LncRNA-MALAT1/miR-125b-5p/PDCD4分子軸參與心力衰竭發生發展的機制研究

賴紀英 郭宗文 岳霖琳 沈恩芳 歐陽松茂 朱宏泉

（贛南醫學院第一附屬醫院重癥醫學科，江西 贛州 341000）

慢性心力衰竭是由于各種致病因素引起的心臟舒 張功能障礙或心臟負荷過重，導致心泵功能降低的臨床綜合征，是多種心血管疾病發展到終末階段共同作用的結果[1]。《中國心血管報告2018》數據結果表明，我國心力衰竭患者約450萬，每年新發心力衰竭患者約50萬，且隨著人口老齡化的加劇，使得慢性心力衰竭患病率呈上升趨勢[2]。目前，臨床上對于慢性心力衰竭竭以藥物治療為主，如醛固酮拮抗劑、利尿劑、伊伐布雷定等，盡管治療方法不斷改進，但是患者病死率、再住院率仍較高[3]。因此，積極探究心力衰竭細胞增殖、侵襲相關因子及信號通路，對于臨床治療心力衰竭、改善患者預后具有重要意義。LncRNA是近年治療心力衰竭藥物的重要方向，經檢索大量文獻發現，LncRNA在心力衰竭發展中具有調控作用，但是對于其機制研究未見具體實驗報告[4]。在心力衰竭患者中，LncRNA-MALAT1表達顯著下調，能競爭性結合miR-125b-5p，使其解除對PDCD4的抑制，促進PDCD4的表達，從而抑制炎性反應，但該結論尚未得到證實[5]。本研究主要探討LncRNAMALAT1/miR-125b-5p/PDCD4分子軸參與心力衰竭發生發展的機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物材料 購置SD大鼠40只，隨機取大鼠10只為對照組，剩余大鼠30只大鼠建立心力衰竭動物模型，建模成功后設為觀察組；并將觀察組隨機分為模型組、空載組和MALAT1沉默組各10只。40只SD大鼠，雌雄隨機，體質量180～220 g，平均（200.00±20.00）g。動物合格證號SCXX-2015-0021，所選動物均購置于中國醫科大學實驗動物中心；將購置的大鼠于動物房7 d適應性喂養，安靜環境飼養，室溫（22±2）℃，12 h交替光照，自由飲水。

1.2 儀器與設備 HE染色試劑盒及酶聯免疫吸附試驗試劑盒，購自于美國Roche公司；胎牛血清（FBS），購自于美國Hyclone公司；siRNA合成，購自于上海吉瑪基因生物技術有限公司；超凈工作臺，購自于蘇州凈化設備有限公司；倒置顯微鏡，購自于日本Olympus公司；Bio-rad Real-Time QRT-QRT-PCR擴增儀，購自于美國Bio-rad公司；電泳裝置，型號DYCP-31BM，購自于北京市六一儀器廠；凝膠成像及分析系統，型號LabWorks TM，購自于美國UVP公司；離心機，型號5415D，購自于德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 心力衰竭動物模型建立 30只采用結扎大鼠左冠狀動脈前降支造成心肌梗死后形成心肌梗死模型，具體方法如下。取參與建模的SD大鼠，常規采用濃度為5%水合氯醛（6 mL/kg）腹腔注射麻醉，待麻醉生效后，大鼠保持仰臥位固位于鼠板上，并于大鼠左側第三肋和第四肋間進行開胸，充分顯露并將心臟擠出。在肺動脈圓錐和左心耳尖之間、距離左心耳下緣2 mm部位，常規采用5-0結扎線快速結扎，在操作完畢后，立即將心臟恢復原位，采用2-0縫合線進行縫合。建模5周后，對SD大鼠進行超聲心功能檢測，以左室射血分數（ejection fraction，EF）＜50.0%為建模成功。于第14日取材組織并完成心功能測定，采用HE染色檢測其病理學變化[6]。

1.3.2 心力衰竭大鼠處理方法 ①慢病毒注射。攜帶慢病毒轉染干擾LncRNA-MALAT1序列（LVshMALAT1）及其空載（LV-Control），購自于吉凱基因。于建模前2周，利用離體定位儀，由微量加樣器將慢病毒注入SD大鼠右側連個位點。其中，位點1：A-P 1.0 mm，M-L-2.0 mm，D-V-1.2 mm；位點2：A-P-3.0 mm、M-L-1.5 mm、D-V-1.2 mm；每個位點2.5 μL；注射病毒的速度為0.5μL/mL，拔針前原位停留5 min。②實驗分組。利用慢病毒轉染干擾LncRNA-MALAT1序列（LV-shMALAT1）及其空載（LV-Control）；觀察治療大鼠的干預效果[7]。

