大鼠自由落體創傷性腦損傷動物模型的建立

楊家發 朱義通 陸兆豐△ 王亞瓊 陸若玉 李海榮 劉夢佳

1)河南科技大學第一附屬醫院(河南科技大學臨床醫學院)開元院區急診科 洛陽 471003 ;2)上海交通大學公共衛生學院上海 200001

創傷性腦損傷(traumatic brain injury,TBI)是死亡和殘疾的主要原因之一,是一個國際公共衛生問題[1]。為了深入了解腦外傷的機理,研究人員已經建立了一些實驗動物模型,如大鼠自由落體(weight-drop)引起的腦外傷,模擬人類閉合損傷。Western blot分析顯示,與對照大鼠相比,所有炎癥表達標志物在撞擊后第1天和第7天均有所增加。神經功能障礙的嚴重程度和炎癥標志物的誘導與分級的機械沖擊水平密切相關。自由落體誘導的創傷性腦損傷模型可以產生分級腦損傷和誘發神經行為缺陷,并可能與開發創傷性腦損傷的治療策略有轉化相關性[2]。TBI導致血腦屏障功能障礙,兩個關鍵生物過程的破壞引發血腦屏障功能障礙。第一個過程涉及由緊密連接(TJ)蛋白丟失表明的細胞旁運輸增加,允許通常被限制的中性粒細胞等免疫細胞的分子通過,加劇炎癥反應。第二個過程是由于通過內皮細胞(endothelial cells,EC)胞吞作用的增加,導致轉運通常被限制進入大腦的大分子和血清蛋白(如白蛋白)[3]。血腦屏障的測量對研究血腦屏障功能障礙或破壞與腦障礙發病機制間的相互作用具有重要意義。應采用適當的方法研究血腦屏障的完整性。示蹤劑、血漿蛋白、緊密連接蛋白和成像模式可用于檢測血腦屏障的通透性[4]。本研究擬建立自由落體創傷性腦損傷動物模型,通過神經行為學、病理形態學、組織病理學、蛋白免疫學評價動物模型,以期為后續的顱腦損傷研究提供參考。

1 材料與方法

1.1動物選擇40只4月齡無特定病原級雄性 Sprague Dawley 大鼠,購自普萊柯生物工程股份有限公司,動物許可證號:SYXK(豫)2016-0023。體質量(320.17 ± 15.46) g (范圍:215.5～335.4 g)。飼養于 12 h /12 h 明暗交替環境,溫度保持在25 ℃,術前12 h禁食,6 h禁水[2]。

1.2主要試劑和儀器β-APP及GFAP免疫組化試劑盒購自美國Sigma公司,4%多聚甲醛購自上海碧云天生物技術有限公司,注射用鹽酸替來他明鹽酸唑拉西泮(蘇泰?50)購自法國維克有限公司,腦立體定向儀購自深圳瑞沃德醫療器械有限公司,環鉆購自江蘇塞德醫療器械有限公司,24G針管回縮式靜脈留置針購自山東威海銳捷醫用制品有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1 動物分組 將大鼠按體質量隨機分為假手術組和輕度、中度、重度創傷性腦損傷組,每組 10只。

1.3.2 大鼠創傷性腦損傷動物模型[2]實驗用蘇泰(50 mg/kg)腹腔注射后俯臥于腦立體定位儀上,頸部墊圓柱形海綿墊抬升頭部確保頂骨充分暴露。固定后額頂部剃毛、消毒、鋪巾。正中切開,剝離骨膜,暴露右頂骨。用環鉆在冠狀縫后1.5 mm、中線旁 2.5 mm處鉆一直徑7 mm骨窗,保持硬腦膜完整。將內徑6 mm 4.5 g鋼棒分別從內徑7 mm聚氯乙烯透明管高度50 cm、75 cm、100 cm自由下落,撞擊硬腦膜致右頂葉輕、中、重度腦挫裂傷。骨蠟封閉骨窗,縫合頭皮。假手術組開窗后用骨蠟封閉,不施加打擊。

