基于網絡藥理學和分子對接技術探討理金安肺湯治療肺小結節的作用機制

祝佳佳,許海柱

(1.上海市中西醫結合醫院,上海 200082;2.復旦大學附屬華東醫院,上海 200040)

肺小結節是臨床常見病,也是嚴重困擾患者的慢性疾病。醫學影像技術的快速發展使得許多肺結節患者在檢查時被發現,而結節直徑多在8mm以內,其中大多數結節仍處于良性階段[1],無明顯的手術指征。目前對于這類肺小結節患者,定期隨訪是主要的治療策略[2]。然而中醫藥多成分、多靶點、協同作用等優勢在控制肺小結節病灶、改善機體免疫力,緩解患者焦慮緊張情緒等方面都發揮重要作用,臨床中亦有許多報道[3-4]。

本研究團隊長期從事肺小結節的中醫藥防治工作,對肺小結節的病因病機特點等方面做了較多的研究[5-7],認為肺小結節的發生以氣陰不足為始動因素,痰凝血瘀是結節的主要表現形式。并根據肺小結節的臨床特點創立理金安肺湯,方中藥物主要為黃芪、北沙參、石見穿、黃芩、天葵子、紅豆杉、瓜蔞皮,地龍、桔梗等,以補肺養陰、化痰祛瘀、通絡散結為主要功效,在臨床取得較好的療效。現代研究也發現方中的較多藥物有提高機體免疫力、消炎、抗氧化、抗腫瘤等作用[8-12]。但目前理金安肺湯的具體作用機制尚不明確。

本研究通過網絡藥理學方法,篩選理金安肺湯的主要主要成分,預測藥物作用的關鍵靶點和相關通路,并利用分子對接技術驗證主要成分和關鍵靶點的結合性能,初步闡釋理金安肺湯治療肺小結節的分子作用機制,為后續深入基礎研究以及該方的現代化研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 有效成分的篩選及靶點預測

理金安肺湯主要由黃芪、北沙參、黃芩、石見穿、瓜蔞皮、海浮石、天葵子、地龍、桔梗、紅豆杉組成。分別檢索TCMSP數據庫[13](https://tcmspw.com/index.php)、BATMAN-TCM數據庫[14](http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/),選擇口服生物利用度OB≥30%,類藥性DL≥0.18作為納入標準,以此得到北沙參、黃芪、黃芩、石見穿、天葵子、桔梗的全部活性成分及相關靶點。在SymMap數據庫[15](http://www.symmap.org)、ETCM數據庫[16](http://www.tcmip.cn/ETCM/)檢索地龍、瓜蔞皮、海浮石的活性成分和相應靶點信息。通過查找文獻找到海浮石、紅豆杉中的主要化學成分,并利用PubChem數據庫[17](https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)核對成分結構進行化學名稱的規范,并獲取化合物的SMILES號。導入SwissTargetPrediction數據庫[18](http://www.swisstargetprediction.ch/),選擇預測值大于0的靶標作為靶點。經過整理去重,得到理金安肺湯活性化合物相關的靶蛋白信息,然后利用Uniprot數據庫[19](https://www.uniprot.org/)將上述靶點進行標準化處理,以物種為人類作為篩選條件,獲得理金安肺湯化合物的成分靶點。

1.2 肺小結節的靶點和交集靶點篩選

以“Pulmonary Nodule”為關鍵詞從DrugBank[20](https://go.drugbank.com/)、GeneCards[21](https://www.genecards.org/)及OMIM[22](https://omim.org/)數據庫中進行檢索,刪除重復靶點后獲得肺小結節的疾病靶點。將理金安肺湯和肺小結節的靶點上傳至Venny 2.1在線作圖工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/),繪制韋恩圖,將得到兩者的交集靶點作為理金安肺湯治療肺小結節的潛在作用靶點。

1.3 蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡構建及關鍵靶點篩選

將獲取的共同靶點導入STRING 11.0數據庫[23](https://string-db.org/)進行蛋白互作分析(PPI),物種選擇“人類”,選擇隱藏游離靶點,設置最低互作分值為0.4,構建PPI網絡。將獲得的PPI數據導入Cytoscape 3.7.2軟件中,以節點連接度(Degree)、緊密中心度(CC)和間距中心度(BC)作為參數標準選擇關鍵靶點,并構建PPI網絡圖。

