基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究大黃-天南星治療缺血性腦卒中的分子生物學(xué)機(jī)制*

張曉璐，潘賜明，沈德連，段浩榮

1 廣西壯族自治區(qū)江濱醫(yī)院 廣西南寧 530001

2 云南中醫(yī)藥大學(xué) 云南昆明 650500

急性缺血性腦卒中是臨床常見(jiàn)的危急病之一，救治不及時(shí)則嚴(yán)重危害患者生活質(zhì)量，甚至喪失生命；中醫(yī)在《黃帝內(nèi)經(jīng)》就有相關(guān)記載，譬如《靈樞·九宮八風(fēng)》[1]載：“其有三虛而偏中于邪風(fēng)，則為擊仆偏枯矣”。秦漢時(shí)中風(fēng)的病因主要為外邪入侵、臟腑經(jīng)絡(luò)氣血虛衰、氣機(jī)乖戾、攝飲不當(dāng)?shù)萚2]。漢·華佗首次明確提出中風(fēng)運(yùn)用下法，如《中藏經(jīng)·論治中風(fēng)偏枯之法》載：“人病中風(fēng)偏枯……在中則瀉之……瀉，謂通其塞也”[3]。《金匱要略·中風(fēng)歷節(jié)病脈證并治》中用風(fēng)引湯“除熱癱癇”，暗含了下法治療“癱”的思想[4]。同時(shí)方中將大黃作為首藥，后世醫(yī)家不斷完善，在金元時(shí)期得到發(fā)展，及至明清下法在治療中風(fēng)達(dá)到了成熟與頂峰[5]。

基于數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果顯示，大黃、膽南星為治療中風(fēng)的常用高頻次藥物[6-7]。系統(tǒng)聚類(lèi)結(jié)果顯示，大黃、膽南星為治療卒中的常見(jiàn)組合，關(guān)聯(lián)規(guī)則分析膽南星-大黃的支持度高達(dá)72.88%，兩者相須為用，通腑滌痰[8-9]。有鑒于此，本研究利用生物信息技術(shù)，建立大黃-天南星藥對(duì)與缺血性腦卒中靶點(diǎn)治療網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測(cè)大黃-天南星藥對(duì)有效成分治療缺血性腦卒中的作用機(jī)制。

方 法

1 化學(xué)成分篩選活性成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

采用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)，分別檢索大黃、天南星的化學(xué)成分，將篩選條件限定為口服利用度OB ≥28%，創(chuàng)建txt 文檔，將符合條件的有效成分下載備用。

將候選活性成分導(dǎo)入TCMSP 平臺(tái)、ETCM 數(shù)據(jù)庫(kù)（http： //www.nrc.ac.cn： 9090/ETCM/index.php/Home/Index/index.html）[10]及SymMap 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（http：//www.symmap.org/）[11]，查詢候選化合物所有的潛在靶點(diǎn)。

2 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析

通 過(guò) 檢 索5 個(gè) 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（GeneCards、OMIM、Drugbank、TTD、PharmGkb）檢索疾病相關(guān)基因，分別下載相關(guān)基因，再利用R 語(yǔ)言VennDiagram 數(shù)據(jù)包得出大黃-天南星藥對(duì)潛在靶點(diǎn)和缺血性腦卒中相關(guān)靶點(diǎn)交集，最終將交集核心靶點(diǎn)構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)[12]。

3 GO 及KEGG 富集分析

將關(guān)鍵共有靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（Gene Ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto-Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析，最終使用R 軟件繪制GO 功能富集分析氣泡圖、KEGG氣泡圖以及通路圖[13]。

