UPLC-MS/MS法同時測定奶粉中11種B族維生素含量*

余清，蔡林雪，蘇曉明,3，吳少明，戴明*

（1.福建省產品質量檢驗研究院，福建 福州 350002；2.聯勤保障部隊第九〇〇醫院倉山院區，福建 福州 350002；3.閩南科技學院 生命科學與化學學院，福建 泉州 362332）

0 引言

B 族維生素是一類水溶性小分子化合物，普遍以輔酶的身份參與大量分解代謝和合成代謝酶反應，其在人體內含量很少，卻對人體內糖、脂肪和蛋白的代謝、確保機體細胞功能正常運行起到至關重要作用。每一種B族維生素的充足供應都是能量生產系統正常運作的必要條件，任何一種的不足都將限制產生能量的速度，從而可能造成嚴重的代謝和健康后果[1]，如VB12缺乏會影響嬰兒體重、身高和頭圍，煙酸缺乏會導致包括先天性心臟病等在內的多器官出生缺陷[2]。B族維生素大多不能在機體內合成，必須通過食物或外界環境攝取和補充[3]。隨著食物飲食結構的變化，人們從食物攝取的B族維生素日益減少，因此合成B族維生素常作為營養強化劑使用。目前，人體常用的B族維生素有11種，分別是維生素B1（硫銨素，Thiamine）、維生素B2（核黃素，Riboflavin）、維生素B3（煙酸，Niacin；煙酰胺，nicotinamide）、維生素B5（泛酸，Pantothenic acid）、維生素B 6（吡哆醛，pyridoxal；吡哆醇，pyridoxine；吡哆胺，pyridoxamine），維生素B7（生物素，Biotin）、維生素B9（葉酸，Folic acid）、維生素B12（鈷胺素，cobalamins）[2,4]。

高效液相色譜法和微生物分析法是目前國家標準及相關文獻[5-11]對B族維生素主要采用的檢測方法，盡管利用高效液相色譜法進行前處理時簡單便捷，然而測試過程中由于B族維生素的化學結構復雜，分離時需要使用離子對試劑使性質相近的目標物保留時間和洗脫順序發生變化，這使該方法與多種維生素同時測定的實際需求有一定差距。此外微生物法則存在步驟繁瑣、實驗周期長、環境要求高、重復性較差等缺點。研究表明[12-15]，質譜檢測器在測定維生素方面較于上述兩種方法具有更明顯的優勢，可提供可靠、精確的相對分子質量及結構信息，具有分辨率高、靈敏度好、特異性好、重復性佳、定性定量更準確等特點。本研究以奶粉基質為對象，建立了超高效液相色譜-串聯質譜測定奶粉中11種B族維生素的檢測方法，該檢測方法具有操作簡便、用樣量少、靈敏度高、重現性佳等特點，可有效滿足食品安全抽檢監測的要求。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、試劑與材料

1290 Infinity 超高效液相色譜串聯三重四極桿質譜儀（美國Agilent公司）；高速冷凍離心機（Aanti J-E，美國Beckman Coulter公司）；超純水純化系統（Milli-Q，美國Mffljpore公司）；分析天平（BT224S，德國賽多利斯公司）；超聲波振蕩器（DS-8510 DTH，上海生析）；渦旋混均器（XHB，江蘇康健）。

維生素B1（99%，LRAC2207）、吡哆胺二鹽酸鹽（99.5%，S2070100）標準品均購自美國Sigma；鹽酸吡哆醛（≥99.0%，B1940050）、吡哆醇（≥99.0%，LRAB7025）標準品均購自上海安譜公司；維生素B2（98.27%，G983985）、煙酸（99.9%，G137932）、煙酰胺（99.39%，G976982）、泛酸鈣（98.8%，N3670025）、生物素（99.0%，C10625000）、葉酸（99.5%，1-F-30C）、維生素B12（≥98.0%，MKCJ6408）標準品均購自德國Dr.Ehrenstorfer；甲酸、乙腈（色譜純，美國Merck公司）；試驗用超純水由Milli-Q超純水系統制備，電導率≥18.2 MΩ·cm。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