1.4 GO富集分析和KEGG通路分析

利用Metascape數據庫(https://metascape.Org/gp/index.html)對關鍵靶點進行GO富集和KEGG富集分析。GO富集分析包括生物過程(BP)、細胞成分(CC)和分子功能(MF)[24]三個方面。KEGG通路富集分析能夠表明理金安肺湯治療PN的潛在作用機制。本研究選擇排名前15位的GO條目及排名前20的KEGG通路,以P<0.01為標準,利用微生信網站作圖處理。

1.5 構建理金安肺湯治療PN“活性成分-核心靶點-通路”網絡圖

利用GO和KEGG富集數據信息,通過 Cytoscape 3.7.2 軟件(https://cytoscape.org/)繪制理金安肺湯治療PN 的活性成分-核心靶點-通路圖[25]。

1.6 分子對接

分子對接是2個或多個分子之間通過幾何匹配和能量匹配而相互識別并構成穩定復合結構的過程[26]。將主要活性成分與PPI網絡中Degree值最大的靶點進行分子對接,以對接分數值(Affinity)對主要活性成分與關鍵靶點之間的結合活性進行評價[27]。利用PubChem數據庫下載主要化合物:槲皮素(Quercetin)、紫杉醇(Taxol)、花生四烯酸(Arachidonic acid)的SDF格式文件。從RCSB數據庫(https://www.rcsb.org/)下載蛋白GAPDH、AKT1、VEGFA、TNF、TP53、JUN、EGF的PDB格式結構。利用MOE2019[28]進行分子對接操作,Affinity<-4.25kcal·mol-1說明成分與靶點之間具有結合活性,Affinity<-5.0kcal·mol-1說明兩者結合活性較佳,Affinity<-7.0kcal·mol-1說明兩者對接活性強烈[29]。

2 結果

2.1 理金安肺湯活性成分及作用靶點信息收集

通過檢索發現符合標準的理金安肺湯活性成分共102個,其中黃芪20個、北沙參8個、黃芩36個、石見穿2個、瓜蔞皮11個、海浮石1個、天葵子7個、地龍4個、桔梗7個、紅豆杉6個。其中β-谷甾醇是北沙參、黃芩和石見穿共有成分,豆甾醇是北沙參和黃芩共有成分,槲皮素是北沙參、黃芪和石見穿共有成分,菠甾醇是瓜蔞皮和桔梗共有成分,金合歡素是黃芩和桔梗共有成分。利用SwissTargetPrediction數據庫將活性成分的預測靶點進一步規范化并去重,最終得到作用靶點基因621個。藥物-活性成分-作用靶點網絡圖見圖1,其中節點的Degree值越大,節點形狀越大。

注:圖中圓形表示中藥:北沙參(BSS)、地龍(DL)、瓜蔞皮(GLP)、海浮石(HFS)、黃芪(HQ)、黃芩(HQI)、桔梗(JGen)、石見穿(SJC)、天葵子(TKZ)、紅豆杉(HDS);菱形表示作用靶點;六邊形表示各中藥的活性成分;A1～C3表示中藥之間相同的活性成分。圖1 藥物-活性成分-作用靶點

2.2 疾病靶點的篩選和交集靶點篩選

通過檢索發現DrugBank數據庫中有疾病靶點73個,GeneCards數據庫中有2 863個,OMIM數據庫中有165個,去重后共得到疾病靶點3 048個。將數據導入Venny 2.1繪制韋恩圖,得到理金安肺湯治療肺小結節的潛在作用靶點共316個,見圖2。

