加工及干燥方式對短小蛇根草活性成分的影響

肖程雨，李朋洋，郝小龍，開國銀

（1. 浙江農林大學 食品與健康學院，浙江 杭州 311300；2. 浙江中醫藥大學 藥學院，浙江 杭州 311300）

短小蛇根草Ophiorrhizapumila為茜草科Rubiaceae 蛇根草屬Ophiorrhiza植物，主要分布在福建、臺灣、海南、廣東、廣西等省，全草可入藥，具有清熱解毒的功效，民間使用廣泛[1-2]。喜樹堿是短小蛇根草中重要的一類活性成分，具有顯著的抗腫瘤活性，近幾十年來以其為前體開發的抗癌藥物眾多，如伊立替康、拓撲替康等[3-5]。藥用植物短小蛇根草，對生長環境條件要求嚴苛，常為森林被破壞后第一批被消滅的植物，脆弱的野生資源導致其無法作為喜樹堿的替代藥源植物進行利用[6]。近年來，隨著短小蛇根草栽培技術研究的逐步展開，水培型短小蛇根草可以很好地適應溫室生長，并且生長速度快、喜樹堿產量高，這使得短小蛇根草在未來有可能成為重要的喜樹堿藥源補充植物[7-10]。

《本草蒙筌》中記載：“凡藥藏貯，宜常提防。倘陰干、暴干、烘干未盡其濕，則蛀蝕霉垢朽爛不免為殃”[11]。干燥是決定藥材質量的一個關鍵環節，不同的干燥方法對藥材的生產效率、活性成分含量都有顯著影響[12]。有研究指出，喜樹堿類成分在自然光和高溫條件下具有不穩定性，在喜樹果的干燥工藝研究上發現，相較于陰干或低溫干燥，暴曬和高溫都會導致喜樹果中喜樹堿含量降低[13-14]。由此可見，干燥方式對喜樹堿類植物有效成分含量的影響較大，適宜的加工及干燥方法將有助于短小蛇根草中喜樹堿類成分的保留。另有研究發現，蛇根草屬植物中的化學成分復雜，除喜樹堿類化合物外，還包括黃酮類化合物、多糖類化合物等，藥理研究也表明黃酮類化合物及多糖類化合物具有廣泛的藥理活性[15]。

為更好地推進短小蛇根草在喜樹堿產業上的開發與應用，本研究以活性成分含量為指標對短小蛇根草的加工方法（殺青）及干燥方式（曬干、陰干、烘干、真空冷凍干燥、真空干燥）進行了考察，探究加工及干燥方式對短小蛇根草品質的影響，為短小蛇根草未來的產業化利用提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 本實驗所采用的短小蛇根草全草采收于福建省建甌市。本材料為野生品，生長于深山林下，2022年9 月中旬采收，正值果期，全草長在10 ～ 15 cm，生長狀態相似。

1.1.2 實驗儀器 高效液相色譜儀（Agilent 1260 Infinity II，安捷倫）；高速中藥粉碎機（LG-30，百信）；超聲波清洗器（DS-5510DTH，工作頻率40 kHz，上超）；分析天平（ME204，瑞士梅特勒多利多公司）；真空冷凍干燥機（SCIENTZ-50FG/C，寧波新芝）；真空干燥機（HWZ-5B，天水華圓制藥設備科技有限公司）；電熱鼓風干燥箱（9030A，南京科迪信機械設備有限公司）；多功能酶標儀（Synergy H1，美國伯騰）。