準確稱取1 g市售奶粉樣品于100 mL的容量瓶中，加入約80 mL的0.3%甲酸水溶解樣品并搖勻，于25 ℃水浴超聲30 min，加入2 mL的20%乙酸鋅沉淀蛋白，冷卻至室溫后用0.3%甲酸水溶液定容至刻度并搖勻，經濾紙過濾后于15000 r/min、20 ℃下離心5 min，過0.22 μm濾膜，待進樣。

1.2.2 標準溶液的配制

稱取適量的11種B族維生素標準品分別置于25 mL容量瓶中，加水定容，配制成濃度約為1 mg/mL的混合標準品儲備液，于4 ℃冰箱中冷存待用。準確吸取冷存的適量混合標準儲備液分別置于5個25 mL容量瓶中，加水稀釋定容至，并搖勻，得到濃度分別為10、20、50、100、200 ng/mL的11種B族維生素混標工作液。

1.2.3 儀器條件

⑴ 色譜條件

Waters UPLC HSS T3 柱（150 mm×2.1 mm，1.8μm）；柱溫：40 ℃；流動相：A相為0.3 %甲酸水溶液，B相為乙腈，流速0.3 mL/min。流動相梯度洗脫程序：0～1 min，1%B；1～4 min，1%B～30%B；4～5.5 min，30%B～95%B；5.5～6.5 min，95%B；6.50～6.51 min，95%B～1%B；6.51～8 min，1%B。進樣量：2.0 μL。

⑵ 質譜條件

離子源及離子化模式：電噴霧電離源、正離子模式、ESI+；質譜掃描模式：多反應監測模式（MRM）；毛細管電壓3.0 kV；干燥氣溫度160 ℃；干燥氣流速16 L/min；霧化氣壓力30 psi；鞘氣溫度350 ℃；鞘氣流速12L/min。11種B族維生素的質譜參數見表1。

表1 11種B族維生素的質譜參數

2 結果與分析

2.1 質譜和色譜條件的優化

2.1.1 質譜條件的優化

將1.2.2配制的混合標準儲備液用50%乙腈-水溶液稀釋，注入質譜進行采集分析，采用正離子模式掃描，根據各B族維生素化學結構、性質及質譜響應以確定11種B族維生素目標組分，及各組分相應的母離子、子離子，并優化碰撞能量CE、加速電壓、Fragmentor電壓等質譜參數。11種B族維生素的質譜參數詳見表1。

2.1.2 色譜條件的優化

B 族維生素是一類水溶性小分子化合物，我國食品安全國家標準和國內、外文獻[7-13]已證實C18柱、C8柱、HSS T3柱均可用于該類化合物的分離與檢測，因此本試驗分別比較BEH C18、BEH C8、HSS T3三種不同類型色譜柱的分離檢測效果。結果表明，在流動相為0.1%甲酸水-乙腈體系下，采用HSS T3色譜柱時，各目標物的色譜分離度及峰形效果最好，響應值也最高，而BEH C18與BEH C8兩種色譜柱對目標組分保留能力較差，詳見圖1。

圖1 B族維生素在3種不同色譜柱分離條件下的多反應監測色譜圖

2.2 前處理條件的優化

由于B族維生素目標組分采用正離子模式，流動相中可加入適量揮發性的甲酸使得目標組分離子化，從而提高目標物的離子化效率。本實驗分別對0.1%甲酸水-乙腈、0.2%甲酸水-乙腈、0.3%甲酸水-乙腈組成的流動相體系進行研究，結果表明（詳見圖2），隨著流動相中甲酸濃度的增大，各目標物的響應也隨之增大，但甲酸濃度過高會影響色譜柱的壽命和樣品穩定性。綜上所述，本試驗選擇HSS T3色譜柱，0.3%甲酸水/乙腈作為流動相分離待測組分。