圖2 中藥與疾病交集靶點

2.3 PPI網絡分析及關鍵靶點的篩選

將交集靶點導入STRING 11.0數據庫,分析后得到PPI網絡圖。將PPI數據導入Cytoscape 3.7.2軟件中,在網絡中有315個節點和7 040條邊。利用拓撲學分析方法,設置Degree≥45,CC≥0.504 8,BC≥0.000 3三個卡值條件,共篩選得到甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、血管內皮生長因子 A(VEGFA)、絲氨酸/蘇氨酸激酶 1(AKT1)、腫瘤壞死因子(TNF)、細胞腫瘤抗原p53(TP53)、轉錄因子AP-1(JUN)、表皮生長因子(EGF)、絲裂原激活的蛋白激酶3(MAPK3)、半胱天冬酶3(CASP3)等關鍵靶點120個,提示這些靶點可能是理金安肺湯治療肺小結節的關鍵作用靶點。靶點信息見表1。將關鍵靶點導入STRING11.0數據庫得到PPI網絡圖,見圖3。利用 Cytoscape 3.7.2軟件繪制關鍵靶點PPI網絡圖,在網絡中有120個節點和3 424條邊,見圖4。其中Degree越大,顏色越深、形狀越大。120個關鍵靶點對應的核心化合物共有19種,其中槲皮素(Quercetin)、紫杉醇(Taxol)、花生四烯酸(Arachidonic acid)是Degree值最高的3個。

表1 核心靶點信息

圖3 共同靶點PPI網絡

圖4 關鍵靶點PPI網絡

2.4 GO富集分析

利用Metascape在線數據庫對篩選到的120個關鍵靶點進行GO富集分析,前15個條目具體見圖5。作用靶點的生物過程(BP)富集條目為對細胞因子的反應、細胞遷移的正調控、對激素的反應、對無機物的反應、蛋白質磷酸化的正調控、細胞對脂質的反應、酶聯受體蛋白信號通路、造血或淋巴器官發育、對輻射的反應、細胞黏附的調節、細胞死亡的正調控、生殖結構發育、防御反應的監管、衰老、凋亡信號通路。作用靶點在細胞組成(CC)中的富集條目主要分布于膜筏、膜的側面、受體復合體、轉移酶復合物,轉移含磷基團、轉錄調節復合物、細胞質核周區、囊腔、早期內體、黏著斑、磷脂酰肌醇3-激酶復合物,IA類、蛋白酶抑制劑復合物、內吞囊泡、核膜、蛋白質DNA復合物、內質網內腔。作用靶點在分子功能(MF)中的主要富集條目為激酶結合、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、細胞因子受體結合、蛋白質結構域特異性結合、RNA聚合酶II特異性DNA結合轉錄因子結合、激酶調節活性、磷酸酶結合、泛素樣蛋白連接酶結合、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、胰島素受體底物結合、細胞因子受體活性、一氧化氮合酶調節活性、蛋白質同源二聚化活性、核心啟動子序列特異性DNA結合、腫瘤壞死因子受體超家族結合。

注:BP:生物過程;CC:細胞組分;MF:分子功能。圖5 核心靶點的GO富集分析

2.5 KEGG通路富集分析

本研究對120個關鍵靶點進行KEGG通路富集分析,分析對前20條富集通路具體見表2,并繪制KEGG富集柱狀氣泡圖,見圖6。由圖6可知,關鍵靶點主要富集于癌癥通路、脂質與動脈粥樣硬化、IL-17信號通路、膀胱癌、病毒致癌、JAK-STAT信號通路、孕酮介導的卵母細胞成熟、癌癥中的轉錄失調、糖尿病心肌病、阿米巴病、NF-κB信號通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用等。基于KEGG富集分析結果,運用Cytoscape 3.7.2 軟件建立“活性成分-靶點-通路”網絡,并將主要活性成分、關鍵靶點和相應通路連接起來。包括159個節點(19個活性成分節點、120個核心靶點節點和 20個通路節點)和716個邊,見圖7。

圖6 KEGG通路富集分析

注:倒三角表示通絡;圓形表示作用靶點;菱形表示藥物的活性成分。節點越大,表示Degree值越大。圖7 理金安肺湯活性成分核心靶點通路

2.6 分子對接驗證

選擇PPI網絡圖中Degree值排名前7的核心靶點:GAPDH、AKT1、VEGFA、TNF、TP53、JUN、EGF與理金安肺湯三種主要活性化合物槲皮素、紫杉醇、花生四烯酸進行對接。在結合模式中,“A1-C3”顯示活性化合物在相對應蛋白質上的整體結合位置;“a1-c3”顯示化合物和蛋白質氨基酸殘基之間氫鍵和疏水相互作用的二維平面圖?；钚曰衔锖完P鍵靶點最低結合能熱圖見圖8,在能熱圖中有組合21個,平均值為-5.868 3kcal·mol-1,其中對接得分最低的為TP53-槲皮素,分值為-4.938 6kcal·mol-1,對接得分最高的為TNF-紫杉醇,分值為-10.482 3kcal·mol-1,說明主要化合物與關鍵靶點之間均具有較強的結合活性。部分分子對接結果見圖9。結果提示理金安肺湯對肺小結節有較好的治療作用。