1.1.3 實驗試劑 甲醇（分析純，廣東光華科技股份有限公司）；甲醇（色譜純，美國TEDIA 試劑公司）；乙腈（色譜純，美國TEDIA 試劑公司）；喜樹堿標準品（純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司）；蘆丁標準品（純度≥98.00%，上海源葉生物科技有限公司）；D（+）-無水葡萄糖（純度≥99.00%，上海源葉生物科技有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 將當日采收的新鮮短小蛇根草均分為30 份，每份50 g，分別采用殺青后干燥和直接干燥的加工方法；干燥方式采用曬干、陰干、烘干、真空冷凍干燥、真空干燥5 種，每組處理做3 次重復。殺青處理及5 種干燥方式的具體參數如下：殺青處理[16]采用煮青的方式；曬干方式，將需要曬干的樣品在晴朗的天氣下曬至恒質量，溫度變化范圍為27 ～ 30 ℃，空氣相對濕度變化范圍為84% ～ 89%，每6 h 測定一次質量；陰干方式，將需要陰干的樣品放置在通風、避光的室內進行干燥，室溫恒定為25 ℃，每24 h 測定一次質量；烘干方式，將需要烘干的樣品置于電熱鼓風干燥箱中，60 ℃烘干，每0.5 h 測定一次質量；冷凍干燥方式，將需要冷凍干燥的樣品置于真空冷凍干燥機樣品室中，在冷阱溫度－60℃、真空度200 Pa 條件下凍干，每2 h 測定一次質量；真空干燥方式，將需要真空干燥的樣品置于真空干燥箱中，在干燥溫度25 ℃、真空度0.01 Mpa 條件下真空干燥，每1 h 測定一次質量。每組處理干燥至恒質量后，進行復水性測定、含水量測定，樣品粉碎后混勻過60 目篩用于活性成分的提取及檢測。

喜樹堿標準溶液的制備：準確稱取10.0 mg 喜樹堿，用少量DMSO 溶解后，用甲醇定容至20 mL，配制成0.5 mg·mL-1的喜樹堿標準溶液。分別吸取0、0.2、0.4、1 .0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL 喜樹堿標準溶液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，用于標準曲線的繪制。短小蛇根草喜樹堿供試液的制備：準確稱取各樣品50 mg于離心管中，加入1 mL 甲醇，超聲（功率40 kHz）提取60 min，12 000 r·min-1離心5 min，取上清液過0.22 μm濾膜得短小蛇根草喜樹堿提取液。

蘆丁標準溶液的制備：準確稱取20.0 mg 蘆丁，用60%乙醇溶解后定容至20 mL，配置成1 mg·mL-1蘆丁標準溶液。分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mL 蘆丁標準溶液于10 mL 比色管中，用60%乙醇溶液補至5.0 mL，加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻放置6 min，加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻后放置6 min，加入4 mL 4%氫氧化鈉溶液，用60%乙醇定容至刻度，搖勻靜置15 min，以試劑為空白參比液，在510 波長處測定吸光度，繪制蘆丁的標準曲線。短小蛇根草總黃酮供試液的制備：準確稱取各樣品100 mg 于離心管中，加入1 mL 80%的甲醇，避光超聲（功率40 kHz）提取60 min，8 000 r·min-1離心30 min，取上清液得短小蛇根草總黃酮提取液。

葡萄糖標準溶液的制備：準確稱取20.0 mg 葡萄糖，用水溶解后定容至20 mL，配置成1 mg·mL-1葡萄糖標準溶液。分別吸取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 的葡萄糖標準溶液于10 mL 容量瓶中，用超純水定容至刻度，搖勻，備用，各取1 mL 于試管中，加入5%苯酚溶液0.50 mL，搖勻，加入濃硫酸5 mL，振蕩混勻3 min后，立即置于水浴鍋內沸水浴2 min，取出冷卻至室溫，以試劑為空白參比液，在490 nm 波長處測定吸光度，繪制葡萄糖標準曲線。短小蛇根草粗多糖供試液的制備：準確稱取各樣品100 mg 于離心管中，加入2 mL 超純水搖晃混勻，超聲（功率40 kHz）提取60 min，8 000 r·min-1離心10 min，取上清液，加入8 mL 95%乙醇，4 ℃醇沉過夜，8 000 r·min-1離心30 min，棄上清，沉淀加入1 mL 超純水溶解得短小蛇根草粗多糖溶液，取0.1 mL于10 mL 容量瓶中，用超純水定容至10 mL 用于粗多糖含量測定。

