miR-21-5p靶向JAK/STAT信號通路抑制Th1細胞極化

李 露，李 雪，孟廣雨，劉元林，王 洋，吳楚姍，許婷婷，白海濤，袁福臨，鄭榮秀，張 毅

（1.天津醫科大學總醫院兒科，天津 300052；2.軍事科學院軍事醫學研究院輻射醫學研究所，北京 100850）

精確而嚴格的免疫調控是機體抵御病毒、細菌、真菌和寄生蟲等病原體感染的重要保障。免疫細胞及其產生的多種細胞因子是免疫調控的主要執行者，在維持機體免疫系統穩態過程中發揮關鍵作用。T 淋巴細胞是免疫系統的重要組成部分，據其表面標志物主要分為CD4+和CD8+T 淋巴細胞，其中CD4+T 淋巴細胞又稱為輔助性T 細胞（helper T cells，Th），可產生豐富的細胞因子。初始（na?ve）CD4+T 細胞又稱Th0 細胞，是適應性免疫反應的關鍵細胞。據所處的微環境，包括細胞因子信號、共刺激信號、炎癥環境及T細胞受體與抗原相互作用的強度，Th0 細胞可進一步分化為多種效應亞群，包括Th1 細胞、Th2 細胞、Th17 細胞、濾泡Th細胞和誘導調節性T細胞等［1-2］。

Janus 激酶（Janus kinase，JAK）/信號轉導與轉錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）通路是調控Th0 細胞分化的關鍵信號通路，多種Th細胞亞群和免疫反應類型均受其調控，其中Th1 細胞是行使免疫監視、保障機體免疫環境穩態的主要參與者，Th1 細胞極化亦受JAK/STAT 信號通路影響。現有研究表明，樹突狀細胞等抗原遞呈細胞攝取抗原并分泌產生的白細胞介素12（interleukin-12，IL-12）可激活STAT4 介導的JAK/STAT 信號通路，活化的STAT4 促進Th1細胞極化關鍵轉錄因子T 盒21 轉錄因子（T-box 21 transcription factor，T-bet）表達，進而誘導Th1 細胞極化的關鍵細胞因子干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）產生。與此同時，由自然殺傷細胞或極化的Th1 細胞分泌的IFN-γ，通過其受體介導JAK/STAT 信號通路活化，活化STAT1并誘導T-bet表達，進一步正反饋促進Th1細胞極化［3-4］。據此，在Th1細胞極化調控過程中，IL-12等Th1細胞極化相關細胞因子可激活JAK/STAT 信號通路，誘發一系列級聯反應促進IFN-γ 大量產生，最終決定Th1 細胞極化的命運并促進炎癥反應進展。

機體的免疫系統穩態需要促炎因子與抑炎因子協同調節，異?；罨腡h1 細胞可靶向自身抗原肽，誘發機體免疫系統功能紊亂，導致諸如類風濕性關節炎、胰島素依賴型糖尿病、系統性紅斑狼瘡、多發性硬化癥和橋本甲狀腺炎等［5-6］。因此，維持免疫系統穩態及適度的Th1 細胞極化對防治自身免疫性疾病具有重要臨床意義。

物種間高度保守的微RNA（microRNA，miRNA）可通過特異性結合靶標mRNA 的3′-非翻譯區（untranslated regions，UTR），誘導mRNA 降解并抑制mRNA 進一步翻譯為蛋白質，在翻譯水平抑制靶基因表達［7］。miRNA 是長度為19～25 個核苷酸的單鏈非編碼RNA，其序列長度使其靶向調控具有多樣性，可通過多靶標mRNA 調控形成復雜的調控網絡，影響細胞生長、增殖、分化、凋亡和應激等重要生理進程［8-9］。本研究室基于前期對間充質干細胞外泌體miRNA測序分析發現，其外泌體內富含高豐度的miR-21-5p。為探究miR-21-5p 是否參與間充質干細胞免疫調控，本研究通過體外誘導初始CD4+T 細胞向Th1 細胞極化，研究miR-21-5p 對Th1細胞極化的抑制作用及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 動物、細胞、主要試劑和儀器

