用五選擇連續反應時間任務模型評價咖啡因和鹽酸羥哌吡酮對大鼠注意力、行為控制和反應速度的調節作用

鮑金豪，常海霞，3，黎進峰，房鑫鑫，代 威，李云峰

〔軍事科學院軍事醫學研究院1.軍事認知與腦科學研究所，2.毒物藥物研究所，北京 100850；3.山東第一醫科大學（山東省醫學科學院）藥學院，山東 泰安 271016〕

注意是認知功能第一步，持續維持高水平的警覺和注意力是信息連續加工和保持良好腦作業能力的前提。同時，注意力與感知、學習、記憶和執行功能有著密切聯系。事實上，注意力缺陷經常發生在包括抑郁癥、精神分裂癥、阿爾茨海默病和注意缺陷多動障礙等神經精神疾病中，因此，提升注意力被認為是治療這些疾病的重要治療策略之一［1］。目前，治療注意缺陷障礙的藥物主要包括精神興奮藥（如哌甲酯）、抗抑郁藥（如托莫西汀和氟西汀）、單胺氧化酶抑制劑司立吉蘭、腎上腺素α2受體激動劑可樂定和一些中藥等［2］。

研究表明，咖啡因（caffeine，CAF）是腺苷A1和A2受體的競爭性拮抗劑［3］，一直以來被認為可發揮抗疲勞、促覺醒和增加警覺的作用，但其認知增強特性一直存在爭議［4］，并且在是否可提高注意力方面的報道亦存在諸多矛盾［5-7］。本研究擬系統評價CAF對大鼠注意力、行為控制和反應速度的調節作用。

鹽酸羥哌吡酮（代號：YL-0919）是毒物藥物研究所自主研發的新型抗抑郁小分子化合物，在多種動物模型中表現出抗抑郁和抗焦慮作用，且具有快速起效、增強認知和不導致性功能障礙等潛在優點，目前作為1.1 類抗抑郁新藥進入Ⅱ期臨床試驗［8］。研究發現，YL-0919具有選擇性激動Sigma-1受體的作用［9］。文獻報道，抗抑郁藥具有增強注意力的潛能［10］，本研究室前期通過膜片鉗實驗發現，單次給予YL-0919 可優先抑制前額葉皮質γ-氨基丁酸中間神經元，增強谷氨酸能錐體神經元興奮性［11］。同時該藥具有促認知樣活性，但其對于作為認知第一步的注意是否有影響尚不明確。本研究擬探究YL-0919是否通過提高注意力發揮促認知作用及其在大鼠行為控制和反應速度上的作用。

目前，可用于注意力評價的動物模型較少，其中五選擇連續反應時間任務（5-choice serial reaction time task，5-CSRTT）是公認的可用于檢測嚙齒動物持續性主動注意力的行為檢測方法［12］。該實驗需訓練動物對在5 個位置中隨機呈現的1 個位置上的短暫視覺信號做出響應，經藥物或其他實驗手段干預后，可同時反映藥物或者實驗操作對動物注意力、行為控制和反應速度等的影響。由于與人類持續注意力評價——連續操作測試（continuous performance test，CPT）相似，且具有自動化程度高和參數靈活等特點，5-CSRTT 在該研究領域得到廣泛應用［13］。

本研究運用5-CSRTT 評價不同機制的YL-0919 和CAF 對SD 大鼠注意力、行為控制和反應速度的影響，并比較二者作用特點的異同，旨在為發現新型注意力提升藥物及靶標提供新的線索和思路。

1 材料與方法

1.1 動物

雄性SD 大鼠，SPF 級，體重180～200 g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，許可證：SCXK（京）2019-0010。大鼠以每籠4 只群居飼養，限制進食，自由飲水。飼養環境溫度20～24 ℃，濕度50%～60%，12 h 黑暗/白晝交替照明（光照時間8∶00～20∶00）。所有動物實驗程序均由軍事醫學研究院實驗動物福利倫理委員會批準，倫理審核編號：IACUC-DW2X-2022-605。

