不同劑量汽化過氧化氫和消毒時間對A2生物安全柜消毒效果的研究

吳大偉，何振健，程雙來，雷迅

(1. 中山大學公共衛生學院，廣東 廣州 510080；2. 廣州美岸生物科技有限公司，廣東 廣州 510080)

0 引言

生物安全柜是開展病原微生物實驗必不可少的設備，它能有效降低生物實驗中病原微生物等產生的有害氣溶膠對實驗操作人員的危害，同時也能降低實驗樣品的污染，起到隔離的作用。衛生行業標準WS 233—2017《病原微生物實驗室生物安全通用準則》[1]對病原微生物生物安全實驗室配置生物安全柜有明確要求，通常生物安全柜雖然本身配置有紫外消毒和高效過濾功能。但經過長時間地開展病原微生物實驗，其生物安全風險依然存在。因此，我國的GB 19489—2008《實驗室生物安全通用要求》中第6.4.16條和《實驗室生物安全認可準則對關鍵防護設備評價的應用說明》中第5.7.3條均指出在安裝和更換HEPA前必須進行徹底消毒，并對其消毒效果進行評價[2-4]。另外生物安全柜每年的性能檢測前也必須預先進行消毒，以降低檢測人員的生物安全風險。因此定期對生物安全柜進行全面消毒已經成為實驗室生物安全管理的常規工作，從而最大程度降低生物安全隱患。由于采用汽化過氧化氫對生物安全柜的消毒具有諸多優勢：第一，對生物安全級別較高的密閉場所空氣和物體表面聯合消毒取得較好的效果，在高級別生物安全實驗室同樣具有較可靠的消毒效果；第二，汽化過氧化氫的分解產物為水和氧氣，基本無殘留，使用相對安全[5]。因此目前普遍采用汽化過氧化氫對生物安全柜進行消毒。本文探索在特定過氧化氫汽化設備的工作下，不同劑量和消毒時間對A2二級生物安全柜的消毒效果的研究，為生物安全柜的規范消毒提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器材料

(1)汽化過氧化氫發生裝置：MiniX過氧化氫消毒機，由廣州美岸生物科技有限公司生產。

(2)過氧化氫試劑：食品用過氧化氫消毒液，型號：SX-XD-Ⅱ，濃度：35%，由荊州雙雄化工科技有限公司生產。

(3)生物指示劑：進口嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bt93 Biological indicator, geobacillus stearothermophilus ATCC7953)。

(4)過氧化氫濃度檢測儀：MiniX過氧化氫消毒機集成檢測儀，由廣州美岸生物科技有限公司生產。

(5)嗜熱芽孢脂肪桿菌培養基：胰酪大豆胨液體培養基，規格：9 mL/管，由廣州市迪景微生物科技有限公司生產。

(6)A2生物安全柜：選用Thermo Scientific公司生產的TELSTAR BIO II Advance 4生物安全柜。主體外部尺寸(長×寬×高)：1 354 mm×759 mm×1 260 mm。

(7)封裝材料：PVC塑料膜。

(8)濕度計：MiniX過氧化氫消毒機集成濕度計，由廣州美岸生物科技有限公司生產。

(9)培養箱：ASH-269型生化培養箱，由上海安弋儀器有限公司生產。

1.2 研究方法

1.2.1 劑量設計

(1)過氧化氫劑量設計

根據預實驗結果設計30 g、40 g、50 g三個劑量組和一個空白對照組，選取15個次A2生物安全柜，隨機分為三個組，每組5個，分別對應三個劑量組，同時設置空白對照組和陽性對照組。空白對照組采用無菌蒸餾水代替生物指示劑，陽性對照組則是生物指示劑不用消毒劑進行消毒。