6 周齡SPF 級雄性C57BL/6N 小鼠（北京維通利華實驗動物技術有限公司），動物合格證號：SCXK（京）2021-0006，所涉及動物實驗經軍事科學院軍事醫學研究院實驗動物倫理委員會批準，編號IACUC-DWZX-2021-704。人宮頸癌細胞（HeLa細胞），軍事科學院軍事醫學研究院輻射醫學研究所細胞庫。DMEM 培養基、RPMI 1640 培養基、α-MEM 培養基、胰酶、PBS 和非必需氨基酸，美國Gibco公司；胎牛血清，德國PAN Seratech 公司；小鼠脾淋巴細胞分離試劑盒，天津灝洋生物科技有限公司；小鼠初始CD4+T 細胞分選試劑盒，德國Miltenyi Biotec 公司；抗小鼠CD3ε，CD28 和IL-4 單克隆抗體、重組小鼠IL-2 和IL-12 及PE-抗小鼠CD4和APC-抗小鼠IFN-γ流式用抗體，美國Tonbo Biosciences 公司；Triton X-100、Tween-20、Trizol 試劑和β 巰基乙醇，美國Sigma 公司；甲醛水溶液，國藥集團有限公司；小鼠抗小鼠磷酸化STAT4（phosphorylated STAT4，p-STAT4）單克隆抗體，美國Santa Cruz Biotechnology公司；兔抗小鼠STAT4，STAT1 和p-STAT1 單克隆抗體，美國Cell Signaling Technology 公司；小鼠抗小鼠GAPDH 單克隆抗體、HRP-山羊抗小鼠IgG 抗體（二抗）、HRP-山羊抗兔IgG 抗體（二抗）、5×SDS-PAGE 上樣緩沖液、Ultra SYBR 混合物和BCA 蛋白定量試劑盒，康為世紀有限公司；ECL 發光液，百賽生物有限公司；Oligo dT、dNTP、Random、DTT、RNA酶抑制劑、5×RNA 酶M-MLV 緩沖液和RNA 酶M-MLV 逆轉錄酶，日本TaKaRa 公司；JetPRIME 和JetPRIME 緩沖液，法國Polyplus 公司；雙熒光素酶報告檢測試劑盒，美國Promega 公司；DEPC 水、miR-21-5p 模擬物（mimic）和模擬物對照核酸序列（表1）及實時定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）引物（表2），上海生工生物有限公司。CKX53SF-R 型倒置顯微鏡，日本Olympus 公司；7500 實時熒光定量PCR儀和低溫高速離心機，美國Thermo Fisher公司；Tecan Spark多功能酶標儀，瑞士帝肯公司。

Tab.1 Sequences of microRNA（miRNA）

Tab.2 Primer sequences for real-time quantitative PCR（RT-qPCR）

1.2 小鼠脾單個核細胞提取

安樂法處死6 周齡C57BL/6N 小鼠，無菌條件下取脾制備單細胞懸液，450×g離心10 min，棄上清，用小鼠淋巴細胞稀釋液重懸后加入淋巴細胞分離液，450×g離心30 min，收集中間層細胞獲得脾單個核細胞。

1.3 小鼠初始CD4+T細胞免疫磁珠分選

按小鼠初始CD4+T 細胞分選試劑盒操作。在分離的小鼠脾單個核細胞中加入生物素標記的Miltenyi 雞尾酒抗體，于4 ℃孵育5 min，加入抗生物素單克隆抗體耦聯磁珠和抗CD44單克隆抗體耦聯磁珠繼續孵育10 min，轉移至離心管中用磁珠分離緩沖液洗滌1 次。將細胞通過磁場，經磁性分離柱吸附后洗脫獲得初始CD4+T細胞。

1.4 誘導初始CD4+ T 細胞向Th1 細胞極化及miR-21-5p模擬物轉染

24 孔板預先以抗小鼠CD3ε 單抗（2 mg·L-1）4 ℃包被過夜，將新鮮分離的初始CD4+T 細胞（每孔5×105細胞）接種入24 孔板，加入Th1 極化誘導劑（抗小鼠CD28 單抗0.5 mg·L-1、抗小鼠IL-4 單抗1 mg·L-1、重組小鼠IL-2 5 μg·L-1、重組小鼠IL-12 10 μg·L-1、1%非必需氨基酸和β巰基乙醇55 μmol·L-1），用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養基于37 ℃，5% CO2條件下培養。

miR-21-5p模擬物或模擬物對照2.5 nmol分別溶解于DEPC水125 μL，配制終濃度為20 μmol·L-1溶液。分別取3.33 μL 溶解于100 μL JetPRIME 緩沖液中，加入JetPRIME 2.6 μL于室溫靜置15 min，待組裝成脂質體復合物后轉染至加入Th1 極化誘導劑的初始CD4+T 細胞。誘導72 h 后分別收取Th1誘導組、誘導+模擬物對照組和誘導+miR-21-5p模擬物組細胞，進行后續實驗。

