抑癌基因VHL與RNASET2甲基化協同microRNA調控卵巢癌細胞耐藥逆轉

丁萬寶 張培先 郭 歡 盧久琴 鄧 磊 石 嵐 戴 輝 鮑 新 趙艷芳

（昆明市延安醫院腫瘤科，云南 昆明 650000）

卵巢癌嚴重威脅婦女生命和健康[1]。由于卵巢癌早期缺少癥狀，約70%的患者發現時已處于晚期，5年生存率僅為30%[2]。絕大多數卵巢癌患者在化療后會復發并發展成多藥耐藥[3]，卵巢癌產生耐藥機制的原理、預防耐藥和對抗耐藥是當前研究的熱點與難點。多藥耐藥是指腫瘤和某種化療藥物長時間接觸之后對其產生耐藥性，且同時交叉耐受其他結構和作用機制不同的化療藥物[4-5]。目前報道的引起腫瘤耐藥有多種原因，其中較為典型的是各種凋亡蛋白或凋亡抑制蛋白參與化療藥物誘導的細胞凋亡以及耐藥的發生[6]。另外，代謝改變，已知鉑類敏感性與內源性葉酸缺乏有關[7]。

腫瘤細胞耐藥性的形成大多由多藥耐藥相關基因的差異表達所致[8]。耐藥相關基因包括細胞周期相關基因、多藥耐藥相關基因、原癌基因及抑癌基因等[9]，其中抑癌基因是一類存在于正常細胞中，與原癌基因共同調控細胞生長和分化的基因，其功能丟失會引起細胞失控分裂和生長，最終導致腫瘤的發生[10]。抑癌基因表達異常是由遺傳物質和表觀遺傳修飾異常所致[11-12]。表觀遺傳修飾包括DNA甲基化、組蛋白修飾及miRNA等[13]。DNA甲基化是目前研究最多的表觀遺傳調控機制之一，而由CpG島的DNA超甲基化所致的抑癌基因的沉默更是目前表觀遺傳領域研究的重要內容[14]。另外，miRNA通過和靶基因之間一對多和多對一的調控關系，廣泛參與調節機體生長發育、生理功能等生命活動過程，尤其是惡性腫瘤的發生發展過程[15]。DNA甲基化和miRNA之間還存在雙向調控作用，這在很多腫瘤研究包括卵巢癌的研究中已得到證實[16-17]。

本研究通過篩選GEO 公共數據庫數據集（GSE176218 Public on May 16,2022；GSE198077 Public on Apr 20,2022），比較耐藥細胞和非耐藥細胞的基因表達譜篩選在耐藥細胞中的抑癌基因，然后通過CpG島及甲基化位點分析，miRNA預測和GeneMANIA互作網絡分析軟件等對抑癌基因進行生物信息學分析，探索抑癌基因表觀遺傳修飾和卵巢癌多藥耐藥機制。

1 資料與方法

1.1 差異基因篩選 基因芯片獲取：按照樣本數量超過20例、設置對照組和人卵巢組織標本條件在NCBI的GEO數據庫中隨機篩選出2套卵巢癌數據集（GSE176218 Public on May 16，2022；GSE198077 Public on Apr 20，2022）（GSE176218，GSE198077）。從GPL570平臺選擇GSE79973、GSE54129，從GPL6947平臺選擇CSE29998數據集。其中GSE176218中有21例癌組織和111例正常組織，GSE198077中有50例癌組織和49例正常組織。系統檢索GEO（Gene Expression Omnibus）（GSE176218，GSE198077）數據庫，通過比較藥物敏感和耐藥樣本基因表達差異對卵巢癌耐藥相關基因芯片表達數據集進行檢索。利用BH法分析差異基因表達，在GEO2R工具中開展多重假設檢驗方法。