1.2.2 干基含水率的測定 干基含水率（Mt）的計算公式[17]為：

式中，mt為物料在t時刻的質量，單位為g；mg為物料干物質的質量，單位為g。

1.2.3 復水性的測定 取干燥后的短小蛇根草樣品，加入60 ℃超純水200 mL，恒溫浸泡30 min，取出瀝水5 min后稱質量，復水性（X）的計算公式[18]為：

式中，N0為物料的干質量，單位為g；N為物料復水后的質量，單位為g。

1.2.4 含水率的測定 根據GB/T 5009.3—2016 食品中水分含量的測定標準，含水率（Y）的計算公式為：

式中，M為容器和樣品的質量，單位為g；M1為恒質量后容器和干燥樣品的質量，單位為g；M0為容器的質量，單位為g。

1.2.5 喜樹堿含量的測定 采用高效液相色譜法測定短小蛇根草中的喜樹堿含量。色譜條件為：Agilent ZORBAX SB-C18 反相硅膠柱色譜柱（4.6×250 mm，5 μm）；流動性為乙腈（A）：1‰甲酸水（B），梯度洗脫（0 ～ 25 min，30% A，70% B ；25 ～ 29 min，30% ～ 90% A，70% ～ 10% B；29 ～ 30 min，90% ～ 30% A，10%～ 70% B；30 ～ 31 min，30% A，70% B）；體積流量為1.0 mL·min-1，進樣量10 μL，柱溫30 ℃，檢測波長210 nm。以液相檢測得到的峰面積值為縱坐標，喜樹堿濃度為橫坐標建立標準曲線，y= 59 714.122 18x+439.751 06（R2= 0.999 45），檢測范圍（0.01 ～ 0.40 mg·mL-1）。取0.2 mg·mL-1喜樹堿標準溶液，在上述色譜條件下，連續進樣6 次，得喜樹堿峰面積RSD（n= 6）為0.25%，表明該方法實驗精密度良好；取曬干短小蛇根草粉末6份，按照1.2.1 短小蛇根草喜樹堿供試液的制備方法制備并檢測，得到短小蛇根草喜樹堿峰面積RSD（n=6）為2.35%，表明該方法實驗重復性良好；取0.2 mg·mL-1的喜樹堿標準溶液，在上述色譜條件下，分別于0、2、4、8、12、24 h 時進樣，得喜樹堿峰面積RSD（n=6）為0.65%，表明該方法實驗穩定性良好。取上述曬干短小蛇根草喜樹堿提取液，分別加入等量0.2 mg·mL-1喜樹堿標準溶液，測得喜樹堿的平均回收率為100.45%，表明該方法加樣回收率良好。取一定量的短小蛇根草喜樹堿提取液進行液相檢測，將得到的峰面積代入標準曲線中，計算樣品中喜樹堿的含量。

1.2.6 總黃酮含量的測定 采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法測定短小蛇根草中的總黃酮含量[19]。以蘆丁濃度為橫坐標，510 nm 波長處測得吸光度值為縱坐標建立標準曲線：y= 739.42x－1.4813,（R2= 0.999 6），檢測范圍在（0.02 ～0.20 mg·mL-1）。取一定量的短小蛇根草總黃酮提取液，按同樣方法處理并測定其吸光度，將得到的吸光度代入標準曲線中，計算樣品中的總黃酮含量，以蘆丁當量表示。

1.2.7 粗多糖含量測定 采用苯酚-硫酸法測定短小蛇根草中的粗多糖含量[20]。以葡萄糖濃度為橫坐標，490 nm波長處測得吸光度值為縱坐標建立標準曲線：y= 8.807 1x+ 0.000 5（R2= 0.999 8），檢測范圍在（0.05 ～ 0.50 mg·mL-1）。取一定量的短小蛇根草粗多糖提取液，按同樣方法處理并測定其吸光度，將得到的吸光度代入標準曲線中，計算樣品中的粗多糖含量，以葡萄糖當量表示。