1.5 流式細胞術檢測Th1細胞極化百分比

取1.4 收取的細胞，加入PE-抗小鼠CD4 流式抗體，4 ℃避光孵育30 min；PBS 洗滌后加入4%中性甲醛固定10 min，用500 μL含0.1% Triton X-100的PBS 破膜7 min；用500 μL含0.1% Tween-20的PBS洗滌后，加入APC-抗小鼠IFN-γ流式抗體4 ℃避光孵育30 min。洗滌后用PBS重懸，于流式細胞儀檢測CD4+IFN-γ+細胞百分比，即Th1細胞極化百分比。

1.6 RT-qPCR檢測IFN-γ，STAT1，STAT4，IL-12Rβ1和T-bet mRNA表達水平

取1.4收取的細胞，Trizol法提取總RNA，取1 μg逆轉錄為cDNA，RT-qPCR 檢測IFN-γ，STAT1，STAT4，IL-12Rβ1和T-betmRNA水平。反應體系：cDNA 1 μL，PCR上下游引物（10 μmol·L-1）各0.5 μL，Ultra SYBR 混合物10 μL 和DEPC水8 μL；反應條件：95 ℃10 min；95 ℃15 s，60 ℃1 min，40 個循環；95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s。GAPDH作為內參基因，待測基因mRNA 表達水平用2-△△Ct表示。

1.7 Western 印跡法檢測STAT4，p-STAT4，STAT1和p-STAT1蛋白表達水平

取1.4 收取的細胞，加80 μL細胞裂解液于搖床冰浴震蕩裂解細胞30 min，12 000×g離心25 min收集上清。經BCA 蛋白定量后，加入含有β 巰基乙醇的5×SDS-PAGE 上樣緩沖液煮沸。取20 μg 蛋白樣品電泳，經10% SDS-PAGE 凝膠電泳，轉移至PVDF 膜；5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別與抗STAT4，p-STAT4，STAT1，p-STAT1 和GAPDH 抗體（稀釋比1∶500）4 ℃孵育過夜；TBST洗膜3次，加入HRP-山羊抗小鼠IgG或HRP-山羊抗兔IgG抗體（稀釋比1∶30 000），室溫孵育1 h；TBST 洗膜3 次，ECL 化學發光顯影，測定蛋白條帶積分吸光度值。待測蛋白表達水平用待測蛋白條帶與GAPDH 條帶積分吸光度比值表示。

1.8 雙熒光素酶報告載體構建及miR-21-5p 模擬物對STAT1，IFN-γ和IL-12Rβ1表達調控作用驗證

經生物信息學分析預測IL-12Rβ1，IFN-γ和STAT1的3′-UTR 可能存在miR-21-5p的作用靶標序列，利用psiCHECK2 分別構建各靶標序列的雙熒光素酶報告載體，即將正常3′-UTR 序列（wild type，WT）和靶序列結合位點突變（mutant，MT）的3′-UTR 序列分別插入到psiCHECK2 載體攜帶的人源化海腎熒光素酶（human codon optimized-Renilla luciferase，hRluc）的3′-UTR 區域，構建hRluc的報告基因表達載體psi-WT 和psi-MT。psiCHECK2含有hluc+作為內參報告基因。

轉染前1 d 將HeLa 細胞（每孔2×104細胞）接種于96 孔板，待細胞密度匯合至60%～80%時，將psi-WT 和psi-MT 載體分別與miR-21-5p 模擬物或模擬物對照共轉染至HeLa 細胞中。取20 ng 載體和0.2 μL miR-21-5p 模擬物或模擬物對照溶解于15 μL JetPRIME 緩沖液中，加入JetPRIME 0.5 μL混勻后于室溫靜置15 min，待形成脂質體復合物后加入HeLa 細胞培養體系。用含10%胎牛血清的DMEM 培養基在37 ℃，5% CO2條件下培養36 h，收取并裂解細胞進行雙熒光素酶報告基因檢測。取細胞裂解上清20 μL，加入Luciferase Assay底物20 μL，經Tecan 酶標儀檢測內參hluc+產生的熒光信號強度；再加入Stop&Glo 底物20 μL，用Tecan酶標儀檢測靶標序列的hRluc產生的熒光信號強度。hRluc與hluc+熒光信號強度比值表示熒光素酶活性，反映miR-21-5p 模擬物或模擬物對照對靶序列的調控作用。

1.9 統計學分析

實驗結果數據以±s表示，經SPSS Statistics 26 軟件進行數據分析，組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-21-5p抑制Th1細胞極化