4 核心靶點(diǎn)的微陣列芯片驗(yàn)證

為檢驗(yàn)核心靶點(diǎn)的可靠性，以“stroke”為關(guān)鍵詞，檢索美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）的GEO 數(shù)據(jù) 庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），篩 選stroke相關(guān)的微陣列芯片數(shù)據(jù)集。通過(guò)GEOquery 包從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中下載，去除掉一個(gè)探針對(duì)應(yīng)多個(gè)分子的探針，當(dāng)遇到對(duì)應(yīng)同一個(gè)分子的探針時(shí)，僅保留信號(hào)值最大的探針，然后通過(guò)箱式圖查看樣本標(biāo)準(zhǔn)化的情況，通過(guò)PCA 圖以及UMAP 圖查看樣本分組間聚類(lèi)情況接著利用limma 包進(jìn)行兩組的差異分析，具體差異分析的情況見(jiàn)「結(jié)果情況」的差異分析。

結(jié) 果

1 活性化合物篩選

對(duì)大黃-天南星藥對(duì)在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)搜索化合物，按照OB ≥28%且DL ≥0.18 的標(biāo)準(zhǔn)篩選出共22個(gè)活性化合，其中大黃15、天南星7，見(jiàn)表1。

表1 活性藥物成分

2 疾病相關(guān)基因獲取

通過(guò)檢索5 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，即GeneCards（5545 個(gè)）、Drugbank（28 個(gè)）、PharmGkb（1 個(gè)）、TTD（34 個(gè)）、OMIM（個(gè)）數(shù)據(jù)庫(kù)檢索疾病相關(guān)基因，見(jiàn)圖1。

圖1 疾病相關(guān)基因合并圖

3 大黃-天南星藥對(duì)防治卒中靶點(diǎn)韋恩圖

利用R 語(yǔ)言VennDiagram 數(shù)據(jù)包得出大黃-天南星藥對(duì)潛在靶點(diǎn)和卒中相關(guān)靶點(diǎn)交集，共發(fā)現(xiàn)37 個(gè) 共 同 基 因，KCNH2、PTGS2、PGR、PTGS1、HSP90AA1、DRD1、CHRM1、SCN5A、ADRA1A、CHRM2、ADRA1B、ADRB2、CHRNA2、SLC6A4、OPRM1、GABRA1、BCL2、BAX、CASP9、JUN、CASP3、CASP8、PRKCA、PON1、MAP2、NR3C2、ADH1C、RXRA、ADRA2A、SLC6A2、SLC6A3、AKR1B1、PLAU、LTA4H、MAOB、MAOA、ADRB1。確定為大黃-天南星藥對(duì)治療卒中的靶基因，結(jié)果見(jiàn)圖2。將共有靶點(diǎn)輸入String 數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇置信度≥0.40 作為篩選的標(biāo)準(zhǔn)以構(gòu)建藥物與疾病蛋白相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖PPI 網(wǎng)絡(luò)，顏色越深，節(jié)點(diǎn)越大，表示該靶點(diǎn)與藥物和疾病的相關(guān)性越強(qiáng)。線條越多表示之間的關(guān)聯(lián)度越大，見(jiàn)圖3。使用R 軟件查找PPI 網(wǎng)絡(luò)核心靶點(diǎn)，其中CASP9、CASP3 和CASP8 靶標(biāo)體現(xiàn)出較高的中心度。

圖2 核心靶點(diǎn)篩選韋恩圖

圖3 核心靶點(diǎn)蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

4 大黃-天南星藥對(duì)靶點(diǎn)與卒中相互作用網(wǎng)絡(luò)

將大黃-天南星藥對(duì)的候選化學(xué)成分與缺血性腦卒中基因靶點(diǎn)通過(guò)Cytoscape 3.7.1 建立大黃-天南星藥對(duì)成分靶點(diǎn)-缺血性腦卒中靶點(diǎn)群網(wǎng)絡(luò)，青色三角形代表中藥潛在活性成分，外邊藍(lán)色菱形代表潛在的作用靶點(diǎn)，兩者的相互關(guān)系如圖所示，見(jiàn)圖4。

