0.676,茶葉樣品的t為0.197,均小于4.303(0.95,n=3),說明檢測值與認證值之間沒有顯著性差異。以上結果表明,該傳感器在實際樣品檢測方面性能優異。

表2 實際樣品的檢測結果Table 2 Determination results of real samples

表3 質控樣的檢測結果Table 3 Determination results of quality control samples

3 結論

基于FRET制備了一種靈敏、快速、穩定的熒光適配體傳感器,并成功對食品樣品中的Cd2+進行了檢測。將FAM與適配體結合作為能量供體和靶標捕獲探針,cDNA-BHQ1作為能量受體。當探針與樣品中的靶標Cd2+特異性結合時,傳感體系中熒光信號增強。該傳感器對5～5 000 nmol/L的Cd2+具有良好的線性響應,具有較低的檢測限,LOD為0.94 nmol/L。傳感器的制備過程簡單,在60 min內即可完成檢測,其他金屬離子的存在也不會對傳感器的檢測工作造成干擾,在自來水、綠茶、麥片、大米粉等樣品中,可以成功檢測Cd2+。因此,所構建的熒光適配體傳感器可用于實時、快速、現場檢測食品中的鎘。