對小鼠脾單個核細胞進行免疫磁珠陰性分選（圖1A），獲得的細胞經流式細胞術檢測為高表達CD62L 的CD4+T 細胞（圖1B），符合初始CD4+T細胞特征。向初始CD4+T 細胞中加入Th1 極化誘導劑，同時轉染miR-21-5p 模擬物或模擬物對照，72 h 后流式細胞術檢測CD4+IFN-γ+雙陽細胞百分比。結果（圖1C）表明，Th1誘導組細胞極化百分比為（76.3±0.6）%；誘導+模擬物對照組為（76.9±2.1）%，與Th1 誘導組比較無明顯變化；誘導+miR-21-5p 模擬物組為（68.1±2.2）%，與Th1 誘導組和誘導+模擬物對照組比較均明顯降低（P＜0.01）。以上結果表明，在誘導初始CD4+T 細胞向Th1 細胞極化體系內轉染miR-21-5p模擬物可顯著抑制Th1細胞極化。

Fig.1 miR-21-5p mimic blocked Th1 cell polarization. A：strategy of murine na?ve CD4+ T cells isolation；B：characterization of the purified na?ve CD4+ T cells examined by flow cytometry；C：the percentage of CD4+IFN-γ+ cells in Th1 cells induced from the na?ve CD4+ T cells and transfected miR-21-5p mimic or mimic control for 72 h measured by flow cytometry；C2：statistic results of C1.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with Th1 induction group；##P＜0.01，compared with induction+mimic control group.

2.2 miR-21-5p抑制JAK/STAT信號通路活化

圖2A 結果顯示，轉染miR-21-5p 模擬物后，Th1 細胞極化所需的關鍵轉錄因子T-bet和關鍵細胞因子IFN-γmRNA 表達水平較轉染模擬物對照顯著下降（P＜0.01）；同時，參與調控Th1 細胞極化的IL-12/STAT4/IFN-γ 途徑和IFN-γ/STAT1 途徑的關鍵轉錄因子STAT1（P＜0.01）和STAT4（P＜0.05）及受體IL-12Rβ1（P＜0.05）mRNA 表達水平亦顯著降低。誘導+模擬物對照組上述細胞因子mRNA水平與Th1誘導組比較均無明顯變化。

Fig.2 miR-21-5p inhibited activation of JAK/STAT signaling pathway in Th1 cells. See Fig.1C for the cell treatment. A：the mRNA expression levels of IFN-γ，STAT1，STAT4，IL-12Rβ1 and T-bet measured by RT-qPCR；B：the protein levels of STAT4，p-STAT4，STAT1 and p-STAT1 detected by Western blotting，B2 was the semi-quantitative result of B1. IA：integrated absorbance.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with Th1 induction group；##P＜0.01，compared with induction+mimic control group.

圖2B 結果顯示，轉染miR-21-5p 模擬物后，p-STAT1 和p-STAT4 蛋白表達水平顯著低于誘導+模擬物對照組（P＜0.01），STAT1和STAT4蛋白表達水平無明顯變化，表明miR-21-5p 模擬物可抑制STAT1和STAT4蛋白磷酸化活化。

2.3 miR-21-5p調控Th1細胞極化通路的作用靶標

經生物信息學分析與預測，miR-21-5p 可能與Th1細胞極化所必需的JAK/STAT 信號通路的重要分子IFN-γ，IL-12Rβ1和STAT1的3′-UTR 存在特異性結合位點。利用psiCHECK2 雙熒光素酶報告載體，分別構建含IFN-γ，IL-12Rβ1和STAT1的3′-UTR WT序列（圖3A）及對應靶標的MT序列（圖3B）的克隆載體psi-WT 和psi-MT，并與miR-21-5p模擬物或模擬物對照同時轉染HeLa 細胞。雙熒光素酶活性檢測結果（圖3C）顯示，轉染miR-21-5p模擬物可顯著降低帶有IFN-γ（P＜0.01），IL-12Rβ1（P＜0.01）和STAT1（P＜0.05）WT 序列的報告基因熒光素酶活性，而含靶基因MT 序列的各報告基因熒光素酶活性不受影響；此外，轉染模擬物對照不影響含WT 和MT 序列的報告基因熒光素酶活性。由此表明，miR-21-5p模擬物可特異性靶向結合IFN-γ，IL-12Rβ1和STAT1的3′-UTR 序列，調控STAT1，IL-12Rβ1和IFN-γ表達水平。