(2)時間劑量設計

分別對各個過氧化氫劑量組在0.5 h、1.0 h、1.5 h和2.0 h的消毒時長，檢查消毒效果，同時在這些時間點記錄環境溫度和環境濕度。

1.2.2 消毒前準備

(1)生物安全柜準備

用PVC塑料膜對生物安全柜進行密封，如圖1所示，并將其與汽化過氧化氫發生器通過管路連接。

圖1 生物安全柜用用PVC塑料膜密封后的狀態圖

(2)溫度測量準備

用動態溫度計記錄各個時間點消毒空間的環境溫度。

(3)相對濕度測量準備

以A2生物安全柜放置濕度傳感器作為檢測單元，實時記錄各個時間點A2生物安全柜內環境濕度。

(4)過氧化氫濃度測量準備

以A2生物安全柜集成安裝的過氧化氫氣體濃度檢測傳感器作為檢測單元，實時記錄A2生物安全柜內各時間點過氧化氫濃度值。

(5)設置生物指示劑

分別在各個A2生物安全柜的操作臺面的左邊、中間、右邊各放置4片生物指示劑，同時在各個A2生物安全柜頂部的左邊、中間和右邊各放置4片生物指示劑，如圖2所示。

圖2 生物指示劑(BI)在生物安全柜的各個監測位置

1.2.3 消毒過程

在消毒前準備工作完成后，分別往各組的汽化設備加入30 g、40 g和50 g過氧化氫溶液，并啟動汽化過氧化氫消毒裝置，按設定條件完成消毒運行程序，并記錄消毒時間，在0.5 h、1.0 h、1.5 h和2.0 h取出一片生物指示劑進行培養，并記錄消毒空間的溫度、濕度和過氧化氫的濃度。

1.2.4 嗜熱脂肪芽孢桿菌培養

從放置在消毒空間中取出生物指示劑，并接種于相應培養基中，嗜熱脂肪芽孢桿菌置55±1 ℃恒溫培養箱內培養7 d±2 h。

1.2.5 消毒效果判定

結果判定為合格的標準為同時具備以下三個條件：(1)試驗組培養為無菌生長；(2)陰性對照組培養為無菌生長；(3)陽性對照組培養為有菌生長。

2 結論

實驗結果如下：消毒劑劑量為30 g的過氧化氫汽化后的生物指示劑殺滅情況如表1所示，消毒劑劑量為40 g的過氧化氫汽化后的生物指示劑殺滅情況如表2所示，消毒劑劑量為50 g的過氧化氫汽化后的生物指示劑殺滅情況如表3所示。消毒環境溫度為：28～31 ℃，消毒環境濕度為：52%～95%，陰性對照和陽性對照均合格。

表1 消毒劑劑量為30 g的過氧化氫汽化消毒后生物指示劑培養渾濁數

表2 消毒劑劑量為40 g的過氧化氫汽化消毒后生物指示劑培養渾濁數

表3 消毒劑劑量為50 g的過氧化氫汽化消毒后生物指示劑培養渾濁數

3 結語

生物安全柜是一種有效的隔離安全屏障設備，對保護實驗操作人員生命安全和保證實驗質量起到重要作用，隨著生物安全柜在各個應用領域的使用日益增加[8]，人們對生物安全柜本身的消毒也越來越重視和規范。根據《中國藥典》和《美國藥典》的定義，氣相滅菌法是以氣態形式擴散，以冷凝態液體接觸微生物進行快速徹底滅菌的方法。目前氣相滅菌法所用的消毒劑包括過氧化氫(HP)、環氧乙烷(EO)、臭氧(O3)、二氧化氯(ClO2)等。然而，有些消毒劑在使用中存在一些缺陷：或具有毒性/致癌性、對環境不友好(如甲醛)，或對儀器設備、彩鋼板及環氧地面具有一定的腐蝕性(如過氧乙酸和高濃度過氧化氫等)，或存在易燃、易爆等安全隱患(如環氧乙烷和二氧化氯等)[6]。其中，汽化過氧化氫(VHP)則相對具有較多種優點，包括在功效方面：滅菌有效性更好、擴散性更好、應用范圍更廣、“穿透性”更好等；在安全方面：幾乎無毒，可分解為水和二氧化碳；在殘留物方面：自動分解為水和二氧化碳，無明顯殘留[7]。因此汽化過氧化氫(VHP)已成為生物安全柜消毒的首選消毒劑[8]。

