水產暫養環境中副溶血性弧菌對重金屬與抗生素的抗性研究

＊謝家瑩 張紅敏,2,3 潘迎捷,2,3 趙勇,2,3 謝慶超,2,3*

（1.上海海洋大學食品學院 上海 201306 2.農業農村部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室（上海） 上海 201306 3.上海海洋大學食品質量安全檢測實驗室 上海 201306）

隨著消費者物質生活水平的不斷提高，水產品的鮮活程度在消費環節起到越來越重要的作用。因此提高水產品在暫養環節的成活率及品相是傳統批發市場、商超以及新型的網絡電商都要重點關注的。但是目前國家對水產養殖環境的水質標準發布于1989年，對于現在的鮮活水產保活手段無法做到有效防控[1-2]。副溶血性弧菌（Vibrio Parahaemolyticus）作為一種定殖腸道的病原菌，時常存在于蝦、蟹等海產品中，其所攜帶的耐藥基因隨可移動遺傳元件（Mobile Genetic Element，MGE）在人體腸道菌群中傳播所造成的危害引起高度重視[3]。現在對副溶血性弧菌的耐藥性研究發現，其具有的耐藥譜非常豐富，對多種常見漁用藥具有抗生素抗性，包括常規應用于水產動物養殖的例如喹諾酮類、四環素類漁用藥[4-5]，以及氯霉素等禁用藥。葉靈瓊等[6]對副溶血性弧菌進行耐藥研究中發現其在環境源和臨床源兩種不同來源的菌株中的耐藥譜很接近，有可能副溶血性弧菌在水產養殖環節產生了抗生素抗性并通過MGE傳播給了致病性的副溶血性弧菌。本研究將評估水產品暫養環境中的化學及生物危害物污染情況，并通過分析分離得到的副溶血型弧菌的16 rDNA分型，以期找到二者的關聯性以及相互影響規律。

1.材料與方法

(1)材料與試劑

①材料

暫養水樣取自上海市江陽水產市場和東方國際水產中心，共計取樣40份，命名為TWA1至TWA40。

②試劑

HPLC級濃硝酸與HPLC級乙酸（上海安譜實驗科技股份有限公司），TSB（3% NaCl）培養基與TCBS培養基（北京陸橋技術有限責任公司），HPLC級乙腈（德國Merck公司）。

(2)儀器與設備

iCAP Q電感耦合等離子體質譜儀（ICP-MS）和TSQ Quantum液相色譜質譜聯用儀（LC-MS-MS）（美國Thermo Scientific公司）；GG17旋轉蒸發儀（上海申生科技有限公司）；隔水式恒溫培養箱（上海一恒科技有限公司）；5331 PCR儀（德國Eppendorf公司）。

(3)方法

①暫養水中六種重金屬測定

參考《GB/T 5750.6—2006生活飲用水標準檢驗方法金屬指標》中水樣的檢測方法：水樣用濃硝酸配制成1%硝酸溶液后，由ICP-MS測定鉛、鎘、汞、砷、鈉、硼六種元素含量。

②暫養水中氨芐西林測定

A.暫養水中氨芐西林測定前處理

取水樣5mL置于50mL離心管中，加入20mL乙腈，使用均質器均質1min后再用離心機在10000r/min，4℃離心10min，把上層提取液移至另一離心管中。再用10mL乙腈重復提取一次，合并兩次的提取液，并向離心管中加入10mL乙腈飽和的正己烷，旋渦振蕩1min，棄掉上層。把下層提取液移至150mL雞心瓶中，在40℃旋轉蒸發近干。加入2mL超純水溶解殘渣，超聲混勻1min后，過0.22μm濾膜，供LC-MS-MS測定。

