一測多評法同時測定廣西桑葉及其炮制品中5種活性成分含量

楊海玲,蘇國惠,黃華楓,顏彩蓮,陸東萍,劉振杰

(廣西中醫藥大學,廣西 南寧 530001)

桑葉為桑科植物桑MorusalbaL.的干燥葉,具有疏散風熱、清肺潤燥、清肝明目功效,常用于風熱感冒、肺熱燥咳、目赤昏花、頭暈頭痛等[1],在《本草綱目》中又有“神仙葉”之稱[2]。桑葉炮制歷史悠久,有蜜炙[3]、蜜水拌蒸[4]、微炒[5]、蒸熟[2]、九蒸九曬[6]、燒存性[7]等多種炮制方法。生桑葉與蜜桑葉的炮制方法一直沿用至今,生桑葉在《中華人民共和國藥典》2020年版與各省市炮制規范中均有收載,蜜桑葉則多收載于全國及各地方的炮制規范中[8-11],但其蜜炙方法與工藝并不一致,缺乏了統一標準。現代研究表明,桑葉中含有黃酮、生物堿、多糖等多種化學成分,其中綠原酸、蘆丁、紫云英苷、異槲皮苷和槲皮素等具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗腫瘤和保護心血管等藥理活性[12-15];但目前有關其炮制工藝與活性成分影響的報道較少[16-17]。在對照品缺乏的情況下,采用一測多評法(QAMS)在中藥飲片及中成藥進行質量控制方面已有一定應用[18-20]。因此本實驗采用高效液相色譜法(HPLC),以蘆丁為參照物,運用一測多評法建立綠原酸、異槲皮苷、紫云英苷和槲皮素的相對校正因子,并對桑葉、蜜炙桑葉、蜜烘桑葉、清炒桑葉、蜜水拌蒸桑葉工藝進行研究,分析比較炮制前后上述5種化學成分含量的變化,以期為桑葉炮制工藝、炮制原理及臨床合理用藥提供實驗依據。

1 儀器與試劑

1.1 實驗材料

桑葉購自南寧市賓陽縣萬潤本草有限公司中藥飲片廠(批號:17082101),經廣西中醫藥大學梁子寧教授鑒定為桑科植物桑MorusalbaL.的干燥葉。

對照品:紫云英苷(批號:MUST-18031820),異槲皮苷(批號:MUST-17051005),購自中國科學院成都生物研究所;綠原酸對照品(批號:PS08072303),蘆丁(批號:PS03180500);槲皮素對照品(批號:PS06050025),購自成都普思生物科技股份有限公司。甲醇、乙腈均為色譜純(Fisher);娃哈哈純凈水,其他試劑均為分析純。蜂蜜(上海冠生園蜂制品有限公司,批號182404Y2)。

1.2 實驗儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司);SQP電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司);KQ5200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);DHG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱(上海齊欣科學儀器有限公司)。

2 方法與結果

2.1 煉蜜

取蜂蜜適量置于不銹鋼鍋,加20%左右的溫水,文火(400W)進行加熱至淺黃色(116～118℃),用手捻之有黏性且無長白絲出現,即得。

2.2 桑葉不同炮制品的制備

2.2.1 桑葉 取原藥材,除去雜質,搓碎,去柄,篩去灰屑,即得。作為樣品1,見表1。

表1 桑葉炮制品的制備

2.2.2 清炒桑葉 取桑葉100g,置預熱電炒鍋內,用文火(400W)炒,至顏色略變黃、變脆,取出,即得。作為樣品2,見表1。

2.2.3 蜜蒸桑葉 取桑葉100g,加入定量冷開水稀釋的煉蜜,拌勻悶潤1h,蒸1h,于55℃烘箱中干燥 4h,取出放涼,即得。作為樣品3,見表1。

2.2.4 蜜炙桑葉 取桑葉100g,加入定量冷開水稀釋的煉蜜,拌勻悶潤1h,置預熱電炒鍋內,用文火(400W)炒至顏色加深、不粘手時,取出放涼,即得。作為樣品4～8,見表1。

2.2.5 蜜烘桑葉 取桑葉100g,加入定量冷開水稀釋的煉蜜,攪勻悶潤1h,于烘箱中55℃干燥4h,取出放涼,即得。作為樣品9～13,見表1。

2.3 色譜條件

色譜柱:KROMASIL 100-5 C18(250mm×4.6mm),流動相:乙腈(A)-0.2%磷酸水(B),梯度洗脫條件:0～9min,15%～20%A;9.01～20min,20%～25%A;20～30min,25%～35%A;30～37min,35%～38.5%A,流速:0.6mL/min;波長:360nm;柱溫:30℃;進樣量:20μL。該色譜條件下,桑葉各炮制品5個色譜峰分離效果良好。結果見圖1。

注:A.桑葉;B.炒桑葉;C.蜜蒸桑葉;D.蜜炙桑葉;E.蜜烘桑葉;F.混合對照品。1.綠原酸;2.蘆丁;3.異槲皮苷;4.紫云英苷;5.槲皮素。圖1 不同炮制工藝桑葉飲片及混合對照品HPLC

