藏藥贊丹杰巴丸質量標準研究

趙雯瑋,達娃卓瑪*,王珊珊,楊麗瓊

(1.西藏自治區(qū)食品藥品檢驗研究院,西藏 拉薩 850000;2.國家藥品監(jiān)督管理局中藥(藏藥)質量控制重點實驗室,西藏 拉薩 850000)

贊丹杰巴丸又名八味檀香丸,為黃棕色至棕紅色水丸,最早記載于《四部醫(yī)典后續(xù)部》,為藏醫(yī)常用經典名方,常被用于治療肺結核等疾病。贊丹杰巴丸由檀香、紫檀、石灰華、紅花、丁香、葡萄干、甘草、力嘎都、索羅等八種藥材組成[1],具有清肺熱、化膿血等功效,臨床主要用于治療肺熱、肺膿腫、咯血、肺結核等疾病。該方劑藥材選擇和制備工藝根據藏醫(yī)藥學原理,選用珍稀、純天然藥材,采用現代科學技術與傳統(tǒng)藏藥加工技術相結合的方法精制而成。其中檀香用于治療寒氣凝滯、腹痛、胸痛;丁香用于治療食欲不振、嘔吐腹瀉、脾胃虛寒、心腹冷痛[2];力嘎都用于醫(yī)治氣喘、咳痰、肺熱咳嗽、咯血[2];紅花用于醫(yī)治癰腫;甘草用于醫(yī)治咳嗽、咳痰、倦怠、乏力、脾胃虛弱、四肢痙攣疼痛等癥[2];索羅用于醫(yī)治感冒發(fā)熱、肺熱咳嗽等[3]。

贊丹杰巴丸標準收載于《衛(wèi)生部頒藏藥標準》(2005版)當中,但該標準僅收載制法、性狀、檢查(丸劑)、功效等項。與藥材真?zhèn)巍①|量優(yōu)劣緊密相關的顯微鑒定、薄層色譜鑒別等項完全缺乏。贊丹杰巴丸作為臨床常用制劑,含有貴重藥材檀香、紫檀及礦物藥石灰華,建立有效可控的質量標準,對保證臨床用藥安全具有重要意義。

本研究建立贊丹杰巴丸中檀香、紫檀、石灰華、紅花、丁香的顯微定性鑒別;建立以紅花、丁香、甘草為主的薄層色譜(TLC)鑒別方法;同時開展石灰華化學反應鑒別及水分、重量差異等檢測,為有效控制藏藥贊丹杰巴丸質量提供技術支持。

1 材料與儀器

1.1 儀器

Scanner薄層點樣和成像系統(tǒng)(CAMAG公司);KQ-500DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);SENCOW201型恒溫水浴鍋(上海申生科技有限公司);BS-3000A電子天平(上海友聲衡器有限公司);AL104型電子天平(梅特勒-托利多有限公司);日本奧林巴斯顯微鏡(C5060-ADU);薄層層析硅膠板(青島海洋化工有限公司硅膠G板);雙槽層析缸(上海信誼儀器廠有限公司)。

1.2 試藥

紅花對照藥材(120907-201713)、丁香對照藥材(121039-201405)和甘草對照藥材(120904-202021)均采購于中國食品藥品鑒定研究院,贊丹杰巴丸處方由西藏神猴藥業(yè)有限責任公司提供,水為超純水,其他試劑均為分析純。

1.3 樣品信息

樣品由以下4個廠家提供,具體信息見表1。

表1 贊丹杰巴丸樣品信息

2 方法與結果

2.1 顯微鑒別

取本品粉末少許,置于載玻片上,加水合氯醛封片,置于顯微鏡下觀察,如圖1所示。

注:1.檀香纖維束;2.紫檀纖維束;3.石灰華碳酸鈣方晶;4.紅花分泌細胞;5.紅花花粉粒;6.丁香花粉粒。圖1 贊丹杰巴丸粉末顯微鑒別(10×40)