圖4 活性成分-靶點(diǎn)蛋白網(wǎng)絡(luò)圖

5 大黃-天南星藥對(duì)治療缺血性腦卒中的GO 功能與KEGG 富集分析

對(duì)3 個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能富集分析，選取最具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的前30 條，結(jié)果見(jiàn)氣泡圖，圖5。富集結(jié)果顯示：①在BP 中主要涉及膜電位的調(diào)節(jié)（regulation of membrane potential）、腺苷酸環(huán)化酶調(diào)節(jié)G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路（adenylate cyclase-modulating G protein-coupled receptor signaling pathway）、G 蛋白偶聯(lián)的受體信號(hào)通路，與神經(jīng)遞質(zhì)水平的環(huán)狀核苷酸第二信使調(diào)節(jié)相結(jié)合（G protein-coupled receptor signaling pathway，coupled to cyclic nucleotide second messenger regulation of neurotransmitter levels）等；②在CC 中靶點(diǎn)涉及膜區(qū)（membrane region）；③在MF中靶點(diǎn)相關(guān)分子功能主要包括G 蛋白偶聯(lián)的胺受體活性（G protein-coupled amine receptor activity）、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性（neurotransmitter receptor activity）、突觸后神經(jīng)遞質(zhì)受體活性（postsynaptic neurotransmitter receptor activity）等。

圖5 GO 富集氣泡圖

KEGG 富集結(jié)果提示大黃- 天南星藥對(duì)干預(yù)缺血性腦卒中主要涉及神經(jīng)活性配體- 受體相互作 用（Neuroactive ligand-receptor interaction）、神 經(jīng)變性的途徑- 多種疾病鈣信號(hào)傳導(dǎo)途徑（Pathways of neurodegeneration - multiple diseases Calcium signaling pathway）、血清素能突觸（Serotonergic synapse）、心肌細(xì)胞的腎上腺素信號(hào)傳導(dǎo)（Adrenergic signaling in cardiomyocytes）、人類(lèi)免疫缺陷病毒1 感染（Human immunodeficiency virus 1 infection）、帕 金森綜合征（Parkinson disease）等；見(jiàn)圖6。

圖6 KEGG 富集氣泡圖

6 核心靶點(diǎn)微陣列芯片驗(yàn)證結(jié)果

最終選定微陣列芯片數(shù)據(jù)集GSE97537。該數(shù)據(jù)集基于GPL1355[Rat230_2]Affymetrix Rat Genome 230 2.0 Array 陣列平臺(tái)，包括7 例腦卒中RNA 樣本和5 例正常RNA 樣本。由PCA 圖-樣本聚類(lèi)情況可見(jiàn)（圖7），基因表達(dá)譜區(qū)分度良好，保證了后續(xù)差異表達(dá)分析的準(zhǔn)確性。過(guò)濾后的分子總數(shù)為14378 個(gè)，其中滿足|log2（FC）|＞1 & p.adj＜0.05 閾值的ID 有223個(gè)，在這閾值下，在實(shí)驗(yàn)組（分組2）中高表達(dá)（logFC為正）的數(shù)目有215 個(gè)，在參考組（分組1）中高表達(dá)（logFC 為負(fù)）的數(shù)目有8 個(gè)；滿足|log2（FC）|＞1.5 &p.adj＜0.05 閾值的ID 有79 個(gè)，在這閾值下，在實(shí)驗(yàn)組（分組2）中高表達(dá)（logFC 為正）的數(shù)目有79 個(gè)，在參考組（分組1）中高表達(dá)（logFC 為負(fù)）的數(shù)目有0 個(gè)；滿足|log2（FC）|＞2 & p.adj＜0.05 閾值的ID 有34 個(gè)，在這閾值下，在實(shí)驗(yàn)組（分組2）中高表達(dá)（logFC 為正）的數(shù)目有34 個(gè)，在參考組（分組1）中高表達(dá)（logFC為負(fù)）的數(shù)目有0 個(gè)；如圖8 所示，樣本分開(kāi)并且PC1和PC2 的比例高，說(shuō)明分組間差異明顯，后續(xù)差異分析有意義的結(jié)果可能會(huì)比較多；經(jīng)典差異分析-火山圖，當(dāng)前閾值為|logFC|＞1 & 圖中P值＜0.05，見(jiàn)圖9。DEGs 與核心靶點(diǎn)取交集后得到3 個(gè)交集基因CASP3、CASP9 和CASP8，證明了上述分析的可靠性。