1.3.3 大鼠神經功能評分 采用改良神經損傷評分(modified neurological severity scores,mNSS)量表對各組大鼠在傷后第1、3、7 天進行神經行為學損害程度評分。

1.3.4 HE染色及免疫組織化學染色 傷后24 h,腹腔注射蘇泰麻醉,纖維放大鏡下用24 G針管回縮式靜脈留置股靜脈穿刺。術后1h在麻醉狀態下暴露胸腔,剪開心包,在左心室剪開小口,插入灌流針并固定[2]。夾閉下腔動靜脈及腹主動脈,右心耳剪開小口,左心室灌注0.9%NaCL注射液,直至右心耳流出液清亮為止,以清除血中染料。緩慢灌注4%多聚甲醛,斷頭取腦迅速浸入10%甲醛150 mL固定1 h,石蠟包埋,5 μm 冠狀切片,作HE染色及免疫組化染色[2]。

2 結果

2.1神經行為學改變輕、中、重度組大鼠傷后第 1、3、7 天 的 mNSS 評分均高于假手術組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表 1。

2.2腦組織病理學檢查大體標本觀察:假手術組組織完整,切緣無損傷區;隨著打擊重量或高度增加,損傷區水腫、出血、滲出明顯增加,腦疝逐漸加重。HE染色:假手術組的神經元及神經膠質細胞均正常。隨損傷加重,損傷區結構紊亂,細胞及細胞骨架形態缺失,損傷區邊緣水腫逐漸加重(圖 1)。

2.3免疫組織化學染色結果假手術組大腦皮質無明顯β-APP、GFAP表達,其余各組均可見β-APP、GFAP在神經元漿膜下和(或)軸突處積累,免疫組織化學染色呈棕染。隨致傷量的增加,其陽性染色體神經元細胞數增加和表達強度增強。損傷后24 h,輕度、中度、重度組大腦皮質β-APP 和GFAP表達程度逐漸增強[6](圖 2)。

圖1 創傷性腦損傷24 h后腦組織病理學(HE×400)A:假手術組;B:輕度組;C:中度組;D:重度組

圖2 創傷性腦損傷24 h后腦組織免疫組化染色 A～C 示β-APP染色,E～H示GFAP染色其中,A、E示假手術組,B、F示輕度組,C、G示中度組,D、H示重度組

表1 4組大鼠術后mNSS評分比較

3 討論

TBI是造成死亡、殘疾和精神健康障礙的主要原因之一。大多數TBI患者患有長期創傷后應激、認知功能障礙和殘疾。這種神經病理進展的潛在分子和細胞機制仍不清楚。動物模型能反映不同類型的人類腦損傷。局灶性損傷是一種局域性損傷,在控制性皮層損傷、彈道穿透性腦損傷和Feeney自由落體損傷等動物模型中均有所體現[5]。大鼠自由落體損傷模型模擬了人類創傷性腦損傷引起的彌漫性軸索損傷(diffuse axonal injury,DAI)。TBI對腦實質施加強大的旋轉力和平移力,導致DAI而引發腦細胞腫脹和神經元死亡。TBI后,軸突退變是一個進行性過程,開始于軸突運輸中斷導致軸突腫脹,然后是次級軸突斷開和沃勒氏退變。軸突細胞骨架的這些修飾中斷了軸漿運輸機制,導致運輸產物逐漸聚集,從而產生軸突腫脹和神經元穩態的改變[6-7]。重度自由體質量下降模型的認知功能障礙更為嚴重。與重度自由體質量下降組相比,重度對照皮質撞擊組的腦水腫、炎癥細胞因子改變和皮層神經元凋亡更為明顯[8]。

