腦神經炎癥對小鼠運動疲勞的影響及其可能機制

曹奕煒，宋 睿，吳 寧，李 錦

（1.南京中醫藥大學研究生院，江蘇 南京 210023；2.軍事科學院軍事醫學研究院毒物藥物研究所，神經精神藥理學北京市重點實驗室，抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室，北京 100850）

運動疲勞通常被認為是由于長時間高強度的體力運動引起的肌肉活動度下降與主觀疲勞感，在體力勞動、體育競技及軍事領域會產生重大負面影響，深入研究運動疲勞產生的機制并發現延緩運動疲勞的措施具有重要意義。目前關于運動疲勞機制的研究主要集中在骨骼肌等外周組織和心臟等器官，但中樞神經系統在其中也發揮重要作用。支配肌肉運動的運動相關腦區發放神經沖動減少是引起肌群活動度下降的根源，最終可導致動作發力終止和運動能力降低，而腦能量代謝平衡是中樞神經系統持續發放神經沖動的重要保障。

運動過程中伴隨外周骨骼肌細胞乳酸堆積并釋放進入血液循環。乳酸一直被認為是代謝終產物，但有研究顯示，外源性乳酸可維持腦切片細胞突觸活動［1］，神經元從低氧狀態下恢復也需乳酸作為必要的能量底物［2］，提示乳酸可作為神經元的能量底物。近年來研究發現，大腦在執行高水平認知活動時，神經元主要依靠乳酸（而非葡萄糖）作為能量底物產生ATP，維持突觸活動［3］；在高強度運動情況下，腦葡萄糖攝取隨著運動強度的增加而降低，提示大腦可能利用乳酸補償在高強度運動期間維持神經元活動所需的能量［4］。星形膠質細胞-神經元乳酸穿梭是神經元乳酸的主要來源，而單羧酸轉運體1（monocarboxylate transporter-1，MCT-1）、MCT-2 和MCT-4 分別是星形膠質細胞釋放乳酸和神經元攝取乳酸的通道，其表達水平與乳酸轉運能力正相關［5］。運動過程中腦神經元是依靠葡萄糖還是乳酸供能一直存在爭議。2017 年Matsui 等［6］報道，阻斷神經元乳酸攝取可縮短大鼠跑臺力竭運動時間，提示高強度耐力運動中大腦神經元也是以乳酸作為能量底物，而提高神經元乳酸供給可能延緩運動疲勞的發生。但MCT 各亞型在外周組織中亦廣泛表達，因此很難實現對星形膠質細胞-神經元乳酸穿梭的選擇性干預。

研究報道，耐力運動伴隨著外周和腦炎癥水平的升高［7-9］，降低運動引起的外周血、肌肉及肝炎癥水平可延緩運動疲勞發生［10-12］，但腦神經炎癥是否是運動疲勞發生的原因尚未見報道。本研究采用小鼠跑臺實驗和負重游泳實驗2種力竭運動模型研究腦神經炎癥狀態與運動疲勞之間的因果關聯，并從對星形膠質細胞-神經元乳酸穿梭影響的角度探討其可能機制，為深入了解運動疲勞的中樞機制、尋找延緩疲勞的新的潛在干預措施提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑和主要儀器

雄性C57BL/6J 小鼠，體重20～24 g，購自北京斯貝福生物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2019-0010。所有實驗小鼠均常規飼養于含有玉米芯墊料的鼠籠中，室溫恒定于20～24 ℃，濕度為20%～25%，12 h 晝夜交替，不限制飲水進食。實驗動物的使用遵守軍事醫學研究院動物管理細則。

炎癥誘導劑脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）、小膠質細胞激活抑制劑米諾環素（minocycline）和二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），美國Sigma-Aldrich 公司；MCT-1 和MCT-4 共抑制劑AZD3965 及MCT-2 抑制劑4-CIN，美國Med Chem Express 公司；Trizol 試劑，美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒和實時定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）試劑盒，德國QIAGEN 公司。前炎性細胞因子白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及MCT-1、MCT-2和MCT-4引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列見表1。

Tab.1 Primer sequences for real-time quantitative PCR（RT-qPCR）

YLS-31A 大小鼠轉棒測試儀，濟南益延科技發展有限公司；SA101C動物跑臺，江蘇賽昂斯生物技術有限公司；梯度PCR 儀，德國PowerCycler 公司；LightCycler?96 實時熒光定量PCR 儀，瑞士羅氏公司。