圖7 腦卒中數(shù)據(jù)集主成分分析

圖8 腦卒中樣本DEGs 火山圖

圖9 GSE97537 交集基因CASP3、CASP9 和CASP8表達(dá)量柱狀圖

7 交集基因CASP3、CASP9 和CASP8 表達(dá)量分析

首先，我們對(duì)微陣列芯片數(shù)據(jù)集GSE97537 中交集基因的達(dá)量進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，如圖9 所示；從統(tǒng)計(jì)描述表中可以看到：在Casp3 組中，實(shí)驗(yàn)組的平均水平為（9.067±0.475）對(duì)照組的平均水平為（8.087±0.028）；在Casp9 組中，實(shí)驗(yàn)組的平均水平為（7.887±0），對(duì)照組的平均水平為（7.888±0）；在Casp8 組中，實(shí)驗(yàn)組的平均水平為（6.764±0.102），對(duì)照組的平均水平為（6.53±0.068）；獨(dú)立樣本T 檢驗(yàn)結(jié)果顯示：在Casp3 組中，對(duì)照組低于實(shí)驗(yàn)組的平均水平，兩組的差值為-0.98（-1.46 ～-0.499），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= -4.540，P= 0.001）；在Casp9 組中，對(duì)照組低于實(shí)驗(yàn)組的平均水平，兩組的差值為0（-0），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 4.857，P= 0.001）；在Casp8 組中，對(duì)照組低于實(shí)驗(yàn)組的平均水平，兩組的差值為-0.234（-0.351 ～-0.116），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= -4.431，P= 0.001）。

討 論

近15 年我國(guó)缺血性腦卒中患者由1044/10 萬(wàn)上升至1256/10 萬(wàn)，現(xiàn)患人數(shù)高居世界首位，而且具有高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率、高致殘率和高病死率的特點(diǎn)[14]。中風(fēng)發(fā)作期多見(jiàn)實(shí)證，其中痰、瘀是主要病理因素[15-16]。因此在發(fā)作期治療則急則治標(biāo)，《金匱要略》[17]“夫病痼疾加以卒病，當(dāng)先治其卒病，后乃治其痼疾也”。金元時(shí)期強(qiáng)調(diào)中風(fēng)“內(nèi)傷”學(xué)說(shuō)，強(qiáng)度火、虛、痰等致病因素[18]。朱丹溪特別重視痰邪這一致病因素，如《丹溪心法·中風(fēng)》[19]載：“中風(fēng)大率主血虛有痰，治痰為先”。力倡治痰在中風(fēng)病治法中的指導(dǎo)作用[20]。筆者認(rèn)為，中風(fēng)可以是由郁到痰瘀的過(guò)程，先有無(wú)形之郁，此時(shí)氣機(jī)阻止，久則有形之邪內(nèi)生，痰瘀則為代表。黃元御從“土濕陽(yáng)衰，木郁侮土”立論治療中風(fēng)，著重調(diào)整臟腑氣機(jī)[21]。臨床所見(jiàn)，閉證多而脫證少，初起即出現(xiàn)脫證者更少[22]。對(duì)于發(fā)作期患者，標(biāo)實(shí)是當(dāng)務(wù)之急，因此，通腑法作為中風(fēng)病急性期的常用治法受到臨床普遍重視和廣泛應(yīng)用[23]。中風(fēng)治法中通、調(diào)最為關(guān)鍵，其次補(bǔ)之[24]。