1.2 抑癌基因CpG島、甲基化位點及miRNA結合位點的生物信息學分析 通過在線CpG島及甲基化位點分析軟件CpGPlot和CpG Island Searcher對抑癌基因進行DNA甲基化預測。通過在線miRNA預測軟件miRWalk和HOCTar對抑癌基因進行基因的靶miRNA預測，其同時包含了miRanda、miRDB等5個預測軟件。“1”表示軟件預測到了抑癌基因的靶miRNA，“0”表示沒有預測到。針對每個抑癌基因，本研究僅選取得分最高的兩個miRNA進行相關研究。通過GeneMANIA基因/蛋白網絡分析軟件對抑癌基因進行互作分析。

1.3 Kaplan-Meier數據庫的使用 采用Kaplan-Meier Plotter在線分析抑癌基因表達水平與卵巢癌預后的關系，以抑癌基因表達水平的中位數作為分組依據，分為高、低表達兩組，然后分別選擇卵巢癌的總生存期進行分析。

1.4 細胞培養 人卵巢癌SKOV3細胞培養于含10%FBS的DMEM完全培養液中，37 ℃，5% CO2培養箱中長期傳代培養。采用慢病毒shRNA技術構建穩定表達hsa-miR-635 shRNA和hsa-miR-106b shRNA或對照shRNA的慢病毒，感染SKOV3細胞構建穩定細胞株。

1.5 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）miRNA逆轉錄采用miRcute miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒。PCR反應采用miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒。具體操作按試劑盒說明進行。

1.6 雙熒光素酶報告基因檢測 向人卵巢癌SKOV3細胞轉染或不含靶基因3'-UTR序列的pLUC載體，篩選穩定轉染細胞系。然后將化學合成的miR-635和miR-106分子的mimics分別共轉染至上述穩定轉染細胞系。細胞共轉染48 h，按說明書，分別測定螢火蟲熒光素酶RLU值。

1.7 細胞活力實驗 將SKOV3細胞接種于96孔板，用不同濃度的藥物或抑制劑處理后調整細胞密度至每孔5 000，將20 μL MTT溶液加入其中，孵育時間為4 h。對細胞培養進行終止，將培養液上清去掉，之后將150 μL的DMSO加入到每孔中，對其進行振蕩，結晶融解之后在490 nm波長處對細胞吸光度進行檢測。

1.8 統計學方法 采用SPSS 21.0統計學軟件對數據進行分析，符合正態分布的計量資料用表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 差異基因篩選 利用公共平臺數據庫GEO，下載卵巢癌細胞系SKOV3耐藥的相關數據（GSE176218，GSE198077），通過比較藥物敏感和耐藥樣本的基因表達差異，篩選出2 450個表達差異基因，其中VHL和RNASET2基因表達差異最顯著（表1，圖1 A～B），且生存分析顯示VHL和RNASET2高表達患者預后較好（圖1 C～D）。將VHL和RNASET2基因作為候選基因，進行后續的功能研究。

圖1 差異基因篩選

表1 RNASET2和VHL基因芯片數據庫數據及qPCR分析結果

2.2 VHL與RNASET2基因DNA甲基化程度和甲基化位點分析 通過甲基化位點分析軟件CpG Island Searcher對VHL進行DNA甲基化預測，發現VHL與RNASET2均具有CpG島和甲基化位點，推測VHL基因表達可能受DNA甲基化調控（圖2 A）。利用甲基化抑制劑處理卵巢癌SKOV3/DDP耐藥細胞，然后利用qPCR檢測發現甲基化抑制劑處理后VHL和RNASET2表達顯著升高（圖2 B～C）。

圖2 VHL和RNASET2基因DNA甲基化程度和甲基化位點分析

2.3 miRNA靶向抑癌基因的驗證 利用shRNA技術在SKOV3/DDP細胞中分別敲低hsa-miR-635和hsa-miR-106b，結果顯示sh-hsa-miR-635和sh-hsa-miR-106b穩轉效率具有統計學意義（P＜0.05）（圖3 A～B），然后檢測RNASET2和VHL基因表達，結果顯示RNASET2和VHL基因表達顯著升高（P＜0.05）（表2，圖3 C～D）。雙熒光素酶檢測結果顯示，hsa-miR-635與RNASET2以及hsa-miR-106b與VHL間均存在靶向關系（圖3 E～F）。