1.2 藥品、試劑和儀器

YL-0919（批號：D5222-18-001，純度＞99.9%），浙江華海藥業有限公司；CAF（批號：TC130184，純度＞99.9%），石藥集團新諾威制藥股份有限公司。顆粒飼料（每粒45 mg，直徑0.356 cm），美國Bio-Serv 公司。基本行為測試包-大鼠五孔鼻觸實驗箱（4 組）及配套軟件（型號MED-NP5L-B1），美國Med Associates公司。實驗箱（45 cm×25 cm×30 cm）底部為不銹鋼橫桿，其中一側壁上裝有1 個食盒和1 盞食盒燈；在對面側壁下方距底部3 cm處有橫向等距排列且外觀一致的5 個邊長3 cm 的正方形鼻觸孔，每個鼻觸孔中各有1盞信號燈和1個紅外探測裝置，實驗程序運行和數據采集由軟件控制完成。

1.3 大鼠5-CSRTT行為訓練［12］

大鼠每次訓練或測試前禁食16～18 h。大鼠經訓練后用于評價藥物。整個過程中，每只大鼠在同一實驗箱中進行訓練和測試。訓練和測試過程如圖1所示。

Fig.1 Flowchart of 5-choice serial reaction time task（5-CSRTT）testing. After acclimatization，the rats were pre-trained to master the association between light source signals and feed pellet delivery.After the rats were formally trained to master the behavioral test under the conditions of signal duration (SD)=1 s，limited hold (LH)=5 s，and interatrial interval (ITI)=5 s，the rats were tested and grouped at baseline，and then randomly balanced into normal control group and drug administration groups according to their attention levels.During the administration and formal testing phase，the above experimental conditions were maintained. Depending on the group，rats were ig given hypidone hydrochloride（code YL-0919）2.5 and 5.0 mg·kg-1，caffeine（CAF）2.5，5.0，10.0 and 20.0 mg·kg-1 or ddH2O separately 1 h before the formal test. The animals were given drugs several times. Each drug was given in order of concentration，with an interval of several days between each concentration，during which the animals were not administered but kept under training and data were recorded，and when there was no significant difference between the administered group and the model control group，the next concentration of the drug was tested on the following day. Accuracy was measured as percent correct〔correct responses/（correct responses+incorrect responses）×100%〕. Correct responses were recorded as responses made to the right stimulus location during the LH. Incorrect responses were recorded as responses made to the wrong stimulus location during the LH. An omission error was recorded as a failure to respond to the visual stimulus within the LH. Premature responses were recorded as responses made during the ITI period.Perseverant responses were recorded as responses made after a correct response but prior to the collection of food reward. Average latency to make a correct response was recorded as the average time from the onset of the light stimulus until a nosepoke into the correct niche being registered. Average latency of food reward was recorded as the average time from the registration of a correct response to the retrieval of a food reward from the magazine well.

1.3.1 預適應

連續3 d，每天輕柔抓取撫摸大鼠使其適應實驗環境和操作，以減少無關應激刺激對后續實驗結果的影響。

1.3.2 適應訓練

大鼠限制飲食，除訓練過程所得顆粒飼料外，每只大鼠每天僅提供約12 g 普通飼料，以保持其訓練時處于饑餓狀態。每天將大鼠放入實驗箱內15 min，每15 s投放1粒顆粒飼料供大鼠食用，共投放50 次，使其熟悉飼料顆粒的投放位置和投放方式，大鼠食用超80%飼料顆粒時進行下一步訓練。

1.3.3 預備訓練

每天將大鼠放入實驗箱內訓練15 min。在每輪訓練周期中，首先隨機持續點亮五孔信號燈中的1 孔，當大鼠鼻觸正確信號燈（即點亮的信號燈）并觸發紅外感應時，信號燈滅，食盒燈亮，并投放一粒飼料至食盒，大鼠吃飼料后食盒燈滅，并啟動下一輪訓練周期。經過訓練，使大鼠對鼻觸正確信號燈與得到飼料顆粒建立條件反射。大鼠15 min 內得到并食用達40粒顆粒飼料時進入下一步訓練。