通腑瀉濁法能夠減輕痰瘀、增強(qiáng)胃腸蠕動(dòng)，調(diào)節(jié)腦腸肺軸功能，進(jìn)一步減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，改善患者神經(jīng)功能缺損[25]。生大黃逐瘀通經(jīng)、瀉熱通腸，《神農(nóng)本草經(jīng)》載：“味苦，寒。主下淤血，血閉，寒熱，破癥瘕積聚，留飲，宿食，蕩滌腸胃，推陳致新，通利水谷，調(diào)中化食，安和五臟”[26]。通過(guò)內(nèi)服、保留灌腸均具有較好的臨床療效[27-28]。大黃提取物通過(guò)降低炎癥水平，進(jìn)一步抑制缺血側(cè)腦細(xì)胞凋亡，最終發(fā)揮腦保護(hù)作用[29]。大黃的作用機(jī)制已經(jīng)得到了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。膽南星祛風(fēng)化痰，李中梓的《雷公炮制藥性解》載：“味苦、辛，性平，有毒，入脾、肺二經(jīng)。主中風(fēng)牙關(guān)緊閉，痰盛麻痹，下氣破堅(jiān)積，消癰腫，利胸膈，散血墮胎，搗敷疥癬瘡毒并蛇蟲(chóng)咬傷。沸水泡七次，以牛膽汁收其末入膽，久懸風(fēng)處更佳”[30]。缺血性中風(fēng)痰瘀阻絡(luò)則貫穿本病始終，故治療清熱祛痰為著力點(diǎn)，膽南星清熱化痰以通腑，能夠快速減輕病癥，防治繼續(xù)發(fā)展[31]。膽南星為天南星炮制品，專主風(fēng)痰，清火化痰作用較強(qiáng)[32]。大黃成分類(lèi)型和藥理作用主要有蒽醌類(lèi)：抗病毒；蒽酮類(lèi)：抗氧化、抗炎和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等；吡喃酮類(lèi)：抗氧化；二苯乙烯類(lèi)：清除自由基、抗衰老等；本丁酮類(lèi)：抗炎鎮(zhèn)痛；酰基糖苷類(lèi)：促進(jìn)細(xì)胞免疫；萘苷類(lèi)：雌激素樣作用。膽南星成分類(lèi)型和藥理作用主要有發(fā)揮性物質(zhì)：抗菌、抗病毒等；膽汁酸類(lèi)：解熱、抗菌、抗炎及抗病毒等[33]。本研究發(fā)現(xiàn)治療缺血性腦卒中的大黃-天南星藥對(duì)活性成份主要有大黃素、β-谷固醇、谷甾醇、托拉內(nèi)酯、大黃酸等，大黃素和大黃酸具有抗炎、抗腫瘤、抗纖維化等生物活性，同時(shí)能夠增加斑塊的穩(wěn)定性[34]。

PPI 網(wǎng)絡(luò)表明，靶標(biāo)體現(xiàn)出較高的中心度有CASP9、CASP3 和CASP8；同時(shí)這三個(gè)基因是GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中轉(zhuǎn)錄組學(xué)微陣列芯片數(shù)據(jù)集GSE97537 中交集基因，微陣列芯片數(shù)據(jù)集GSE97537 同步驗(yàn)證了CASP9、CASP3 和CASP8 在腦卒中組和健康組的表達(dá)量對(duì)比有差異。

CASP3 基因編碼的蛋白質(zhì)是一種半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶，在細(xì)胞凋亡的執(zhí)行階段起著核心作用。編碼的蛋白質(zhì)在裂解和激活甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白以及半胱天冬酶6，7 和9 的同時(shí)，裂解和失活聚（adp -核糖）聚合酶。這種蛋白質(zhì)本身由caspase 8，9和10 處理。它是參與淀粉樣β 4A 前體蛋白裂解的主要半胱天冬酶，該蛋白神經(jīng)元死亡有關(guān)。