如圖1所示,贊丹杰巴丸顯微特征鏡檢時檢出率較高,且特征專屬性較強的部分。對4家企業(yè)提供的4批贊丹杰巴丸成藥樣品進行檢驗,顯微鑒別結果經與參考文獻[4-6]對比,發(fā)現贊丹杰巴丸共有鑒別特征有花粉粒呈圓形或類圓形,略帶淡黃色,外壁被刺包裹,直徑約60μm,含3個萌發(fā)孔,分泌細胞為長管狀,其內含黃棕色至紅棕色分泌物(紅花)[4];木纖維束呈淡黃色,其周圍含晶細胞壁厚,木化,層紋明顯,內含草酸鈣方晶,形成晶纖維,含晶細胞方形或長方形,壁厚,木化,層紋明顯,胞腔含草酸鈣方晶(檀香)[4];花粉粒呈無色或淡黃色,圓形或類圓形,直徑約至16μm(丁香)[7];碳酸鈣結晶呈短棒狀或柱狀,直徑2～4μm,長65μm(石灰華)[8];棕紅色木纖維成束或單個分散,部分纖維束周圍含有草酸鈣方晶,形成晶纖維,含晶細胞壁厚薄不均,且木化增厚,紋孔密集,纖維管胞呈紅棕色,壁厚,壁上有具緣紋孔(紫檀)[9]。

2.2 理化鑒別

取2g贊丹杰巴丸,研磨后加入0.5mol/L稀鹽酸試液20mL,充分震搖。過濾,取續(xù)濾液加入適量草酸銨溶液,分成兩份等量試液,分別加入一定量的乙酸或鹽酸溶液。結果如表2所示。

表2 贊丹杰巴丸理化鑒別結果

從上述結果可以看出,對贊丹杰巴丸中的主要藥物石灰華(CaCO3),采用理化鑒別的方式可對其進行快速有效的鑒別。

2.3 薄層色譜鑒別方法的建立及應用

2.3.1 紅花 (1)供試品及對照品溶液的制備。稱取3g贊丹杰巴丸,研磨成粉,加入80%丙酮溶液10mL超聲提取15min,靜置后取上清液作為供試品溶液。分別精密稱取0.5g紅花對照藥材和3g贊丹杰巴丸(去除紅花),加入80%丙酮溶液(料液比1∶10),超聲15min,放冷后取上清作為對照品溶液(紅花)和陰性樣品溶液。

(2)薄層色譜條件的篩選。展開劑的選擇:采用2020版《中華人民共和國藥典》[4]一部所收錄紅花項下薄層鑒別的方法條件。分別取樣1號供試品溶液兩份,陰性樣品溶液一份、紅花對照藥材溶液一份,點樣,以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(7∶2∶3∶0.4)為展開劑展開。結果顯示分離效果較差(其他成分干擾、拖尾)。故參考占堆等的方法[7],分別取等量1號供試品溶液、陰性樣品溶液、對照品溶液(紅花),進行點樣,相繼以乙酸乙酯-甲醇(6∶1)和乙酸乙酯-甲酸-水(9∶2∶2)為展開劑進行展開、取出、晾干后;結果顯示采用占堆等[7]的展開條件分離效果最佳(斑點清晰),故以占堆等[7]的展開條件作為贊丹杰巴丸薄層鑒別的最佳展開條件。

(3)點樣量考察。分別從1號供試品溶液、陰性樣品溶液、對照品溶液(紅花)各取1、4、7、10、15μL,點于同一硅膠G板上,按上述篩選出的最佳條件進行展開,觀察發(fā)現點樣量 10μL時斑點最清晰。故選擇10μL為最佳的點樣量。

(4)薄層板的選擇。按上述篩選出的最佳條件取供試品溶液、陰性樣品溶液、對照品溶液(紅花)分別點于硅膠G、硅膠H、硅膠GF254板上,以上述最佳展開條件進行展開后,分別考察其在紫外、熒光及自然光下的分離度、拖尾情況、成點性,結果發(fā)現在硅膠G 板上的分離效果最好。故選擇硅膠G板作為最佳的薄層板。

(5)贊丹杰巴丸中紅花樣品的鑒別。按上述篩選的最佳條件分別取等量樣1～4供試品溶液、陰性樣品溶液、對照品溶液(紅花)各兩份點樣,以上述最佳展開條件展開,結果表明所有樣品斑點清晰。紅花藥材溶液與4個待測樣品中的特征斑點均清晰可見,但在陰性樣品中沒有出現該特征斑點。詳見圖2。