注:A:槲皮素;B:紫杉醇;C:花生四烯酸。圖8 理金安肺湯中活性成分與核心靶點分子對接結合能熱圖

注:3D結構中蛋白質骨架以管形呈現,各配體呈棒狀并用紫色著色。2D圖中綠色為疏水性殘基;紫色為極性殘基。A1:槲皮素與AKT1;A2:槲皮素與EGF;B1:紫杉醇與GAPDH;B2:紫杉醇與VEGFA;B3:紫杉醇與TNF;C1:花生四烯酸與TNF;C2:花生四烯酸與TP53;C3:花生四烯酸與JUN。圖9 分子對接構象

3 結論

網絡藥理學可以提供多靶點、多通路、多環節的新型模式,從系統生物網絡層次分析解析治療藥物主要成分與疾病的相關性,能夠為中醫藥作用機制研究和藥物配伍規律等提供新的研究方法[30]。分子對接可以研究分子之間的相互作用,能夠有效評估兩者之間結合能力強弱[31-32]。本研究通過網絡藥理學和分子對接技術對理金安肺湯中主要成分進行分析,結果可以為肺小結節深入作用機制探討提供參考依據。

3.1 理金安肺湯治療肺小結節主要成分分析

理金安肺湯種中10味藥共獲得102個成分,通過PPI網絡篩選最后取19個核心成分,其中槲皮素、紫杉醇、花生四烯酸的度值最高,與疾病靶點聯系密切。槲皮素主要來自于黃芪、北沙參、石見穿;紫杉醇來自紅豆杉;花生四烯酸來自地龍,可以推測這三種化合物可能為理金安肺湯發揮治療作用的主要成分。研究結果中發現槲皮素屬于黃酮類化合物,具有很強的生物活性,能夠起到抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤等作用[33]。紫杉醇除具有較強的抗腫瘤作用以外,還具有抗氧化、調節免疫、抗炎、抗纖維化等多種作用[34]?；ㄉ南┧崾且环N長鏈不飽和脂肪酸,具有抑制血小板聚集、抗炎、抗腫瘤、抗脂質氧化等獨特的生物活性[35]。肺小結節的發生多由慢性肺部炎癥引起,之后有發展成為肺部惡性病變的可能性。通過主要化合物成分的分析,提示理金安肺湯可能通過抗炎、抗氧化應激、抗腫瘤、調節免疫、抑制血小板聚集等作用來治療肺小結節。