2 結果與分析

2.1 不同干燥方式下短小蛇根草的干燥曲線及不同干燥品的復水性

如圖1 所示，不同干燥方式下，短小蛇根草的干燥過程均呈現為降速干燥，其中以烘干干燥速率最快。曬干、陰干、烘干、冷凍干燥、真空干燥至恒質量所需時間分別為12.0、96.0、3.5、13.0、10.0 h，各干燥品的含水率分別為6.3%、11.3%、7.0%、5.7%、7.7%，均符合安全儲存水分含量。短小蛇根草長期生長在潮濕的環境中，植物體含水量較高（約84%），但總體來看，除陰干外，其余干燥方式干燥所需時間均較短，表明在生產過程中，應以保留活性成分的多少來決定選擇何種干燥方式。不同干燥品復水性的結果如圖2所示，陰干組與真空冷凍干燥組在復水性上存在顯著性差異（P＜0.05），原因為冷凍干燥過程水分以冰晶升華的方式揮發，致使樣品疏松多孔，宜于吸水，而陰干過程植物體表面因脫水而緩慢收縮，導致組織結構緊密，不利于水分的滲入。

圖1 不同干燥方式下短小蛇根草的干燥曲線Fig. 1 Moisture content of O. pumila treated by different drying methods

圖2 不同干燥方式下短小蛇根草復水性測定Fig. 2 Rehydration capacity of O. pumila treated by different drying methods

2.2 殺青及不同干燥方式對短小蛇根草中喜樹堿含量的影響

殺青及不同干燥方式對短小蛇根草中喜樹堿含量的影響如圖3 所示。由圖3 可知，在5 種干燥方式中，曬干組喜樹堿含量最高（1.90 mg·g-1），并且顯著高于其他處理組（P＜0.05）；陰干、烘干、冷凍干燥組喜樹堿含量次之（1.78 mg·g-1），且三者之間無顯著差異（P＞0.05）；真空干燥組喜樹堿含量最低（1.63 mg·g-1），并顯著低于其他處理組（P＜0.05）。可以看出，暴曬對短小蛇根草喜樹堿含量的影響小于其他干燥處理，而真空干燥處理對其喜樹堿含量的影響要比干燥溫度及干燥時間更大。殺青處理后不同干燥方式下（曬干、陰干、烘干、冷凍干燥、真空干燥）短小蛇根草喜樹堿含量比不殺青的不同干燥方式處理的喜樹堿含量分別降低了45.17%、0.59%、22.57%、8.62%、15.72%，除陰干組外，其余各組喜樹堿含量均顯著降低（P＜0.05），其中以殺青-曬干組降低幅度最大，在所有處理組中含量最低（1.04 mg·g-1），這與未殺青處理組結果截然相反，表明殺青處理對短小蛇根草中喜樹堿類成分在自然光下的穩定性產生了影響，殺青后喜樹堿類成分在自然光下的穩定性變低，這與陰干組殺青處理前后喜樹堿含量變化不顯著的結果相吻合。以上結果表明，在5 種干燥方式中，曬干是短小蛇根草保留喜樹堿的最佳干燥方式；殺青處理對短小蛇根草喜樹堿類成分影響較大，若干燥前采取殺青處理，以陰干作為短小蛇根草殺青后的最佳干燥方式。

圖3 殺青及不同干燥方式對短小蛇根草中喜樹堿含量的影響Fig. 3 Effects of de-enzyme and different drying methods on camptothecin content