圖3 miRNA靶向抑癌基因的驗證

表2 在線軟件miRWalk和HOCTar預測抑癌基因的靶miRNA

2.4 DNA甲基化及miRNA修飾協同調控卵巢癌細胞耐藥性 在卵巢癌SKOV3/DDP耐藥細胞系中敲低miR-106、miR-635、mi635+5-Aza-CdR，觀察上述細胞系在化療藥物順鉑不同濃度作用下的細胞活力，結果顯示敲低miR-106和miR-635都顯著升高了細胞系對順鉑的敏感性，添加甲基化抑制劑后，敏感性進一步增加（圖4）。

圖4 MTT檢測各組細胞在化療藥物順鉑不同濃度作用下的細胞活力

2.5 DNA甲基化及miRNA修飾協同通過PI3K/AKT分子機制調控卵巢癌細胞耐藥性 有研究表明，miR-106可以調控PI3K/AKT信號通路[18]，通過RT-PCR檢測發現，敲低miR-106與miR-635和添加甲基化抑制劑后通過降低PI3K/AKT表達增加細胞對順鉑的敏感性（圖5 A～D）。

圖5 RT-PCR檢測PI3K/AKT水平上的表達變化

3 討論

腫瘤多藥耐藥較為復雜，其中和多種生物學事件都有著很大關系，但均和差異表達存在密切關聯[19]。本研究通過文獻檢索及功能富集等生物信息學分析，從卵巢癌耐藥細胞系中篩選出2個與多藥耐藥相關的抑癌基因RNASET2和VHL。RNASET2被認為是第二類抑癌基因，并被證實通過參與調節微環境、腫瘤轉移及細胞生長等來參與腫瘤的發生和發展。VHL是公認的抑癌基因，并被證實在多種腫瘤如腎癌、結腸癌及卵巢癌等多種實體癌的發展中發揮著重要作用[20]，并通過參與=調控腫瘤生長和細胞死亡等方式參與腎癌細胞耐藥的發生和發展[21]。

DNA甲基化和miRNA修飾是抑癌基因沉默表達的重要修飾方式，被證明和多藥耐藥的形成有關[22]。本研究發現，VHL、RNASET2均具有CpG島和（或）甲基化位點，可能受DNA甲基化調控。DNA甲基化和miRNA修飾之間存在協同調控作用[23]。本研究通過Biogrid數據庫查找基因水平和蛋白水平上的相互作用關系，并未發現RNASET2和VHL的相互作用關系，但它們分別與多個基因互作，且這些基因之間存在直接或間接的互作關系，在一定程度上可以說明RNASET2和VHL可能在功能上緊密相關[24]。

雖然抑癌基因的DNA甲基化和miRNA調控與卵巢癌多藥耐藥的相關研究取得了一定的進展，但由DNA甲基化和miRNA協同調控下的抑癌基因沉默與卵巢癌多藥耐藥相關的研究還鮮有報道。本研究結果表明，RNASET2和VHL基因沉默表達的DNA甲基化與miRNA的協同調控機制，在DNA甲基化抑制劑和miRNA抑制劑作用下，抑癌基因重新表達對卵巢癌細胞多藥耐藥的影響，DNA甲基化和miRNA協同調控下的抑癌基因通過影響PI3K/AKT信號通路影響卵巢癌多藥耐藥。本研究研究結果可對卵巢癌多藥耐藥問題進行更加深入研究和解決這一問題提供一定的參考和依據，對卵巢癌多藥耐藥的靶點治療和靶藥物的篩選提供理論指導，對臨床診斷和預后有一定的指導意義。