3 討論

Th 細胞在機體應對感染的適應性免疫反應中發揮關鍵作用，它不僅能輔助B 細胞產生抗體、增強和維持CD8+T 細胞的殺傷作用、調節多種免疫細胞以對抗致病微生物，還能調控免疫反應的強度和持續時間。多種Th 細胞亞群參與機體的多重免疫調控反應。Th1 細胞主要介導細胞免疫反應，機體被感染時其細胞特征性細胞因子IFN-γ可激活或刺激其他免疫細胞（如CD8+T 細胞、M1 巨噬細胞、1 型固有淋巴細胞、1 型不變自然殺傷T 細胞（invariant natural killer T1 cells）和免疫球蛋白G3 B 細胞等）共同清除細胞內微生物。Th2細胞介導對抗體外寄生蟲感染，同時也會導致過敏反應。Th17細胞主要抵抗真菌和細胞外細菌入侵。濾泡輔助性T細胞協助B細胞增強體液免疫。誘導調節性T細胞可調節免疫穩態和維持自身免疫耐受［10-11］。

JAK/STAT 通路是免疫系統活化的關鍵信號通路，多種細胞因子與受體結合可激活JAK 反式磷酸化，隨后募集并催化STAT 磷酸化，磷酸化的STAT形成二聚體入核啟動靶基因轉錄，從而誘發不同細胞因子表達，決定Th0細胞的極化方向［12-13］。IL-12和IFN-γ可分別激活JAK2/酪氨酸激酶2/STAT4和JAK1（JAK2）/STAT1 通路，進而誘導Th1 細胞極化的關鍵轉錄因子T-bet 表達，是決定Th1 細胞命運的關鍵細胞因子［14］。

盡管Th 細胞的分化主要依賴于關鍵轉錄因子和細胞因子的調控，但越來越多的研究表明，miRNA作為小分子化合物也可以調控Th 細胞分化，影響Th 細胞亞群平衡［15］。據報道，間充質干細胞外泌體來源的miR-148a-3p 通過抑制IL-12/IL-12Rβ1/IL-12Rβ2/IFN-γ 通路下調Th1 細胞極化，阻止1 型糖尿病進展［16-17］。miR-210 通過與STAT6 靶向結合抑制Th2 分化，從而促進銀屑病患者中Th17 和Th1 分化［18］。miR-140-5p 可靶向負調控STAT1 表達從而抑制Th1 細胞分化，影響多發性硬化癥的進展［19］。最新研究顯示，miR-21-5p不僅可調節成骨、破骨細胞的生成和平衡［7，20］，還具有調節多種細胞抗凋亡、增殖和遷移能力［21-22］，也是潛在的癌癥預測標志物［23-24］。但關于miR-21-5p 調節Th 細胞分化的分子機制知之甚少。本研究通過體外誘導初始CD4+T 細胞向Th1 細胞極化，發現在誘導初始CD4+T 細胞向Th1 細胞極化的體系內轉染miR-21-5p 模擬物，可顯著降低Th1 細胞極化百分比，表明miR-21-5p 可抑制Th1 細胞極化。進一步研究發現，miR-21-5p 可下調Th1 細胞極化關鍵轉錄因子STAT1，T-bet和STAT4、細胞因子IFN-γ及受體IL-12Rβ1mRNA表達水平，同時下調p-STAT1和p-STAT4 蛋白水平，表明miR-21-5p 可顯著抑制STAT4 和STAT1 磷酸化活化，進而干擾IL-12/STAT4/IFN-γ通路和IFN-γ/STAT1通路活化，從而抑制Th1細胞極化。

為進一步探究miR-21-5p抑制Th1細胞極化的分子靶標，本研究對Th1 細胞極化必需的JAK/STAT 通路各組分進行生物信息學分析，發現miR-21-5p 與JAK/STAT 信號通路的關鍵分子STAT1，IFN-γ和IL-12Rβ1的3′-UTR 具有特異性結合位點。隨后經雙熒光素酶報告體系證實，miR-21-5p 可通過靶向結合而調控STAT1，IFN-γ和IL-12Rβ1表達，干擾Th1 細胞極化所必需的JAK/STAT信號通路激活，進而抑制Th1細胞極化。

綜上，miR-21-5p 可通過靶向下調JAK/STAT信號通路分子IFN-γ，IL-12Rβ1和STAT1的表達水平及干擾Th1細胞極化的特征性細胞因子IFN-γ和關鍵轉錄因子T-bet表達，從而顯著抑制Th1 細胞極化。Th1 細胞極化調控是復雜的網絡化調控過程，多條信號通路和多種細胞因子共同參與。miR-21-5p 作為小分子化合物，在免疫穩態維持過程中可能是重要的調控因子，可有效抑制Th1 細胞過度極化所致的免疫穩態失衡，對治療Th1 細胞異?；罨瘜е碌亩喾N自身免疫性疾病，如急性移植物抗宿主病、1 型糖尿病和系統性紅斑狼瘡等可能發揮重要作用，但其療效尚需體內實驗進一步驗證。