基于超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜對西藏不同產地甘青青蘭的差異性成分分析

段婷引，達娃卓瑪，蘭 鈞，李雪敏，張夢姣，周 燕，鄧 放*

（1.成都中醫藥大學 藥學院，西南特色中藥資源國家重點實驗室，四川 成都 611137；2.西藏自治區食品藥品檢驗研究院 中藥（藏藥）質量控制重點實驗室，西藏 拉薩 850000；3.中國科學院成都生物研究所，四川 成都 610041）

藏藥材甘青青蘭（Dracocephalum tanguticum Herba）又名“唐古特青蘭”“隴塞青蘭”，藏語名為“則羊古”［1］，為唇形科（Labiatae）青蘭屬（Dracocephalum）植物甘青青蘭（Dracocephalum tanguticumMaxim.）的干燥地上部分［2］，生長于海拔1 900～4 000 米的干燥河谷河岸、田野、草灘或松林邊緣。其莖細，葉小青色、花為藍色，具有清肝熱、止血、愈瘡、干黃水等功效［1］。甘青青蘭的化學成分復雜，含有揮發性成分、多糖類、黃酮類、萜類及有機酸類成分［3］。現代藥理學研究表明甘青青蘭具有抗氧化、抗缺氧、抑菌、抗病毒和保肝等活性［4］。

目前，對甘青青蘭的化學成分研究主要采用溶劑提取、柱層析分離制備結合核磁鑒定的方法，該方法繁瑣、耗時耗力［5］。近年來，隨著氣相色譜和液相色譜在藥材成分分析中的廣泛應用，特別是液相色譜-高分辨質譜聯用技術應用于化學成分分析，具有高選擇性、高靈敏度、高準確度的特點，可提供化合物結構信息，實現甘青青蘭化學成分的快速鑒定。甘青青蘭雖在藏東、藏南、川西、青東和甘南均有分布，但青藏高原才是道地產區及核心產區，根據資源普查結果，西藏至少有44個縣區分布著甘青青蘭［1］。本研究收集了藏東、藏南部分地區的甘青青蘭，采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜（UHPLC-Q/Orbitrap HRMS）技術對不同地區甘青青蘭的差異性化學成分進行分析，以期為甘青青蘭質量控制研究及資源開發提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜聯用儀（美國賽默飛世爾科技公司）；BSA124S萬分之一天平（德國Sartorius公司）；BT25S型十萬分之一分析天平（德國Sartorius公司）；PCWJ-10超純水機（成都品成科技有限公司）；SK3300HP型數控超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司）。

乙腈（色譜純）、甲酸（質譜純）均購于美國賽默飛世爾科技公司；純凈水（陜西娃哈哈乳品有限公司制造）；對照品：迷迭香酸（MUST-21111817）、金合歡素（MUST-22100813）、丹酚酸B（MUST-22101219）均購自成都曼斯特生物科技有限公司；芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷（PCS-200313）、新綠原酸（PCS-220404）、木犀草苷（PCS-200816）、隱綠原酸（PCS-220912）、蒙花苷（PCS0629）均購自成都植標化純生物技術有限公司；香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖苷（wkq22072903）購自四川省維克奇生物科技有限公司；綠原酸（PS0131-0025）、香葉木苷（PS012991）購自成都普思生物科技股份有限公司，以上對照品純度均不低于98%。

1.2 樣 品

甘青青蘭樣品共采集41 批，其中山南市11 份、拉薩市10 份、昌都市20 份，均為一年生，夏季7月采收。不同來源的干燥樣本的葉子數量略有差異，且各自的粉末顏色與細膩程度也有差別，其中以昌都樣本葉子最多，粉末最為細膩且為嫩綠色，山南市樣本莖枝最多，粉末較為粗糙，有較多粗纖維，顏色為淺棕色。經西藏自治區藏醫院格桑巴珠副主任藥師鑒定為唇形科青蘭屬植物甘青青蘭Dracocephalum tanguticumMaxim.干燥地上部分。