1.2 藥物配制、動物分組和處理

LPS和米諾環素溶于生理鹽水，AZD3965溶于含10%DMSO生理鹽水，4-CIN溶于含15%DMSO生理鹽水，均采用側腦室注射方式（intracerebroventricular injection，icv）給藥，給藥體積為每只小鼠5 μL。小鼠icv 給予炎癥誘導劑LPS 誘導腦神經炎癥狀態，icv給予小膠質細胞激活抑制劑米諾環素抑制腦神經炎癥狀態；icv 給予MCT-1 和MCT-4 共抑制劑AZD3965 阻斷星形膠質細胞乳酸釋放，icv給予MCT-2抑制劑4-CIN阻斷神經元乳酸攝取。

①藥物對小鼠運動協調性的影響實驗分組：分為溶劑對照和LPS 組（每只2.5 μg）、米諾環素組（每只12 μg）、AZD3965 組（每只50 nmol）、4-CIN組（每只40 nmol），每組12只。②米諾環素對小鼠運動疲勞的影響實驗分組：小鼠跑臺實驗分為溶劑對照和米諾環素3 個劑量組（每只3，6 和12 μg），每組12只；小鼠負重游泳實驗分為溶劑對照和米諾環素組（每只12 μg），每組12 只。③LPS 對小鼠運動疲勞及大腦運動皮質前炎性細胞因子和MCTmRNA 表達的影響及米諾環素的阻斷作用實驗分組：分為溶劑對照、LPS（每只2.5 μg）和LPS+米諾環素組（每只2.5 μg+12 μg），每組12 只。④AZD3965 和4-CIN 對小鼠運動疲勞的影響實驗分組：小鼠跑臺實驗分為溶劑對照和AZD3965 3個劑量組（每只12.5，25 和50 nmol）或4-CIN 3 個劑量組（每只10，20 和40 nmol）；小鼠負重游泳實驗分為溶劑對照和AZD3965 組（每只50 nmol）或4-CIN組（每只40 nmol），每組12只。

參考文獻［6，13-14］，LPS 給藥后12 h 和米諾環素給藥后30 min 進行動物行為學測試或處死取大腦運動皮質；LPS 聯合米諾環素給藥為LPS 給予后12 h給予米諾環素，30 min后進行動物行為學測試或處死取大腦運動皮質；AZD3965 和4-CIN 給藥后30 min進行動物行為學測試。

1.3 小鼠轉棒實驗

小鼠正式測試前預適應轉棒3 d，每天1次。預適應時轉棒起始轉速為1 r·min-1，最終轉速為10 r·min-1，轉棒持續時間300 s。最終選擇在第3 天適應時在300 s 內從轉棒上落下次數＜3 次的小鼠進行正式測試。正式測試時轉棒起始轉速為1 r·min-1，在15 s 內加速至25 r·min-1，測試截止時間為300 s。通過測試小鼠在轉棒上保持平衡的時間（在棒時間），對小鼠的運動協調性進行評估。

1.4 小鼠負重游泳實驗

使用高50 cm、直徑15 cm 的玻璃水缸為容器，每次實驗加入水，深度為25 cm；使用調節熱水比例的方式調整水溫為23～25 ℃。小鼠正式測試前進行預適應。預適應時不在尾部捆綁鉛皮卷，自由游泳3～5 min。正式測試時小鼠尾根部捆綁5%體重的鉛皮卷，完全打濕毛發后進行測試。小鼠保持平衡漂浮不動時采用玻璃棒輕推驅趕。當小鼠沒于水面以下＞8 s、無法繼續維持游泳運動時判定小鼠力竭疲勞，同時記錄小鼠負重游泳時間。

1.5 小鼠跑臺實驗

參考文獻［15］的實驗方法進行3 d 跑臺訓練預適應。第1 次訓練前將小鼠置跑道內自由探索1～3 min 熟悉環境。然后采用逐級遞增的速度進行跑臺訓練，每天1次。每次訓練結束后使用抹布清理跑臺通道，并噴涂乙醇、使用抹布擦拭去除氣味。訓練方案如下。

第1 天：2 m·min-1（1 min）→4 m·min-1（1 min）→6 m·min-1（1 min）→8 m·min-1（1 min）→9 m·min-1（2 min）→10 m·min-1（4 min）。

第2天：4 m·min-1（1 min）→6 m·min-1（1 min）→8 m·min-1（1 min）→10 m·min-1（2 min）→11 m·min-1（3 min）→12 m·min-1（5 min）。

第3天：8 m·min-1（1 min）→10 m·min-1（1 min）→11 m·min-1（2 min）→12 m·min-1（3 min）→13 m·min-1（5 min）→14 m·min-1（8 min）。