注:1-2:陰性樣品;3-4:對照品(紅花);5-6:樣1;7-8:樣2;9-10:樣3;11-12:樣4展開劑:先用乙酸乙酯-甲醇(6∶1)為展開劑,展開,取出,揮干,再用乙酸乙酯-甲酸-水(9∶2∶2)展開(青島硅膠G板,12.6℃,17%)。圖2 贊丹杰巴丸紅花薄層色譜

2.3.2 丁香 (1)供試品及對照品溶液的制備。分別稱取2g贊丹杰巴丸、0.5g丁香藥材和2g贊丹杰巴丸(去除丁香),研磨后按1∶10的料液比加入乙醇,超聲20min,過濾,取濾液作為供試品溶液、對照品溶液(丁香)和陰性樣品溶液。

(2)薄層色譜條件的篩選。①展開劑及展開條件的選擇:分別取10μL陰性樣品溶液、對照品溶液(丁香)及1號供試品溶液點于同一硅膠G板上,以環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸(8∶2∶0.5)[7]為展開條件,分別橫向、豎向展開,取出揮干后以5%硫酸香草醛溶液顯色。發(fā)現橫向展開時干擾嚴重,分離效果較差;改為使用豎向展開時,分離效果佳,但斑點易出現弧形、彎曲狀。經改良后采用雙槽層析缸展開,先在層析缸一邊槽內放入展開劑,另一邊槽內放入2mL純化水,提前預飽和15min后再放入硅膠板,可有效避免彎曲現象。因此,采用預飽和的環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸(8∶2∶0.5)豎向展開為最佳展開條件。

②點樣量的考察:分別取陰性樣品溶液、對照品溶液(丁香)及1號供試品溶液1、3、5、7、9、11μL樣品點于同一硅膠G板上,按上述確定的最佳展開條件展開,揮干,以5%香草醛硫酸溶液顯色。發(fā)現點樣量5μL時的分離效果和成點性最佳。故選擇5μL為最佳點樣量。

③不同薄層板的考察:按上述篩選的最佳條件,分別對陰性樣品溶液、對照品溶液(丁香)及1號供試品溶液在硅膠G、硅膠H、硅膠GF254板上的分離情況進行考察。結果表明:硅膠G板的分離度最佳。

④不同顯色劑的選擇:按照上述篩選出的最佳條件進行點樣、展開后,分別考察硫酸乙醇、5%香草醛硫酸溶液、紫外分光光度計、碘粉的顯色情況,結果表明:用5%香草醛硫酸溶液時斑點顏色清晰。

(3)贊丹杰巴丸中丁香樣品的鑒別。分別取陰性樣品溶液、對照品溶液(丁香)、樣1-4供試品溶液按上述篩選出的最佳條件進行點樣、展開、顯色。結果表明,薄層色譜圖中待測斑點與其他成分分離效果佳良好,丁香的特征斑點在所有供試樣品中可清晰檢出,陰性樣品未檢出或不清晰,見圖3。

注:1-2:樣1;3-4:樣2;5-6:樣3;7-8:樣4;9-10:陰性樣品;11-12:丁香對照藥材展開劑:環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸(8∶2∶0.5)(青島硅膠G板,13.7℃,16%)。圖3 贊丹杰巴丸丁香薄層色譜

2.3.3 甘草 (1)供試品及對照品溶液的制備。分別精密稱取2g贊丹杰巴丸、0.5g甘草對照藥材和贊丹杰巴丸(去除甘草),研磨后按1∶10的料液比加入乙醇,超聲20min,取濾液濃縮至2mL,作為供試品溶液:對照品溶液(甘草)和陰性樣品溶液。

(2)薄層色譜條件的篩選。于同一硅膠G板上分別點上5μL的1號供試品溶液、對照品溶液(甘草)、陰性樣品溶液,以三氯甲烷-甲醇(9∶1)為展開系統(tǒng)展開,取出,揮干。置紫外燈(365nm)下檢視。發(fā)現分離效果較優(yōu)且斑點清晰;噴以10%硫酸乙醇,加熱至斑點清晰時,各斑點清晰度和成點性、分離度均不佳。因此選擇紫外燈(365nm)為贊丹杰巴丸最佳檢視條件。