在不同的TBI模型中,損傷嚴重程度的參數包括壓力峰值、持續時間等力學參數,以及神經系統改變(呼吸暫停、扶正反射時間、耳廓反射等)、體質量減輕、顱內壓增量等生理變化、組織學改變(梗死體積和神經元喪失)、神經系統嚴重程度評分(NSS)和運動功能測試等行為變化[9]。mNSS包括感覺測試、運動測試、反射測試和束平衡測試,用于評估在運動、地面行走、感覺、運動協調、反射和異常運動等方面的神經系統缺陷和神經系統損傷等級[10],自由落體沖擊壓力的分級導致神經系統評分和平衡功能損傷嚴重程度的進展。各種不同程度的沖擊力和加速度可產生不同程度的神經和運動損傷以及軸突炎癥和損傷[11]。本實驗正是應用改良的Feeney自由落體損傷模型,模擬新型皮質損傷及彌漫性軸索損傷,以探索建立穩定可靠、簡便易行、可重復性的TBI動物模型,為下一步臨床研究奠定基礎[12]。

尋找診斷和TBI分期的血液標志物,評估TBI和生存時間間隔的免疫組化標志物,一直引起人們極大的興趣。β-淀粉樣前體蛋白(Beta-amyloid precursor protein,β-APP)是一種跨膜糖蛋白,是神經元細胞的正常成分。它經過高爾基體的加工,沿軸突快速順行運輸[13-14]。其功能包括細胞黏附、生長、神經保護和損傷反應(促進軸突萌發、突觸發生、軸突生長)。是目前檢測外傷性軸突損傷的“金標準”。因為它非常敏感,在創傷性腦損傷后2 h內可識別陽性反應。β-APP是致死性腦外傷外傷性軸突損傷的敏感標記物。軸突損傷首先表現為在擴張的軸突、腫脹和扭曲的軸突及軸突鱗莖中β-APP蛋白的積累,與其他研究一致。在存活2 h時觀察到軸突損傷為擴張軸突,而在存活12～24 h后,受損軸突嚴重腫脹,類似軸突鱗莖。本實驗證明,在死后檢查中,β-APP免疫反應升高是DAI的標志。在沒有肉眼可見的TBI情況下,β-APP的增加表明,即使是輕微的頭部損傷也可能導致神經元水平的損傷,在常規的法醫解剖和組織病理學檢查中可能無法診斷[15-16]。Hortobagyi[17]和同事利用抗原檢索法證明,在顱腦損傷后35～60 min的創傷后生存中,β-APP免疫反應可以檢測早期軸突損傷。

GFAP免疫反應性表明創傷的嚴重程度與GFAP免疫陽性之間存在相關性[18]。GFAP是一種存在于白質和灰質的星形膠質細胞中的細胞骨架單絲蛋白。GFAP也存在于非神經膠質細胞和非中樞神經系統細胞中,如無髓鞘的雪旺細胞、軟骨細胞、睪丸間質細胞、腸膠質細胞、足細胞、系膜細胞、肝臟和胰腺等星形細胞。GFAP作為一種來自鈣蛋白酶和半胱天冬酶的分解產物,特別是caspase-3、6和9[19]。GFAP是成人大腦中主要的支架蛋白,是成熟星形膠質細胞的特征蛋白。在發育過程中,GFAP由放射狀膠質細胞表達。這些雙極性細胞位于心室區,具有神經干細胞的功能。誘導表達GFAP或抗GFAP免疫標記染色的結構相關蛋白,以及創傷后腦腫脹的結果。同樣,神經元中的GFAP以前主要在亞急性和遲發性腦外傷中檢測到,在急性死亡仍有陽性表達。多項研究和某些神經干細胞中GFAP表達模式為神經元表達GFAP mRNA的能力提供了證據[20]。本實驗中β-APP及GFAP免疫組化陽性表達在相關研究均有證實。

本實驗大鼠創傷后神經行為學評分具有良好的統計學意義,病理學大體觀察及HE染色模擬皮質損傷及彌漫性軸索損傷,具有水腫性、出血性、壞死性等改變,為后續的臨床干預提供基礎。通過β-APP、GFAP免疫學實驗,證明該損傷模型與同類實驗有良好相關性,因此,該TBI動物模型穩定可靠、簡便易行,具有良好的可重復性。