正式測試時跑臺速度設置為：14 m·min-1（2 min）→16 m · min-1（3 min）→18 m · min-1（25 min）→20 m·min-1（15 min）→22 m·min-1（15 min）→24 m·min-1（15 min）→26 m·min-1（≥60 min）。跑臺速度程序最高速度為26 m·min-1。

當小鼠無法在跑臺通道上繼續維持跑步，長時間處在跑道末端或伏地式前進，且跑臺電擊與人為驅趕也無法使其跑至跑道前端時判定為小鼠力竭疲勞，記錄跑步持續時間和距離。為確保疲勞判斷的準確性，采用盲法判定小鼠疲勞狀態。

1.6 RT-qPCR 測定小鼠大腦運動皮質前炎性細胞因子和MCT mRNA水平

給藥結束后處死小鼠取腦，于冰上快速分離運動皮質腦區組織，保存于盛有預冷Trizol 試劑的1.5 mL EP管內，于-80 ℃冰箱保存。

參考RNA 提取試劑盒的流程提取組織總RNA，用蛋白核酸分析儀對RNA 的濃度和質量進行測定。A260nm/A280nm值在1.9～2.1 范圍內，表明RNA 樣品合格，用于進行后續RT-qPCR 實驗。逆轉錄和RT-qPCR 實驗分別按說明書步驟進行，測定IL-1β，IL-6和TNF-α及MCT-1，MCT-2和MCT-4mRNA 表達。以β 肌動蛋白為內參基因，用2-ΔΔCt法計算待測基因mRNA相對表達水平。

1.7 統計學分析

對滿足正態性與方差齊性的實驗結果數據用±s表示，否則采用中位數±四分位間距（median±interquartile）表示。用SPSS 24.0軟件進行統計學分析。首先采用Levene 檢驗和Shapiro-Wilk 檢驗對數據的方差齊性和正態性進行檢驗；若數據滿足正態性與方差齊性，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析結合Bonferroni檢驗；若數據不滿足上述條件則采用Mann-Whitney非參數檢驗（兩組間比較）或Kruskal-Wallis 非參數檢驗（多組間比較）進行分析。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 LPS、米諾環素、AZD3965 和4-ClN 對小鼠運動協調性的影響

與溶劑對照組比較，LPS（2.5 μg）、米諾環素（12 μg）、AZD3965（50 nmol）和4-CIN（40 nmol）對小鼠轉棒實驗中在棒時間均無明顯影響（圖1），提示上述藥物處理不影響小鼠的運動協調性，可排除對小鼠跑臺實驗和負重游泳實驗的干擾。

Fig.1 Effects of lipopolysaccharides（LPS）（A），minocycline（B），AZD3965（C）and 4-ClN（D）administration on motor coordination of mice. Mice were intracerebroventricularly injected（icv）with LPS（2.5 μg per mouse）12 h before the rotate bar test，while minocycline（12 μg per mouse），AZD3965（50 nmol per mouse）and 4-CIN（40 nmol per mouse）were injected 30 min before the rotate bar test.The injection volume was 5 μL per mouse.Median±interquartile，n=12.

2.2 米諾環素對小鼠運動疲勞的影響

小鼠跑臺實驗結果表明，與溶劑對照組比較，米諾環素（12 μg）組小鼠運動持續時間和運動距離顯著增加（P＜0.01），3 和6 μg 組兩指標均無明顯變化（圖2A1和A2）。小鼠負重游泳實驗結果表明，與溶劑對照組比較，米諾環素（12 μg）組小鼠游泳持續時間顯著增加（P＜0.01，圖2B）。

Fig.2 Effects of minocycline on exercise capacity of mice.Mice were icv with minocycline（3，6 and 12 μg per mouse）30 min before the treadmill test.Mice were icv with minocycline（12 μg per mouse）30 min before the load swimming test.The injection volume was 5 μL per mouse. A1 and A2：running duration and distance covered by mice on the treadmill，respectively；B：swimming time of mice.±s，n=12.＊＊P＜0.01，compared with vehicle group.