汽化過氧化氫(VHP)消毒法主要用到的設備是汽化過氧化氫發生裝置，以前大多為進口設備，目前國產的設備在性能上大大提高，而且價格合理，已經占據越來越大的市場份額。本研究采用國產的MiniX過氧化氫消毒機進行消毒，并使用理想的進口的生物指示劑作為消毒效果監測指標。在消毒實踐中，往往需要在消毒劑使用劑量和消毒時間尋找一組理想的數據，如果使用劑量和消毒時間不夠，無法殺滅生物指示劑，則必須重復消毒直到過關為止，這將造成包括時間、試劑和人工等的浪費。但如果使用過量的消毒劑劑量和消毒時間，則會損害儀器設備，所以尋找一組合適的劑量和消毒時間非常重要。本研究發現，分別使用濃度為35%的過氧化氫消毒劑溶液進行汽化[9]，在消毒劑使用量為30 g這個劑量下，消毒時間為2.0 h，能有效殺滅嗜熱脂肪芽孢桿菌；而在使用量為40 g時，則需要耗時1.5 h才能有效殺滅嗜熱脂肪芽孢桿菌；如果使用劑量達到50 g時，則消毒時間最小，只需1.0 h即可有效消毒。由于過氧化氫具有強的氧化性，特別是在高濃度的情況，對設備具有一定的腐蝕性，因此，可以使用30 g，消毒耗時2.0 h，作為A2型生物安全柜的常規消毒劑量，但如果要減少消毒時間，則選用40 g，耗時1.5 h進行消毒，至于高達50 g劑量組則不建議采用。

值得進一步思考的幾個指標：第一個指標是濃度。目前使用劑量是以35%的過氧化氫消毒劑溶液計算，分別以30 g、40 g和50 g進行實驗，如果按照目前的消毒空間換算，消毒空間為生物安全柜主體體積和支架體積之和，主體外部尺寸(長×寬×高)：1 354 mm×759 mm×1 260 mm，主體體積約為1.3 m3，支架高度為740 mm，支架部分的尺寸為1 354 mm×759 mm×740 mm，約0.76 m3，即消毒空間的總體積為2.06 m3。因此本實驗過氧化氫液體全部汽化后，理論上汽化過氧化氫的使用劑量分別是30 g、40 g和50 g，換算成濃度依次是5.10 g/m3、6.80 g/m3和8.50 g/m3。由于在消毒過程中，部分過氧化氫將會分解成水和氧氣[10]，以及消毒空間各種其他影響因素，導致實際的濃度將會低于理論濃度。消毒空間的汽化過氧化氫的濃度是如何變化的，濃度是否從0開始升高，然后達到飽和狀態后維持在一定濃度水平，最后降解再慢慢降低下來，這需要進一步研究。第二個指標是閃蒸溫度。閃蒸溫度是汽化設備的一個性能指標，閃蒸溫度能使液體過氧化氫迅速汽化成氣溶膠狀態的過氧化氫，使消毒空間的汽化過氧化氫達到飽和狀態并形成有效的消殺濃度，同時能盡最大程度減少過氧化氫分解，閃蒸溫度的持續程度將會導致消毒空間溫度的升高，這需要進行控制。第三個指標是環境溫度。環境溫度必須控制在相對較低的狀態，才有利于汽化過氧化氫的微凝結，從而實現理想的消毒效果。第四個指標是環境相對濕度，環境相對濕度是消毒效果的一個重要影響因素。以上四個指標將在后續的研究中進行深入探索。