圖2 B族維生素在3種不同流動相體系下的多反應監測色譜圖

鑒于B族維生素易溶于水以及堿性條件下不穩定的特性，本文分別比較了水、50%甲醇水、50%乙腈水、0.1%甲酸水溶液作為提取溶劑時對各目標物的影響，每種溶劑平行實驗3次，結果見表2。當采用0.1%甲酸水溶液提取時效率最高，11種目標物平均回收率介于75%～90%之間，而其余3種提取溶劑效果較差，尤其是VB1和吡哆胺的回收率均低于70%。

表2 B族維生素在不同提取溶劑下的平均回收率（n=3）

研究[14,15]發現適當提高提取液的酸度可以提高各物質的回收率。為篩選出最佳甲酸提取濃度，進一步對提取溶劑進行優化，本文進行進一步的試驗，選擇0.1%、0.2%、0.3%、0.4%甲酸水溶液四個濃度進行試驗，結果如圖3所示，11種目標物的初始回收率隨著甲酸濃度的增大而增大，采用濃度0.3%甲酸水溶液時，各物質平均回收率在91%～101%之間，明顯高于采用濃度為0.1%、0.2%甲酸水溶液時的回收率；而當甲酸水溶液濃度為0.4%，吡哆胺、葉酸、生物素回收率略高于0.3%甲酸水的提取效果，其余目標物的回收率與0.3%甲酸水溶液提取效果相當，綜合考慮選擇0.3%甲酸水溶液為本試驗的提取溶劑。

圖3 提取液中甲酸濃度對奶粉樣品中B族維生素回收率的影響

2.3 標準曲線的繪制

按1.2.2方法配制11種B族維生素混標溶液并對其進行分析，重復測定3次，以標準溶液質量濃度為橫坐標，目標組分定量離子的響應峰面積平均值為縱坐標，分別擬合標準曲線，計算得出11個B族維生素標準品的線性方程，詳見表3。結果表明，在10～200 ng/mL濃度范圍內11種B族維生素標準品線性相關性良好，相關系數（r2）均大于0.994。分別以3倍信噪比（S/N= 3) 對應濃度為方法檢出限（LOD）和10倍信噪比（S/N= 3) 對應濃度為方法定量限（LOQ），最終計算得出方法檢出限為5～20 μg/kg，方法定量限為16.7～66.7μg/kg。

表3 11個標準品的線性方程、相關系數、檢出限和定量限

2.4 加標回收率

本研究以市售奶粉樣品作為研究對象，考察方法的回收率及其相對標準偏差（RSD）。在1.00、2.00、5.00 mg/kg 3個添加水平下（每個水平重復5次），按照1.2所述的方法進行檢測。11種B族維生素的回收率在90.8%～103.8%之間，相對標準偏差RSD為1.6%～5.5%，詳見表4。

表4 11種B族維生素的加標回收率及其相對標準偏差RSD(n=5)

2.5 實際樣品檢測

本試驗對市場上銷量較高的10種市售品牌奶粉，按照上述優化后的方法對11種B族維生素的含量進行測定，并與產品標簽上的營養成分表明示值進行對比。奶粉樣品中B族維生素含量為標簽明示值的91%～103%，再次驗證了本方法的可行性。

3 結語

本文采用超高壓液相色譜-串聯質譜法，實現了奶粉中11種水溶性維生素的同時、快速定量檢測。樣品經0.3%甲酸水提取、20%乙酸鋅蛋白沉淀、Waters UPLC HSS T3 柱（150 mm×2.1 mm, 1.8μm）分離，電噴霧離子化，多反應監測（MRM）模式，外標法定量，在8 min完成11種B族維生素的測定。本方法具有操作簡便、用樣量少、分析時間短、靈敏度高、重現性佳等優勢，適用于奶粉中B族維生素常規檢測。通過測定10種市售品牌奶粉，測定結果為標簽明示值的91%～103%，再次驗證了該方法的可行性，因此該法可用于嬰兒奶粉中11 種B族維生素的同時測定。