2.3 殺青及不同干燥方式對短小蛇根草中總黃酮含量的影響

殺青及不同干燥方式對短小蛇根草中總黃酮含量的影響如圖4 所示。由圖4 可知，在5 種干燥方式中，真空干燥組短小蛇根草中總黃酮含量最高 （1.38 mg·g-1），并且顯著高于其他處理組（P＜0.05）；烘干組（0.87 mg·g-1）和陰干組（1.02 mg·g-1）短小蛇根草中總黃酮含量顯著低于其他各組（P＜0.05）。說明干燥溫度和干燥時間對短小蛇根草中黃酮類化合物的含量影響較大，以高溫的影響最大。殺青處理后，各干燥組短小蛇根草中總黃酮含量均顯著提高（P＜0.05），曬干、陰干、烘干、冷凍干燥、真空干燥處理短小蛇根草中黃酮類化合物的含量分別比不殺青干燥處理提高了6.89%、24.67%、29.36%、18.24%、7.87%，其中殺青-烘干組提高幅度最大，但總含量仍為各組中最低（1.23 mg·g-1），說明殺青后高溫仍是影響短小蛇根草總黃酮含量的主要因素，這與殺青-冷凍干燥組總黃酮含量最高（1.63 mg·g-1）的結果相一致。殺青處理以快速高溫的方式實現了“殺酶保苷”的效果，減少了黃酮類成分在后續加工過程中的分解。以上結果表明，殺青后冷凍干燥是保留短小蛇根草總黃酮的最佳加工及干燥方式。

圖4 殺青及不同干燥方式對短小蛇根草中總黃酮含量的影響Fig. 4 Effects of de-enzyme and different drying methods on total flavonoids content

2.4 殺青及不同干燥方式對短小蛇根草中粗多糖含量的影響

殺青及干燥方式對短小蛇根草中粗多糖含量的影響如圖5 所示。由圖5 可知，在5 種干燥方式中，冷凍干燥組短小蛇根草中粗多糖含量最高（50.01 mg·g-1），且顯著高于其他各干燥處理組（P＜0.05）；陰干組（46.17 mg·g-1）次之，顯著高于曬干組（41.95 mg·g-1）、烘干組（41.12 mg·g-1）和真空干燥（P＜0.05）；真空干燥組含量最低（37.89 mg·g-1），且顯著低于其他各干燥處理組（P＜0.05）。以上結果表明，高溫和真空處理均會影響短小蛇根草中粗多糖的含量，低溫有助于短小蛇根草中粗多糖的保留。殺青處理后，不同干燥方式下（曬干、陰干、烘干、冷凍干燥、真空干燥）短小蛇根草中粗多糖含量分別降低了26.68%、6.86%、0.03%、8.14%、15.65%，以曬干組降低幅度最大，在各組中含量最低（30.76 mg·g-1），烘干組殺青前后變化不顯著（P＞0.05）。各干燥處理結果表明，溫度是影響干燥過程中短小蛇根草粗多糖含量變化的主要原因，然而與烘干組相比，殺青-曬干組粗多糖含量降低幅度更大，這與喜樹堿在殺青-曬干組的結果相一致，表明短小蛇根草中喜樹堿與粗多糖在殺青過程中的變化可能存在著相關性。綜上所述，低溫干燥是提高短小蛇根草中粗多糖含量的最佳干燥方式。

圖5 殺青及干燥方式對短小蛇根草中粗多糖含量的影響Fig. 5 Effects of de-enzyme and different drying methods on crude polysaccharides content

3 結論與討論

短小蛇根草是一種藥用價值極高的珍稀民間草藥，在福建省建甌地區會使用其曬干的全草進行煮制后用于治療發熱咳嗽。現代藥理研究也表明，短小蛇根草乙醇提取物在抑制肝癌細胞的增殖、遷移，抑制淋巴瘤細胞的增殖、促進淋巴瘤細胞的凋亡方面有著顯著作用[21-22]。作為擁有豐富藥用歷史經驗的國家，短小蛇根草資源的開發不僅在喜樹堿產業上具有重要的意義，在活性成分的挖掘、新藥的研發方面也存在著巨大的價值。