1.3.3 檢測方法 采用實時熒光PCR法和Western Blot檢測LncRNA MALAT1、miR-125b-5p和PDCD4表達水平。①實時熒光PCR法。常規采用miRNeasy Mini試劑盒提取組織總miRNA，通過TaqMan miRNA反轉錄試劑盒形成cDNA，通過TaqMan miRNA分析試劑盒完成miRNA測定。通過比較循環閾值并以U6作為內參，計算LncRNA MALAT1、miR-125b-5p和PDCD4 miRNA相對表達水平；采用RNeasy Mini試劑盒提取心肌組織總RNA。BestarTM qPCR試劑盒將其逆轉錄為cDNA；設定反應條件：37 ℃下15 min、98 ℃下下5 min，然后借助BestarTM qPCR預混液完成qPCT實驗。設定反應條件：95 ℃下2 min、94 ℃下20 s、58 ℃下20 s、72 ℃下20 s，連續完成40個循環，最后72 ℃下完成4 min延伸。待上述操作完畢后，借助Agilent Stratagene Mx 3000P序列完成實時熒光PCR分析，以GAPDH為內參，計算LncRNA MALAT1、miR-125b-5p和PDCD4相對表達量[8]。②Western Blot檢測。采用含有PMSF的RIPA裂解液，完成心肌組織中總蛋白的提取，冰上完成30 min孵育，10 min離心，速度8 000 r/min，溫度為4 ℃，取上層清液。BCA試劑盒檢測總蛋白濃度，取50 μg蛋白，將其溶于2×SDS上樣緩沖液中煮沸，常規完成SDS-PAGE凝膠電泳，采用濕轉發將蛋白轉移到PVDF膜，5%脫脂奶粉于室溫下完成1 h封閉，將PVDF膜與稀釋的一抗、GAPDH作為內參，在4 ℃下孵育過夜，TBST連續完成3次洗滌，將膜與HRP標記的二抗山羊抗兔IgG H&L（HRP）孵育，經TBST漂洗后，置于干凈的玻璃平板上。根據ECL熒光檢測試劑盒中說明書完成。待上述操作完畢后，借助Bio-R心力衰竭圖像分析系統照相，采用Quantity One V4.6.2軟件進行分析，以相應的蛋白條帶的灰度值表示相對蛋白含量[9]。

1.4 觀察指標 ①心功能測定。各組大鼠處理完畢后，采用超聲心動圖測定大鼠EF和左室短軸縮短率。②HE染色。觀察組與對照組大鼠以斷頸方式處死，取心肌組織，經石蠟包埋后制備4μm切片，并完成HE染色[10]。③LncRNA MALAT1、miR-125b-5p和PDCD4表達水平。記錄各組大鼠干預后LncRNA MALAT1、miR-125b-5p和PDCD4表達水平。④炎性因子。大鼠處理完畢后，以斷頸方式處死，取尾末梢血3 mL，采用酶聯免疫吸附試驗測定炎性因子腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）和白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）[11]。

1.5 統計學分析 采用SPSS 26.0軟件處理，計量資料采用表示，組間比較行t檢驗；計數資料采用n（%）表示，組間比較行χ2檢驗；P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組心功能及組織變化比較 觀察組建模完畢后EF及左室短軸縮短率低于對照組（P＜0.05）；觀察組中MALAT1沉默組EF及左室短軸縮短率高于模型組、空載組（P＜0.05）；模型組及空載組EF及左室短軸縮短率差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組心功能水平比較（）

表1 各組心功能水平比較（）

注：a與模型組比較，P＜0.05；b與空載組比較，P＜0.05；c與MALAT1沉默組比較，P＜0.05。

2.2 各組HE染色結果比較 HE染色結果表明，模型組和空載組心肌纖維斷裂，細胞核紊亂、肥大、間隙增寬、染色加深；MALAT1沉默組心肌纖維斷裂有所改善，細胞排列相對整齊，見圖1。

圖1 各組大鼠HE染色結果

2.3 各組大鼠LncRNA MALAT1、miR-125b-5p和PDCD4表達水平比較 實時熒光PCR法和Western Blot法結果表明，模型組與空載組LncRNA MALAT1、miR-125b-5p和PDCD4 mRNA及蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05）；MALAT1沉默組LncRNA MALAT1 mRNA、miR-125b-5p及蛋白表達低于模型組與空載組（P＜0.05）；PDCD4 mRNA及蛋白表達高于模型組與空載組（P＜0.05）。見表2和圖2。