(3)贊丹杰巴丸中甘草的薄層色譜鑒別。按上述篩選的最佳條件于同一硅膠板分別點上1～4號供試品溶液、對照品溶液(甘草)、陰性樣品供試品各兩份,以上述最佳展開條件展開,置紫外燈(365nm)下檢視,結果表明:在與對照品相對應的位置上,所有供試品均呈現界限清晰的斑點,且斑點的顏色是相同的。而在陰性樣品相對應的位置上,沒有斑點呈現。見圖4。

注:1-2:陰性對照;3-4:甘草對照藥材;5-6:樣1;7-8:樣2;9-10:樣3;11-12:樣4(青島硅膠G板,13.7℃,16%)。圖4 贊丹杰巴丸甘草薄層條件篩選

2.4 水分

根據《中華人民共和國藥典》2020版[4]第四部通則0832水分(第二法)測定,每批樣品各取3份測量水分,結果見表3,其水分平均含量為6.53%。

表3 贊丹杰巴丸水分測定結果 (%)

2.5 質量差異

根據《中華人民共和國藥典》2020版[4]第四部通則0108丸劑項下質量差異測定,取20244批號樣品以1丸為1份,取供試品10份,分別稱定質量,再計算質量差異,結果見表4,質量差異符合藥典規(guī)定。

表4 贊丹杰巴丸質量差異測定結果

3 討論

在本研究中,通過顯微、薄層色譜、化學鑒別、水分、質量差異五個方面對藏藥贊丹杰巴丸的質量標準進行補充與完善。

在顯微鑒別中,準確鑒定并描述贊丹杰巴丸中檀香纖維束、紫檀纖維束、石灰華碳酸鈣方晶、紅花分泌細胞、紅花花粉粒及丁香花粉粒的形態(tài)特征,這些特征在所有供檢樣品中均容易發(fā)現,特征清晰,鑒別度高,具有很強的鑒別意義。

在薄層色譜鑒定中,通過對薄層板、展開劑、點樣量、顯色劑等多重因素考察,篩選并建立了可顯著區(qū)別陰性對照品和供試品的紅花、丁香、甘草的薄層色譜鑒定方法。這些方法選用的試劑具有低毒、廉價、溶劑易配制等特點,且該方法操作簡便、結果直觀,具有很好專屬性,可以準確鑒別出是否含有紅花、丁香、甘草等主要藥材,可用于贊丹杰巴丸的真實性鑒定。

理化鑒別是生藥鑒定中重要組成部分,可以根據中藥中所含化學成分的理化性質,通過物理化學等分析方法,分析藥物中某一類指標性成分的有無、多少等,是快速鑒定中藥的真實性、純度和品質優(yōu)劣程度的一種鑒定方法。該方法具有操作簡便、快速等優(yōu)點。本文中,通過先后加入稀鹽酸、氯化銨、草酸、稀鹽酸等常規(guī)試劑的方法,快速鑒別了藏藥贊丹杰巴丸中的石灰華的主要成分CaCO3。

同時根據《中華人民共和國藥典》中檢查項下的相關規(guī)定,測得贊丹杰巴丸的水分含量為6.75%～7.53%,平均水分含量為6.53%,質量差異為0.86%～3.91%,符合《中華人民共和國藥典》規(guī)定的要求。

綜上,本研究建立贊丹杰巴丸處方中的主要藥材紅花、丁香、甘草、檀香、紫檀、石灰華、紅花、丁香等藥材的顯微鑒別、薄層色譜鑒別方法,并補充了水分、質量差異等檢測項,規(guī)范和完善了贊丹杰巴丸的質量標準體系,為贊丹杰巴丸的規(guī)范化生產提供了簡便可依的質量控制依據,為贊丹杰巴丸的臨床用藥的安全、穩(wěn)定、有效提供科學保障。本研究建立的贊丹杰巴丸質量標準方法專屬性強、重現性好,可用于其質量控制。