2.4 對照品溶液的配制

精密稱取紫云英苷12.75mg、綠原酸50.00mg、蘆丁68.75mg、異槲皮苷12.50mg、槲皮素0.98mg置于同一50mL棕色容量瓶中,加50%甲醇溶解并定容至刻度。精密量取上述對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL至量瓶中,用50%甲醇定容至10mL,即得。

2.5 供試品溶液的制備

取樣品粉末(40目)約1.0g,精密稱定,置100mL磨口錐形瓶中,用25mL移液管加入50%甲醇,在90℃的溫度下加熱回流30min,取出放冷后過濾,濾渣再用50%甲醇25mL以相同的方法提取2次,最后合并3次回流提取的濾液,用旋轉蒸發儀濃縮濾液后將濾液轉移至50mL容量瓶中,加50%甲醇定容至刻度,離心即得。

2.6 方法學考察

2.6.1 線性關系考察 精密吸取綠原酸、蘆丁、紫云英苷、異槲皮苷、槲皮素的不同濃度混合對照品溶液,按“2.3”項下色譜條件進行進樣與測定,以對照品的進樣量(μg)為橫坐標(X),峰面積為縱坐標(Y),繪制標準曲線,結果見表2。結果顯示,各成分在各自濃度的范圍內呈良好的線性關系。

表2 桑葉中5種成分的線性關系考察結果

2.6.2 精密度試驗 精密吸取“2.4”對照品溶液10μL,按“2.3”項下色譜條件連續進樣6次,計算各峰峰面積RSD,結果綠原酸、蘆丁、紫云英苷、異槲皮苷、槲皮素分別為1.08%、2.03%、1.68%、2.13%、1.64%,表明試驗儀器精密度良好。

2.6.3 重復性試驗 取桑葉粉末(40目),按“2.5”項下方法平行制備6份樣品溶液。在“2.3”色譜條件下進行檢測,測定綠原酸、蘆丁、紫云英苷、異槲皮苷、槲皮素的峰面積。結果綠原酸、蘆丁、紫云英苷、異槲皮苷、槲皮素含量依次為1.44、0.67、0.12、0.46、0.04mg/g,RSD分別為1.79%、1.17%、1.76%、1.69%、2.43%。證明本研究所建立的方法重復性良好。

2.6.4 穩定性試驗 精密吸取桑葉供試品溶液20μL,按“2.3”項下色譜條件,分別在0、2、4、6、8、12h進樣,測定峰面積,計算綠原酸、蘆丁、紫云英苷、異槲皮苷、槲皮素峰面積RSD值分別為1.45%、1.40%、1.77%、2.01%、2.64%,表明供試品溶液12h內穩定。

2.6.5 加樣回收率試驗 稱量已知含量的桑葉粉末(40目)6份,每份約0.5g,精密稱定。分別精密加入適量綠原酸、蘆丁、紫云英苷、異槲皮苷、槲皮素對照品溶液。按“2.5”項下的方法制備供試品溶液,按“2.3”項下色譜條件進行測定,計算加樣回收率和RSD值。結果綠原酸、蘆丁、紫云英苷、異槲皮苷、槲皮素平均加樣回收率分別為 100.06%、100.09%、98.48%、102.02%、99.05%,RSD依次為1.43%、1.98%、2.08%、1.32%、2.15%,表明該方法準確度良好。

2.7 校正因子重現性考察

2.7.1 高效液相色譜儀及色譜柱考察 試驗考察采用Agilent 1260、Waters e2690、ShimadzuLC-20A 3種高效液相色譜系統和SHIMADZU VP-ODS C18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm)、KROMASIL 100-5 C18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm)、Diamonsil C18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm) 3種色譜柱時的相對校正因子;相對校正因子=Ai×Cs/As×Ci,式中As為待測成分s的峰面積,Cs為質量濃度;Ai為內參物i的峰面積,Ci為質量濃度。分別計算綠原酸(A)、異槲皮苷(B)、紫云英苷(C)和槲皮素(D)與內參物蘆丁(S)的相對校正因子,結果見表3。結果表明,在不同的色譜柱及高效液相色譜儀下中具有較好的重現性,能夠用于上述5種成分的含量測定。

表3 不同儀器和不同色譜柱測得相對校正因子

2.7.2 待測組分色譜峰的定位 本研究采用各待測成分間的相對保留值(待測成分與內參物調整保留時間之比)作為定位標準,并在不同品牌高效液相色譜系統和不同色譜柱下對該參數進行考察,結果表明,不同儀器和色譜柱下各成分間的相對保留值波動較小,RSD在0.19%～0.71%,見表4。此結果說明,在對照品短缺的情況下,利用相對保留值進行色譜峰定位,可根據內參物的保留時間,通過結合各色譜峰的紫外吸收特征及相對保留值能夠較準確目標峰的峰位置。因此選用各成分相對保留值這一參數作為桑葉中上述5種目標色譜峰的定位指標比較合理。