CASP9 和CASP8 基因編碼半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶（caspase）家族的成員。連續(xù)激活的caspases在細(xì)胞凋亡的執(zhí)行階段起著核心作用。半胱天冬蛋白酶作為非活性的前酶存在，在保守的天冬氨酸殘基上經(jīng)過(guò)蛋白質(zhì)水解過(guò)程產(chǎn)生大大小小的兩個(gè)亞基，它們二聚形成活性酶。CASP9 蛋白可經(jīng)過(guò)細(xì)胞色素c和凋亡肽酶激活因子1 的蛋白復(fù)合物凋亡小體的自蛋白水解處理和激活；這一步被認(rèn)為是caspase 激活級(jí)聯(lián)中最早的一步。這種蛋白質(zhì)被認(rèn)為在細(xì)胞凋亡和腫瘤抑制中起著重要作用CASP8 蛋白參與Fas 和各種凋亡刺激引起的程序性細(xì)胞死亡。該蛋白的n端類(lèi)FADD 死亡效應(yīng)域提示其可能與fas 相互作用蛋白FADD 相互作用。這種蛋白質(zhì)在亨廷頓病患者受影響的腦區(qū)不溶性部分中被檢測(cè)到，但在正常對(duì)照組中沒(méi)有檢測(cè)到，這暗示了它在神經(jīng)退行性疾病中的作用。CASP 參與細(xì)胞凋亡，是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)[35]。

CASP3 在小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)活躍，而活躍的CASP3 表達(dá)僅限于Ⅱ/Ⅲ層，CASP3 被認(rèn)為在發(fā)育過(guò)程中參與神經(jīng)元凋亡，被認(rèn)為是腦缺血、創(chuàng)傷性腦損傷、脊髓損傷和腦出血后細(xì)胞死亡的關(guān)鍵介導(dǎo)因子，CASP3 也被證明在細(xì)胞增殖和分化中發(fā)揮非凋亡作用[36]。CASP3 在腦卒中恢復(fù)過(guò)程中的非凋亡作用。一項(xiàng)研究顯示，由缺血腦培養(yǎng)的新生神經(jīng)元前體細(xì)胞表達(dá)的裂解CASP3 抑制了其自我更新；同時(shí)神經(jīng)原性小龕中局部上調(diào)裂解CASP3 對(duì)新生神經(jīng)元前體細(xì)胞的增殖、遷移和成熟非常重要，抑制CASP3 活性可以改善腦卒中后的功能恢復(fù)[37]。CASP9 是caspase 蛋白酶家族的一員，是caspase 蛋白酶凋亡的啟動(dòng)者，是腦缺血神經(jīng)退行性變的調(diào)節(jié)因子，也是促進(jìn)腦卒中細(xì)胞死亡CASP6 激活的早期中介因子[38]。

CASP8 在大多數(shù)皮質(zhì)神經(jīng)元中均可檢測(cè)到組成性表達(dá)，CASP8 表達(dá)主要在V 層，且早在永久性大腦中動(dòng)脈閉塞致大鼠局灶性卒中后6h，就發(fā)現(xiàn)蛋白水解過(guò)程產(chǎn)生活性形式的CASP8[39]。在人缺血性中風(fēng)受試者死后組織中的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中激活CASP8 和CASP3，CASP8 激活后裂解下游的caspase并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[40]。

綜上，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)轉(zhuǎn)錄學(xué)驗(yàn)證的方法分析了大黃-天南星治療缺血性腦卒中的作用機(jī)制，得出的結(jié)論是：大黃-天南星對(duì)藥可能是通過(guò)抑制CASP3，CASP8 和CASP9 通路進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡而發(fā)揮治療缺血性腦卒中作用。