2.3 LPS 對小鼠運動疲勞的影響及米諾環素的阻斷作用

在小鼠跑臺實驗中，與溶劑對照組比較，LPS（2.5 μg）組小鼠運動持續時間和運動距離顯著降低（P＜0.01）；與LPS 組比較，LPS+米諾環素（2.5 μg+12 μg）組小鼠運動持續時間和運動距離顯著增加（P＜0.01）（圖3A1 和A2）。在小鼠負重游泳實驗中，與溶劑對照組比較，LPS 組小鼠游泳持續時間顯著減少（P＜0.01）；與LPS 組比較，LPS+米諾環素組小鼠游泳持續時間顯著增加（P＜0.05）（圖3B）。

Fig.3 Effects of minocycline on exercise capacity of mice. Mice were icv with LPS（2.5 μg per mouse）12 h，minocycline（12 μg per mouse）30 min or icv minocycline（12 μg per mouse）30 min after icv with LPS（2.5 μg per mouse）12 h before the treadmill test and the load swimming test. The injection volume was 5 μL per mouse. A1 and A2：running duration and distance covered by mice on the treadmill，respectively；B：swimming time of mice.±s，n=10-12. ＊＊P＜0.01，compared with vehicle group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with LPS group.

2.4 AZD3965和4-ClN對小鼠運動疲勞的影響

小鼠跑臺實驗結果表明，與溶劑對照組比較，AZD3965（50 nmol）組小鼠運動持續時間和運動距離顯著降低（P＜0.01），12.5 和25 nmol 組無明顯變化（圖4A1 和A2）；4-CIN（40 nmol）組小鼠運動持續時間和運動距離顯著降低（P＜0.05），10 和20 nmol 組無明顯變化（圖4B1 和B2）。小鼠負重游泳實驗結果表明，與溶劑對照組比較，AZD3965（50 nmol）組小鼠游泳持續時間顯著降低（P＜0.01，圖4C）；4-CIN（40 nmol）組小鼠游泳持續時間顯著降低（P＜0.05，圖4D）。

Fig.4 Effects of AZD3965 and 4-ClN on exercise capacity of mice. Mice were icv with AZD3965（12.5，25 and 50 nmol per mouse）or 4-CIN（10，20 and 40 nmol per mouse）30 min before the treadmill test. Mice were icv with AZD3965（50 nmol per mouse）or 4-CIN（40 nmol per mouse）30 min before the load swimming test. The injection volume was 5 μL per mouse. A1 and A2：running duration and distance covered by mice on the treadmill，respectively，after icv AZD3965；B1 and B2：running duration and distance covered by mice on the treadmill，respectively，after icv 4-CIN；C：swimming time of mice after icv AZD3965；D：swimming time of mice after icv 4-CIN.±s，n=12.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with vehicle group.

2.5 LPS 對小鼠大腦運動皮質前炎性細胞因子mRNA表達水平的影響及米諾環素的逆轉作用

與溶劑對照組比較，LPS（2.5 μg）組小鼠大腦運動皮質IL-1β，IL-6和TNF-αmRNA 水平均顯著升高（P＜0.01），提示icv 給予LPS 可誘導小鼠處于高水平的腦神經炎癥狀態。與LPS組比較，LPS+米諾環素（2.5 μg+12 μg）組小鼠大腦運動皮質IL-1β和TNF-αmRNA 水平顯著下降（P＜0.05），IL-6mRNA水平無明顯變化（圖5），提示米諾環素可降低LPS誘導的神經炎癥水平升高。

Fig.5 Effect of minocycline on IL-1β（A），IL-6（B）and TNF-α（C）mRNA expressions of motor cortex of mice.Mice were icv with LPS（2.5 μg per mouse）12 h or minocycline（12 μg per mouse）30 min before the mice were sacrificed. The injection volume was 5 μL per mouse.±s，n=10-12.＊＊P＜0.01，compared with vehicle group；#P＜0.05，compared with LPS group.

2.6 LPS 對小鼠大腦運動皮質MCT mRNA 表達水平的影響及米諾環素的逆轉作用

與溶劑對照組比較，LPS（2.5 μg）組小鼠大腦運動皮質MCT-1，MCT-2和MCT-4mRNA 水平均顯著降低（P＜0.05）；與LPS 組比較，LPS+米諾環素（2.5 μg+12 μg）組小鼠大腦運動皮質MCT-1，MCT-2和MCT-4mRNA 水平均顯著升高（P＜0.01），且接近溶劑對照組水平（圖6）。

Fig.6 Effect of minocycline on MCT-1（A），MCT-2（B）and MCT-4（C）mRNA expressions of motor cortex of mice.See Fig.5 for the mouse treatment.±s，n=10-12.＊P＜0.05，compared with vehicle group；##P＜0.01，compared with LPS group.