圖2 各組大鼠相關蛋白水平

表2 各組大鼠LncRNA MALAT1、miR-125b-5p和PDCD4 mRNA比較（-x±s）

2.4 各組大鼠炎性因子比較 模型組與空載組炎性因子TNF-α和IL-1β水平差異無統計學意義（P＞0.05）；MALAT1沉默組炎性因子TNF-α和IL-1β水平低于模型組與空載組（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠炎性因子比較（）

表3 各組大鼠炎性因子比較（）

注：a與模型組比較，P＜0.05；b與空載組比較，P＜0.05。

3 討論

目前，全球醫學界對于心力衰竭的防治工作越發重視，探索心力衰竭發生發展分子機制，尋找心力衰竭診療新模式成為當前研究的熱點。因此，針對心力衰竭的預防、早期診斷及治療成為研究的重點，而無創性診療方法或分子靶標亟待被發現。PDCD4是細胞凋亡的關鍵誘導因子，當PDCD4被miRNA抑制后，心力衰竭患者心肌細胞凋亡降低，凋亡引起的心肌細胞丟失不但會影響心臟收縮功能，參與心力衰竭的發生及發展，亦可直接影響電信號的傳遞，導致心律失常。PDCD4與p53均為調節細胞凋亡的關鍵蛋白，miR-125b-5p能通過靶向抑制p53蛋白的表達，從而抑制心肌細胞凋亡，從而預防急性心肌梗死的發生[12]。本研究中，觀察組EF及左室短軸縮短率低于對照組（P＜0.05）；MALAT1沉默組EF及左室短軸縮短率高于模型組及空載組（P＜0.05）；HE染色結果表明，模型組和空載組心肌纖維斷裂，細胞核紊亂、肥大、間隙增寬、染色加深；MALAT1沉默組心肌纖維斷裂有所改善，細胞排列相對整齊，從本研究結果看出，LncRNA-MALAT1/miR-125b-5p/PDCD4分子軸能直接參與心力衰竭的發生和發展。抑制PDCD4的表達能抑制心肌細胞凋亡，并緩解缺氧/復氧引起的心臟損傷，可顯著促進心力衰竭所引起的炎性反應。因此，以此為靶點開發心力衰竭的治療藥物具有廣泛的價值[13]。

miRNA是當前神經損失疾病中的熱點之一，作為一類高度保守且于炎性反應相關的重要的調控因子，主要作用于靶基因'3-UTR區，能抑制靶基因翻譯，亦可引起靶基因的降解。因此，靶基因的mRNA編碼區以及蛋白翻譯過程中均受到miRNA的調控。miRNA在心力衰竭的發生及發展中發揮了重要的作用，能調控宿主免疫反應，如miR-125b-5p、miR-155等，均能參與免疫和炎性反應[14]。特異性的miRNA通過靶向mRNA調節炎性反應，有望成為心力衰竭良好的替代方案。本研究中MALAT1沉默組LncRNA MALAT1 mRNA、miR-125b-5p及蛋白表達低于模型組與空載組（P＜0.05）；PDCD4 mRNA及蛋白表達高于模型組與空載組（P＜0.05）；模型組與空載組炎性因子TNF-α和IL-1β水平差異無統計學意義（P＞0.05）；MALAT1沉默組炎性因子TNF-α和IL-1β水平低于模型組與空載組（P＜0.05）。從本研究結果可以看出，在心力衰竭大鼠中，能競爭性結合miR-125b-5p，提高PDCD4表達水平，從而抑制機體內的炎性反應。LncRNA能作為一種競爭性內源RNA，并以“海綿”吸附的方式通過共同的miRNA反應元件，相互競爭結合共同的miRNA，從而解除miRNA對靶基因mRNA的作用[15]。LncRNA為長度＞200個核苷酸非編碼RNA，能通過在轉錄、轉錄后及表觀遺傳水平調節基因表達。而miR-125b-5p能靶向調控PDCD4參與心力衰竭病理進程，競爭性結合miR-125b-5p靶向調控PDCD4促進心力衰竭的發生和發展，可為精準研發治療心力衰竭的治療藥物提供科學依據，具有重要的實際意義。

綜上所述，心力衰竭大鼠中LncRNA-MALAT1表達顯著下調，能競爭性結合miR-125b-5p，使其解除對PDCD4的抑制，促進PDCD4表達，從而抑制炎性反應，為心力衰竭治療提供新的思路。