1.3 溶液配制

1.3.1 對照品溶液的配制取上述對照品適量置于10 mL量瓶中，加入二甲基亞砜溶解后，用甲醇定容制備成1.0 mg/mL 的單一對照品儲備液。精密量取各儲備液適量，置于10 mL 量瓶中，加入甲醇定容、搖勻，得各對照品質量濃度均約為10 μg/mL的混合對照品溶液。

表1 甘青青蘭樣品采集信息Table 1 Collection informations of Ganqingqinglan samples

1.3.2 供試品溶液的制備取甘青青蘭適量，粉碎，過二號篩，精密稱定0.50 g，加入70%甲醇25 mL，超聲提取60 min，冷卻至室溫后補足失重，搖勻，過0.22 μm 濾膜，即得供試品溶液。取供試品溶液各1 mL，等容混勻，過0.22 μm濾膜，即得QC樣本溶液。

1.4 色譜及質譜條件

1.4.1 色譜條件ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm× 100 mm，1.7 μm），流動相A 為0.1%甲酸水，流動相B 為乙腈，梯度洗脫：0～2 min，5%～10% B；2～6 min，10%～15% B；6～17.5 min，15% B；17.5～18 min，15%～19% B；18～21 min，19%～25% B；21～26 min，25%～30% B；26～31 min，30%～90%B。柱溫為40 ℃，流速為0.3 mL/min，進樣量為2 μL。

1.4.2 質譜條件電噴霧離子源，正、負離子模式檢測。噴霧電壓：3.5 kV（+）、3.2 kV（-）；鞘氣（N2）：8 L/min（+）、16 L/min（-）；輔助氣（N2）：2 L/min（+）、3 L/min（-）；離子傳輸管溫度：320 ℃；離子透鏡電壓（S-LensRF Level）：55；歸一化碰撞能（NCE%）：20、40、60；檢測方式：全掃描/數據依賴二級掃描（Full MS/ddMS2），一級分辨率為70 000，二級分辨率為17 500；質量掃描范圍：m/z100～1 500。

1.5 數據分析

1.5.1 化合物鑒定采用UHPLC-Q/Orbitrap HRMS 分別在正、負離子模式下檢測和采集數據，得到總離子流圖。首先，檢索國內外相關文獻，整理甘青青蘭及其種屬的已知化學成分，構建甘青青蘭的化學成分信息表。同時，采用Xcalibur 軟件采集質譜數據，Compound Discoverer 3.2 軟件進行分析處理，選用天然產物未知化合物鑒定模板，對未知化合物進行分子式擬合，并根據精確相對分子質量和二級碎片離子信息等結合Chemspider 和mzCloud 等數據庫進行匹配。根據二級質譜裂解碎片信息，進行相關化學結構的推導，總結出特征碎片，并通過比對對照品、參考相關文獻和利用MassFrontier 8.0質譜解析軟件對化合物進行鑒定。

1.5.2 統計學分析將41 批甘青青蘭質譜數據導入Compound Discoverer 3.2 軟件進行處理，將得到的數據導入SIMCA14.1 軟件，通過主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）對各產地的甘青青蘭樣本進行比較，以變量對模型的重要性（VIP）值大于1且P＜0.05作為條件篩選差異化合物。

2 結果與討論

2.1 甘青青蘭化學成分分析

實驗前期，對甘青青蘭的提取溶劑、流動相及洗脫梯度進行考察，發現以70%甲醇提取，采用“1.4.1”的色譜條件進行洗脫，所得的總離子流圖峰形良好且離子峰分離較好（見圖1）。

圖1 甘青青蘭樣品（A、B）與對照品（C、D）的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of Ganqingqinglan samples（A，B） and reference samples（C，D）

通過UPLC-Q-Qrbitrap HRMS 分析技術，從甘青青蘭中共鑒定出73 種化合物，包括黃酮類化合物41種，有機酸類15種，氨基酸類8種，其他類9種，其中11種成分由對照品比對鑒定。