1.3.4 正式訓練

每天訓練50 輪訓練周期。首個周期開始前及相鄰訓練周期啟動之間的時間間隔，設為間隔期（interatrial interval，ITI），間隔期大鼠每次鼻觸五孔將記錄為1 次沖動反應，儀器照明燈熄滅2 s 進行懲罰并重新開始ITI。每輪訓練設定限定期（limited hold，LH），限定大鼠鼻觸信號燈的時間，包括信號期（signal duration，SD，5孔中隨機1孔信號燈亮的持續時間）和后續期2 個階段。ITI 結束后進入SD，五孔信號燈隨機亮1 孔，在LH 期間，若大鼠鼻觸亮燈孔，儀器信號燈滅，食盒燈亮，并投放1 粒飼料顆粒至食盒，大鼠吃飼料后食盒燈滅，記為1次正確反應，若投放飼料顆粒至大鼠攝食期間繼續鼻觸五孔，每次記為1次固執反應，從信號開始到鼻觸亮燈孔的時間記為正確潛伏期，從正確反應至動物開始攝食飼料顆粒的時間記為攝食潛伏期，本輪訓練周期結束；若大鼠鼻觸未亮燈的孔，記為1 次錯誤反應，若未進行鼻觸，記為1 次遺漏反應，出現錯誤反應或遺漏，儀器不投放飼料，且照明燈熄滅2 s 進行懲罰后本輪訓練周期結束。將SD 和LH 的起始時長設定為20 s、ITI 為5 s，在同日的50 輪訓練周期中，SD 和LH 時長保持不變，當大鼠準確率〔正確次數（/正確次數+錯誤次數）×100%〕達到80%，則在次日訓練時將SD 和LH 逐步縮短（依次為15，13，12，10，8，7，6和5 s），ITI維持不變。準確率未達標的動物以原條件繼續訓練3 次，仍不達標的將予以淘汰。在此之后，SD 設定逐步由5 s降至4，3.5，3，2.5，2，1.5 和1 s，LH 和ITI 保持5 s。大鼠在程序參數SD=1 s，LH=5 s，ITI=5 s下的行為測試中連續3 d的準確率無顯著差異后進行下一階段。

1.4 藥物干預5-CSRTT大鼠行為試驗

1.4.1 基線測試和分組

基線測試前2 d 進行適應性灌胃，每天1 次（雙蒸水，0.4 mL·d-1）。基線測試連續3 d，測試程序參數：SD=1 s，LH=5 s，ITI=5 s，每天測試15 min 或50 輪測試周期，記錄大鼠操作基線，觀察指標為準確率、正確次數、錯誤次數和遺漏次數。依據準確率將大鼠隨機均衡分為模型對照組（雙蒸水）和給藥（CAF或YL-0919）組，每組16只。

1.4.2 給藥和正式測試

測試程序參數：SD=1 s，LH=5 s，ITI=5 s，測試15 min或50輪測試周期。測試前1 h，大鼠依據分組單次ig 給予雙蒸水、YL-0919（2.5 和5.0 mg·kg-1）或CAF（2.5，5.0，10.0和20.0 mg·kg-1）。觀察指標包括注意力評價指標（準確率、正確次數、錯誤次數和遺漏次數）；行為控制評價指標（沖動次數和固執次數）；反應速度評價指標（平均正確潛伏期和平均攝食潛伏期）。

訓練達標的動物重復給藥，各藥物按劑量從低到高的順序給予，2 次給藥測試間間隔數日，期間動物保持訓練（程序參數同測試程序）并記錄上述行為評價指標，當給藥組與模型對照組注意力評價指標無顯著差異時，于次日進行下一濃度藥物的測試。

1.5 統計學分析

實驗結果數據用±s表示，采用GraphPad Prism 8.0.1 進行數據分析和繪圖，兩組間比較采用Studentt檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CAF對5-CSRTT大鼠注意力的影響

如圖2 所示，與模型對照組相比，CAF 2.5 和5.0 mg·kg-1組大鼠行為反應的準確率、正確次數、錯誤次數和遺漏次數均無顯著差異，但10.0 和20.0 mg·kg-1組正確次數顯著減少（P＜0.05，P＜0.01），準確率亦顯著下降（P＜0.05）。由此提示，CAF 10.0和20.0 mg·kg-1可減弱大鼠注意力。

Fig. 2 Effect of CAF on behaviors of attention in 5-CSRTT model rats.See Fig.1 for the rat treatment，experimental parameters and annotate.±s，n=16. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with model control group.