3.2 理金安肺湯治療肺小結節關鍵靶點分析

本研究中共有316個主要成分與疾病的交集靶點,這些交集靶點中包括酶、受體、轉錄因子、信號分子等物質成分。從PPI網絡中發現120個關鍵靶點,其中GAPDH、AKT1、VEGFA、TNF、TP53、JUN、EGF等具有較高的度值,推測其可能為理金安肺湯治療肺小結節的高相關性靶點。GAPDH是糖酵解過程中的一個酶,參與DNA修復、細胞凋亡、腫瘤發生等過程,幾乎在所有組織中呈高水平恒定表達,在肺癌、腎癌、胃癌、肝癌等大部分腫瘤組織中表達上調。它通過促進磷酸甘油酸脫氫酶、細胞周期相關蛋白質表達和促進組蛋白甲基化,促進腫瘤細胞增殖,最終導致腫瘤的惡化[36]。AKT1是絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶的一個亞型,通過磷酸化作用激活或抑制其下游的靶蛋白,在炎性反應、細胞凋亡、腫瘤發生發展等發揮著重要作用[37]。研究也發現編碼的VEGFA蛋白容易在缺氧狀態下被表達,能夠促進新生血管和癌細胞等的形成,使腫瘤出現生長、轉移和存活等情況[38]。還有研究發現VEGF及其受體廣泛分布于肺部,其表達水平與呼吸系統疾病病變密切相關,且在肺炎、肺癌以及肺纖維化等組織中高表達,也與疾病預后相關,具有較高的臨床價值[39]。TNF主要由激活的巨噬細胞、免疫B細胞和T細胞等產生,在炎癥環境中含量豐富,被視為促炎因子。能參與腫瘤細胞凋亡、機體免疫應答和炎癥反應等,在關節炎、免疫系統疾病、腫瘤方面都有較好的治療意義[40]。TP53是癌癥中最常見的突變基因,能夠促進腫瘤細胞的增殖和侵襲,增強腫瘤細胞的代謝能力,在肺癌、胃癌、卵巢癌等多種癌癥出現明顯突變,尤其在小細胞肺腺癌方面突變率高達90%[41]。JUN是調節細胞增殖、分化和凋亡的關鍵轉錄因子[42],作為基因轉錄啟動的分子開關,受到氧化應激、感染等刺激后促進TNF-α、IL-2、IL-8等多種炎癥因子的表達,與腫瘤、哮喘、肺部炎癥、自身免疫性疾病的發生發展有關[43]。EGF是一種保護性生長因子,其缺乏或過度表達都會破壞細胞增殖凋亡的平衡而產生疾病。研究發現長期炎癥狀態可使其受體EGFR過表達,容易導致多種腫瘤的發生,在肺癌中有40%～80%患者會出現,同時也和疾病進展、預后以及耐藥性等有關[44]。關鍵靶點與疾病的炎癥狀態、免疫應答以及腫瘤侵襲等方面都有相關性,而且多數與肺部疾病直接相關,可以認為調控這些靶點功能是理金安肺湯發揮治療肺小結節作用的關鍵。

3.3 理金安肺湯治療肺小結節生物富集分析

本研究GO富集分析理金安肺湯治療肺小結節的120個關鍵靶點主要涉及細胞增殖、細胞凋亡、基因表達、生物合成調控等生物學過程。這些過程與促進炎癥修復、調節機體免疫、防止癌變等有關。KEGG通路富集分析發現理金安肺湯治療肺小結節主要涉及炎癥反應、免疫調節、細胞凋亡等多個復雜的生物學過程。途徑主要為炎癥和癌癥相關通路,例如炎癥相關通路包括IL-17信號通路、NF-κB信號通路、JAK-STAT信號通路、白細胞跨內皮遷移、細胞因子-細胞因子受體相互作用等;癌癥相關通路有癌癥通路、膀胱癌、病毒致癌、癌癥中的轉錄失調、細胞程序性壞死、多物種凋亡等。其中IL-17是一種重要的促炎癥細胞因子,可以誘導炎癥因子和趨化因子的釋放,刺激中性粒細胞增殖活化,參與肺炎、COPD、胰腺炎等多種炎癥性疾病的發生發展[45-46]。NF-κB可通過促進TNF-α、TGF-β、IL-6、IL-8等細胞因子的基因轉錄而介導肺部炎癥和肺纖維化[47]。細胞程序性壞死是由基因控制的細胞自主的有序性死亡方式,在肺部疾病的發病過程中起重要作用,參與調控肺癌、肺部炎癥等肺部疾病的發生發展[48]。這些信號通路提示理金安肺湯通過作用于潛在靶點,主要通過調節炎癥、腫瘤、免疫等多種信號通路,調節肺部炎癥因子的表達,控制炎癥反應,抑制炎癌轉變,從而控制肺小結節發展。

綜上,本研究基于網絡藥理學初步探索了理金安肺湯的主要活性成分槲皮素、紫杉醇、花生四烯酸等,可能通過GAPDH、AKT1、VEGFA、TNF等靶點,作用于癌癥、IL-17、NF-κB等信號通路治療肺小結節。并利用分子對接技術,驗證本方中主要活性成分能較好與關鍵靶點結合,為后續深入分子機制研究提供了基礎。由于網絡藥理學僅通過對數據庫中已知的中藥有效成分進行歸納總結,未考慮中藥配伍關系、中藥劑型差異等諸多影響因素,故下一步仍需通過基礎實驗進行再驗證,以便完善相關作用機制,推動中藥復方研發和應用進程。