③暫養水中副溶血性弧菌測定、毒力基因及16S rDNA測序

參考《GB 4789.7—2013食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 副溶血性弧菌檢驗》中的方法，對樣品中副溶血性弧菌進行分離并富集培養，將分離得到的菌株進行甘油管保藏。使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取陽性樣品菌株DNA，并用PCR進行16S rDNA和毒力基因tdh、trh、tlh擴增。得到的PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，經過blast比對確認其是目的片段。

(4)統計分析

使用Oringin 9.1對數據進行分析做圖。

2.結果與分析

(1)暫養水中六種重金屬測定結果

從圖1可以看出，暫養水中鉛、鎘、汞、砷含量均低于標準限量值，而鈉的含量最高達到1224mg/mL，總計有27個（67.5%）樣品高于飲用水標準中200mg/mL的限量。而硼含量則有兩個超過標準中500ng/mL的限量值，其中TWA5達到850.6ng/mL，TWA7達到857.5ng/mL，濃度排第三的TWA31則只有372.7ng/mL，說明前兩個硼含量遠高于其他樣品。

圖1 暫養水中六種重金屬濃度(a)Pb, Cd, Hg, As; (b)Na, BFig.1 Concentration of six heavy metals in temporary water

(2)暫養水中氨芐西林測定結果

①質譜條件優化及離子對選擇

在多反應監測模式（SRM）下優化各項質譜參數，提高其響應值（見圖2）。其中定性離子對（m/z）為：350/192；定量離子對（m/z）為：350/114，350/118，350/173.5。

圖2 氨芐西林標準品離子流圖Fig.2 Ampicillin standard ion chromatogram

②暫養水上機檢測結果

檢測結果表明：40個暫養水樣品中只有一個樣品TWA18（鯽魚暫養水）檢出氨芐西林，濃度為0.323 ng/mL，見圖3。

圖3 樣品TWA18色譜信息(a)chromatogram; (b)standard curveFig.3 Chromatographic information of sample TWA18

(3)暫養水中副溶血性弧菌污染情況測定

經生化及分子生物學鑒定，40個樣品中有8個樣品副溶血性弧菌陽性。共涉及四種水產品的8份暫養水，檢出率為20%。其中：2份烏鱧暫養水檢出副溶血性弧菌，占烏鱧暫養水的100%；3份鯽魚暫養水檢出副溶血性弧菌，占鯽魚暫養水的37.5%；2份大菱鲆暫養水檢出副溶血性弧菌，占大菱鲆暫養水的25%；1份鱖魚暫養水檢出副溶血性弧菌，占鱖魚暫養水的25%。

3.討論

從暫養水重金屬與抗生素本底調查來看：首先，鉛、鎘、汞、砷含量符合《GB 11607—1989漁業水質標準》[7]中的規定。鈉含量偏高則是由于商戶會向暫養水中施加海水晶以起到凈水保活的目的，但鈉含量過高（本研究中最高是飲用水標準的6.12倍）對魚體本身有多大影響，以及對魚體內微生物種群結構的影響，進而是否會影響到抗性基因的轉移傳播，值得進一步進行研究；其次，暫養水中硼含量略高于飲用水中限量值，可能是有商戶向暫養水中添加硼砂以起到殺菌、清潔的作用[8]，中國《食品衛生法》[9]和《食品添加劑衛生管理辦法》[10]，明令禁止將硼砂作為食品添加劑使用，然而漁業水質國標中沒有做相關規定，這給了一些商販鉆法律漏洞的可乘之機，而且此國標距今已30年整，有一定修訂的必要；最后，氨芐西林檢測結果中有一個樣品檢出氨芐西林說明人用抗生素有向水產養殖行業轉移的趨勢，但目前還不是普遍現象。封永輝等[11]對漁用藥物使用中的亂象做了調研，也發現有的漁藥或獸藥企業直接將人用抗生素作為新品漁藥使用的現象。而如果水產養殖行業長期使用人用抗生素進而導致進化出超級耐藥細菌并通過某種途徑感染人類，會對人類健康造成非常大的威脅[11]。