隨著短小蛇根草栽培技術的不斷完善，短小蛇根草作為抗癌藥物喜樹堿的補充藥源植物，將在喜樹堿產業上得到充足的發展。藥用植物采收后的加工及干燥在其生產過程中發揮著重要作用，不同的加工方式及干燥方法對藥材的生產效率、活性成分含量都有顯著的影響。基于本實驗研究結果發現，短小蛇根草具有易于干燥的特性，這對于產地加工是較為有利的。喜樹堿作為短小蛇根草中重要的活性成分，具有不穩定性，有研究表明，閉環（E 環）喜樹堿具有對自然光穩定、熱不穩定、紫外光不穩定的特性[13]，并且閉環（E 環）的內酯結構是決定喜樹堿抗癌活性的關鍵。通過比較不同干燥方式下短小蛇根草中喜樹堿含量的差異，發現曬干是最適合保留喜樹堿的干燥方式（1.90 mg·g-1），表明短小蛇根草中的喜樹堿類成分對自然光的穩定性較好，這與喜樹Camptothecaacuminata果暴曬后的結果不同，可能是由于短小蛇根草中的喜樹堿類成分與喜樹果中的喜樹堿類成分存在差異，如查包甙僅存在于短小蛇根草中而不存在于喜樹果中。殺青處理會導致除陰干外其余各組干燥方式下的喜樹堿含量顯著降低（P＜0.05），其中以殺青-曬干組喜樹堿含量的降低幅度最大（45.17%），在所有處理組中含量最低（1.04 mg·g-1），這與曬干組的結果相反，說明殺青處理可能導致了短小蛇根草喜樹堿類成分發生了改變，對自然光的穩定性變低，這也與陰干組殺青前后喜樹堿含量變化不顯著相一致，若干燥前需采取殺青處理，以陰干作為短小蛇根草殺青后的最佳干燥方式（1.76 mg·g-1）。

短小蛇根草中總黃酮含量在烘干組（0.87 mg·g-1）、陰干組（1.02 mg·g-1）中的含量顯著低于其他各組，表明干燥溫度和干燥時間是影響短小蛇根草總黃酮含量變化的主要因素，這與姜珊等的研究結果相一致，干燥溫度越高、干燥時間越長，黃酮類成分的損失越大[23]。在中藥類及茶飲類領域，殺青是比較常用的一種加工方法，在亳菊Dendranthemamorifolium的加工干燥過程中，殺青后烘干會比直接烘干苯丙素類和黃酮類成分含量更高[24]；青錢柳Cyclocaryapaliurus茶在微波殺青后可顯著提高多糖和黃酮等活性成分的含量[25]。同樣，殺青處理也可顯著提高不同干燥方式下短小蛇根草中總黃酮的含量（P＜0.05），其中以殺青-冷凍干燥組總黃酮含量最高（1.63 mg·g-1），是保留短小蛇根草總黃酮含量的最佳加工及干燥方式。

短小蛇根草粗多糖在冷凍干燥組（50.01 mg·g-1）、陰干組（46.17 mg·g-1）中的含量顯著高于曬干組（41.95 mg·g-1）、烘干組（41.12 mg·g-1）和真空干燥組（37.89 mg·g-1）（P＜0.05），表明溫度是導致短小蛇根草中粗多糖含量變化的主要原因，這與川芎Ligusticumsinense多糖及火龍果Hylocereusundatus莖多糖理化特性的研究結果相一致，冷凍真空干燥是獲取高品質、高含量多糖的最佳干燥方法，李振豐等的研究結果也表明高溫會破壞多糖的結構，從而導致多糖含量的降低[26-28]。殺青處理會導致除烘干外其余各組干燥方式下短小蛇根草中粗多糖含量顯著降低（P＜0.05），其中以殺青-曬干組降低幅度最大（26.68%），在各組中含量最低（30.76 mg·g-1），這與喜樹堿的殺青-曬干組結果存在一致性，表明短小蛇根草中喜樹堿與粗多糖在殺青過程中的變化可能存在著一定的聯系，低溫干燥是短小蛇根草粗多糖的最佳干燥方式（50.01 mg·g-1）。

殺青處理及不同干燥方式對短小蛇根草的活性成分影響較大，喜樹堿在曬干后含量最高，總黃酮和粗多糖在冷凍干燥后含量最高，殺青會導致喜樹堿含量普遍降低、總黃酮含量顯著提高、粗多糖含量普遍降低。在實際生產中，以曬干作為短小蛇根草的首選干燥方式，若遇陰雨天氣，以冷凍真空干燥作為短小蛇根草的最佳干燥方式，干燥前不宜采取殺青處理。