3 討論

疲勞的定義為“機體生理過程不能將其機能持續在特定水平上或器官不能維持其預定的運動強度”。疲勞發生的學說主要包括能量耗竭學說、代謝產物堆積學說、內環境穩態失調學說、自由基影響理論等，其中“能量耗竭學說”占主導地位。現有運動疲勞機制的研究主要集中在外周組織器官。本研究以中樞神經系統為切入點，進一步探究運動疲勞產生的中樞機制。腦能量代謝具有與外周組織器官顯著不同的特點。盡管依然存在一些爭議，但越來越多的研究傾向于認為在大腦進行高強度認知活動時神經元以乳酸作為主要的能量底物。神經元很少儲存能量底物，星形膠質細胞糖酵解產生的乳酸經由星形膠質細胞-神經元乳酸穿梭進入神經元中，通過三羧酸循環及線粒體氧化磷酸化生成ATP，維持神經元的興奮性及突觸活動［16］。但運動過程中腦神經元是否依賴于乳酸作為能量底物、維持運動相關腦區神經元興奮性及機體運動狀態，尚存在爭議。本研究采用2種經典的嚙齒類動物耐力運動實驗（小鼠跑臺實驗和小鼠負重游泳實驗）發現，阻斷腦星形膠質細胞釋放乳酸（icv 給予MCT-1 和MCT-4 共抑制劑AZD3965）或阻斷神經元攝取乳酸（icv 給予MCT-2 抑制劑4-CIN）均可顯著降低小鼠的耐力運動持續時間和運動距離，提示由星形膠質細胞-神經元乳酸穿梭供給的乳酸是小鼠維持耐力運動所需的神經元能量底物，與Matsui等［6］研究結果一致。

研究發現，大鼠跑臺運動至力竭時海馬腦區IL-1β 和TNF-α 水平顯著增加［17-18］，大鼠力竭游泳顯著增加杏仁核IL-1β 免疫陽性細胞數量［19］，提示耐力運動至力竭伴隨腦神經炎癥水平的升高，但升高的神經炎癥是否是導致力竭疲勞的原因尚不明確。本研究采用icv 給予LPS 誘導小鼠處于高水平的腦神經炎癥狀態（運動皮質前炎性細胞因子IL-1β，IL-6和TNF-α水平顯著升高）后，小鼠耐力運動持續時間和運動距離明顯縮短，而icv 給予米諾環素降低腦炎癥水平則延長小鼠耐力運動持續時間和運動距離，為小鼠大腦神經炎癥狀態與運動疲勞的因果關系提供了實驗證據。另外，本課題組尚未發表的研究顯示，小鼠耐力運動至力竭進程中運動相關腦區的神經炎癥水平逐漸升高。結合本研究結果推測，降低腦神經炎癥水平可能是延緩運動疲勞發生的有效措施。

相關研究報道，阿爾茨海默病導致腦內呈現高水平的神經炎癥，同時星形膠質細胞葡萄糖利用率降低、MCT-1 下調及乳酸釋放減少［20］，使用趨化因子受體4 可逆拮抗劑減輕神經炎癥可上調MCT-1并顯著改善認知與記憶功能［21］，提示疾病狀態下的神經炎癥可能通過影響MCT 表達及星形膠質細胞-神經元乳酸穿梭過程而導致神經元能量底物乳酸供給障礙。本研究結果表明，LPS誘導小鼠大腦運動皮質前炎性細胞因子IL-1β，IL-6和TNF-αmRNA 表達水平升高，同時降低MCT-1，MCT-2和MCT-4mRNA 表達水平；而給予米諾環素可降低運動皮質IL-1β和TNF-αmRNA表達的同時，上述MCTmRNA 表達也恢復至溶劑對照組水平，表明高水平的神經炎癥狀態可導致星形膠質細胞-神經元乳酸穿梭中乳酸轉運通道——MCT 表達下調。另外，本課題組尚未發表的實驗研究顯示，前炎性細胞因子及其下游信號通路導致MCT 蛋白表達下降；而icv前炎性細胞因子受體的中和抗體亦可延緩小鼠運動疲勞的發生。因此推測，腦神經炎癥驅動運動疲勞發生的機制可能是通過下調MCT 表達而影響星形膠質細胞-神經元乳酸穿梭實現的。

綜上所述，本研究結果表明，星形膠質細胞-神經元乳酸穿梭是小鼠維持耐力運動的神經元能量底物供給途徑，且腦高水平的神經炎癥狀態是驅動運動疲勞發生的重要原因，其機制可能與下調星形膠質細胞-神經元乳酸穿梭中的關鍵分子MCT表達有關。