2.2 主成分分析

對Compound Discoverer 3.2軟件分析出的化合物進行過濾，以變異系數CV＜50%作為篩選條件，最終得到3 085個化合物特征離子。將41批甘青青蘭樣本及6個QC 樣本數據導入SIMCA14.1軟件進行主成分分析（圖2A）。圖中QC 樣本聚集于模型中央，證明采用的樣品處理和儀器分析方法穩定，且重復性良好。山南市樣本、拉薩市樣本、昌都市樣本各自成組，這也與甘青青蘭樣本的葉子數量和粉末顏色深淺相關。甘青青蘭中黃酮類化學成分占比最多，而黃酮類成分合成受光照強度影響較大，山南地區山高谷深，年平均日照數最少，拉薩市、昌都市次之，但昌都市水資源豐富且氣候區域性差異大，日溫差大適合植物積累養分，有利于甘青青蘭生長，因此推測光照日長與日溫差對甘青青蘭化學成分及其性狀有影響。

圖2 不同地區甘青青蘭的PCA得分圖（A）、OPLS-DA得分圖（B）、隨機置換檢驗圖（C）及兩組間的OPLS-DA得分圖（D～F）Fig.2 PCA score plot（A），OPLS-DA score plot（B），permutation test plot（C） of Ganqingqinglan samples from different regions and OPLS-DA score plots between the two groups（D-F）

2.3 OPLS-DA分析

對3組樣本進行有監督OPLS-DA分析（圖2B），其模型參數R2X=0.824，R2Y=0.982，Q2=0.969。對模型進行200 次隨機置換檢驗（圖2C），檢驗參數R2X=0.034 9＜1，Q2=-0.592＜0.05，證實所建OPLSDA 模型可解釋和預測能力高，擬合良好。將3組樣本進行兩兩比較，并結合VIP＞1，P＜0.05篩選變化顯著的差異代謝物。在SN 與LS兩組樣本間共篩選鑒定出11個差異化合物（圖2D），SN 與CD 兩組樣本間共篩選鑒定出18個差異化合物（圖2E），LS與CD 兩組樣本間共篩選鑒定出21個差異化合物（圖2F）。大多數差異化合物為黃酮類及有機酸類化合物（表2）。綠原酸、金合歡素、柳穿魚黃素是3組樣本共同的差異化合物，以相對峰面積作為計算數值，其中綠原酸在三組之間的含量差別最大，在CD組含量最高（約為11.85 mg/g），LS 組次之（約為7.85 mg/g），SN 組最低（約為5.30 mg/g），推測光照時長與日溫差對甘青青蘭合成綠原酸的影響較大。綠原酸在甘青青蘭中的含量較為豐富［2］且具有抗炎、抗病毒、抗氧化以及保肝的作用［16-17］。從公元8 世紀開始，甘青青蘭清肝熱的功效就已被世人承認，到公元17世紀還發現其具有止血、干黃水、收斂傷口等功效［1］，因此推測綠原酸是甘青青蘭的藥效物質基礎之一。《晶珠本草》中提到：“青蘭陰陽二坡皆生。”西藏多高山，陰坡處甘青青蘭葉子少，陽坡處葉子多，可見地理環境的差異可能對甘青青蘭的性狀及化學成分有顯著影響。

（續表2）

3 結 論

本研究采用UHPLC-Q/Orbitrap HRMS 技術聯合多元統計學對3 批西藏不同地區甘青青蘭樣本進行分析，從甘青青蘭中共鑒定出73 種化合物，包括黃酮類化合物41 種，有機酸類15 種，氨基酸類8 種，其他類9 種，并且發現不同地區的甘青青蘭樣本化學成分存在差異，結合不同地區地理環境，推測光照日長及日溫差對甘青青蘭化學成分有影響。綠原酸是不同地區甘青青蘭樣本中含量差異較大的化合物，同時也是含量較為豐富的化學成分之一，因此推測綠原酸是甘青青蘭的藥效物質基礎之一，而產地差異可能會影響甘青青蘭質量。以上數據可為甘青青蘭的質量控制及后續合理開發利用提供理論基礎。