2.2 CAF 對5-CSRTT 大鼠行為控制和反應速度的影響

如圖3所示，與模型對照組相比，在行為控制指標中，僅CAF 20.0 mg·kg-1組大鼠沖動次數顯著增多（P＜0.01），2.5，5.0 和10.0 mg·kg-1組沖動次數和固執次數均無顯著差異；在反應速度指標中，CAF 2.5，5.0，10.0 和20.0 mg·kg-1組平均正確潛伏期和平均攝食潛伏期均無顯著差異。由此提示，CAF 20.0 mg·kg-1可減弱行為控制，增強沖動，但不影響反應速度。

Fig.3 Effect of CAF on behavioral control（A and B）and reaction speed（C and D）in 5-CSRTT model rats.See Fig.1 for the rat treatment，experimental parameters and the annotate.±s，n=16.＊＊P＜0.01，compared with model control group.

2.3 YL-0919對5-CSRTT大鼠注意力的影響

如圖4 所示，與模型對照組相比，YL-0919 5.0 mg·kg-1組錯誤次數顯著減少（P＜0.05），準確率顯著提高（P＜0.05），正確次數和遺漏次數無顯著差異；2.5 mg·kg-1組準確率、正確次數、錯誤次數和遺漏次數均無顯著差異。由此提示，單次ig給予YL-0919 5.0 mg·kg-1可通過同時減少錯誤次數和提高準確率而提高大鼠注意力。

Fig.4 Effect of YL-0919 on behaviors of attention in 5-CSRTT model rats. See Fig.1 for the rat treatment，experimental parameters and annotate.±s，n=16.＊P＜0.05，compared with model control group.

2.4 YL-0919 對5-CSRTT 大鼠行為控制和反應速度的影響

如圖5 所示，與模型對照組相比，YL-0919 2.5和5.0 mg·kg-1組大鼠沖動次數、固執次數、平均正確潛伏期和平均攝食潛伏期均無顯著差異，提示單次ig 給予YL-0919 2.5 和5.0 mg·kg-1對大鼠行為控制和反應速度無明顯影響。

Fig.5 Effect of YL-0919 on behavioral control（A and B）and reaction speed（C and D）in 5-CSRTT model rats.See Fig.1 for the rat treatment，experimental parameters and annotate.±s，n=16.

3 討論

5-CSRTT 是模擬人類持續注意力評價范式CPT，用以測試嚙齒動物注意行為的經典行為范式［12］。5-CSRTT 旨在發現治療注意力缺陷障礙和阿爾茨海默病等中樞神經系統疾病的藥物，也可用于探索注意力和沖動性的神經生物學過程。據報道，基于5-CSRTT已發現尼古丁［14］、安非他明［5］、哌甲酯［5］和托莫西汀［15］等化合物具有提高注意力的作用，表現為提高準確率或減少沖動行為等。

CAF 被認為可能具有提高注意力的作用，但一直存在爭議［5-7］。Higgins 等［6］發現，單次ip 給予CAF（1.0～10.0 mg·kg-1）不影響準確率和遺漏次數，而單次ip 給予CAF（10.0 mg·kg-1）顯著增加沖動次數，這與本研究中ig 給予CAF（10.0 和20.0 mg·kg-1）減弱注意力，同時增加沖動行為的結果相類似。結合文獻和本研究結果，提示CAF 在本研究受試劑量范圍內主要表現為增強動物沖動和警覺，而不影響甚至減弱注意力。提示CAF 更多的表現為抗疲勞、提高警覺效應而非注意力增強作用。

YL-0919 是選擇性Sigma-1 受體激動劑［9］，在1.25～5.0 mg·kg-1劑量范圍內具有抗抑郁活性［16-18］。本研發現，YL-0919 在其抗抑郁劑量范圍內可通過減少錯誤次數和提高準確率顯著提高大鼠注意力，同時不影響行為控制和反應速度。提示提升注意力可能YL-0919 發揮抗抑郁、促認知作用的作用特點之一。文獻表明，Sigma-1受體激動劑具有增強認知作用［19-20］，因此該受體可能參與了YL-0919 的注意增強作用。

綜上，本研究結果表明，CAF 和YL-0919 在5-CSRTT 中具有不同的作用特點，YL-0919 可提高正常SD 大鼠的注意力，表現為減少大鼠在5-CSRTT 中的錯誤次數，提高準確率，且不影響大鼠的行為控制和反應速度；CAF 可降低大鼠注意力并減弱行為控制能力，表現為減少正確次數，降低準確率并增加沖動次數。未來將針對更多劑量和更多給藥方式對二者作用的異同進行進一步研究。