表4 不同儀器和不同色譜柱下目標成分的相對保留值

2.8 外標法與QAMS法測定的結果比較

分別稱取廣西桑葉不同炮制品粉末(40目)約1.0g,精密稱定,按“2.5”項下制備供試品溶液,按照“2.3”項下測定,分別采用外標法(EMS)和QAMS法對不同炮制品中5種活性成分含量進行檢測,結果見表5和圖1。經t檢驗比較,結果顯示外標法實測含量值與QAMS計算的含量值無顯著性差異,由此說明一測多評法可用于桑葉飲片的多成分質量評價研究。

表5 外標法和QAMS測定廣西桑葉飲片中5種成分的含量 (n=3,mg·g-1)

3 討論

3.1 供試品溶液提取方法考察

試驗前期曾以桑葉粉末(40目)比較桑葉供試品溶液提取方法,結果顯示索氏回流提取法[21]中5種成分峰面積最小,效果最差;75%乙醇超聲提取兩次,提取液合并后用石油醚(60～90℃)萃取的方法[22]與25mL甲醇回流提取3次的方法[23]提取效果相當,含量均高于甲醇超聲提取兩次的方法[24],文獻方法[22]增加石油醚溶劑萃取的程序,不但增加了時間成本,而且耗費時間長,工藝繁瑣,因此從提取所需的時間、溶劑的成本、提取方法的簡便程度等方面考慮,最終本實驗選擇用25mL甲醇回流提取3次。在確定加熱回流提取方式后,筆者進一步對不同提取溶劑(50%、75%、100%甲醇)、提取溫度(65℃、70℃、80℃和90℃)、提取次數(1、2、3次)、溶劑用量(15、25、35mL)進行考察,最終確定本研究供試品溶液的制備方法。

3.2 桑葉5種活性成分含量研究

本研究首次采用高效液相色譜法,以蘆丁為參照物,建立綠原酸(A)、異槲皮苷(B)、紫云英苷(C)和槲皮素(D)的相對校正因子,將桑葉及其蜜制品建立的一測多評方法用于桑葉飲片多指標質量評價。用一測多評法和外標法測定上述5種活性成分含量,結果表明桑葉經炮制后綠原酸、蘆丁、紫云英苷和異槲皮苷的含量增加,且在用蜜量相同情況下,呈現出相同的變化趨勢,均為蜜烘桑葉>蜜炙桑葉>蜜蒸桑葉>炒桑葉>桑葉;槲皮素含量則降低,桑葉>炒桑葉>蜜烘桑葉>蜜炙桑葉>蜜蒸桑葉。其中綠原酸含量與國內學者報道[15]的桑葉經蜜炙后含量降低結果不一致,蘆丁、異槲皮苷含量與文獻[16]“炒桑葉>蜜桑葉>桑葉”的結果亦不盡相同,這可能是炒桑葉、蜜蒸桑葉、蜜桑葉、蜜烘桑葉均是經加熱蒸制、炒制或烘制而成,加熱破壞了藥物自身所含分解酶,起到殺酶保苷的作用,或者是由于經過加熱處理后藥物中所含成分在相同條件下被提取更加完全;蜜烘桑葉的含量最高,一方面可能是由于煉蜜對桑葉中綠原酸、蘆丁等黃酮苷類成分起到一定保護作用,同時烘制溫度相對穩定、均一,在一定程度上較好地保存藥物中有效成分。綠原酸和蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷的含量在各炮制品中以15%蜜烘桑葉的最高,分別是桑葉的1.96、1.76、2.52和2.79倍;進一步分析發現,在同一方法(蜜炙法或蜜烘法)下,樣品中蘆丁、綠原酸、紫云英苷和異槲皮苷的含量,隨著用蜜量的增加則出現了降低的現象,對槲皮素含量影響變化不明顯,這提示適量的蜂蜜可能有增加藥物溶出的作用,但用蜜量增加到一定程度后反而可能會影響藥物的成分溶出。這結果也再次印證了“貴在適中”的傳統炮制理論。

蜜制桑葉的炮制方法雖在全國中藥炮制規范及各省市地方炮制規范中均有收載,但其加蜜量、炮制火候程度卻不盡相同,這必將影響其臨床療效,因此十分有必要進一步對桑葉蜜制工藝進行深入研究。且大多數地方炮制規范均未建立桑葉飲片指標成分含量測定標準,不利于飲片質量控制。本研究在工藝規范的前提下,建立一測多評法同時測定桑葉中綠原酸、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素等5種有效成分含量測定方法,建立其限量要求,對于桑葉飲片的質量控制具有一定意義,因此建議在省市炮制規范中予以明確同時增加相應指標成分含量限度。

4 結論

本研究運用校正因子法從量上反映廣西桑葉不同炮制品之間主要有效成分(有機酸、黃酮)間的相互關系,該研究方法具有方法簡單、快速、準確,可用于桑葉多指標成分含量測定,可為更好地控制桑葉飲片的質量提供條件。加熱和蜜制均對廣西產桑葉化學成分產生了一定影響。