甲維鹽注干施藥對馬尾松內生真菌和細菌多樣性的影響

劉鵬，姜壯，初楚，毛赟來，張紹勇

（1. 安吉縣人民政府孝源街道辦事處，浙江 湖州 313000；2. 浙江農林大學 生物農藥高效制備技術國家地方聯合工程實驗室，浙江 杭州 311300；3. 湖州師范學院 生命科學學院，浙江省媒介生物學與病原傳播控制重點實驗室，浙江 湖州 313000 )

植物體內生菌包括真菌、細菌及放線菌，可定殖于植物器官、組織內部以及細胞間隙中[1-2]。內生菌與宿主植物協同進化、互利共生，宿主植物為內生菌提供營養物質和生存空間，內生菌經代謝途徑產生如生長激素、抗生素、蛋白酶等代謝產物，進一步促進宿主植物的生長發育或抑制其他外來生物侵害[3-4]。內生菌還協助參與植物某些活性成分和次生代謝產物的合成，同時代謝產物還可提高宿主植物對外界惡劣環境的抗逆性和抗病性[5]。Wu 等[6]證實了三七Panaxnotoginseng內生菌的豐富度可影響宿主植物的正常發育，Fadaei 等[7]發現杜鵑Rhododendronsimsii內生菌增強了宿主植物的耐鹽性。植物內生菌群落結構與植物健康存在關聯，植物內生菌的篩選和利用將為生物防治提供新的方向，也可作為評估植物健康狀態的依據。

馬尾松Pinusmassoniana內生菌研究和松材線蟲Bursaphelenchusxylophilus病相關聯。袁文婷[8]首次在馬尾松上分離得到20 株內生細菌，通過平板對峙試驗篩選出了NSM-05、NSM-17、NSM-17 三株對病原菌有良好拮抗作用的益生細菌；從馬尾松上分離篩選出對松材線蟲有活性的益生菌還有解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens、短小芽孢桿菌B.pumilus、蠟樣芽孢桿菌B.cereus、寡養單胞菌Stenotrophomonassp.、芽孢桿菌Bacillussp.、銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa等[9-12]。松材線蟲能取食大多數內生真菌，從而完成其生活史[13-14]；從健康馬尾松樹上分離到的內生菌芽孢桿菌，其代謝產物可致使衰弱松樹產生與松材線蟲病類似的癥狀[15]。故而馬尾松內生菌的多樣性變化將影響松材線蟲種群的變化，進而影響病害的發生。

甲維鹽注干施藥是目前防治松樹松材線蟲病的有效方法，且對松樹和生態環境安全。與傳統施藥方式相比，甲維鹽注干防治可減少藥劑浪費、降低環境污染，從而提高利用率，不僅防治效果顯著且對非靶標生物較為安全[16-18]。目前，有關甲維鹽注干施藥后的防治效果、殘留檢測和傳導分布方面的報道較多[19-21]，但針對樹體微環境上，注干施藥影響下的馬尾松樹體內真菌和細菌多樣性的研究報道較少。為評價甲維鹽樹干注射在馬尾松林中的生態安全性，OUYANG 等[22]從宏觀上研究了樹干注射不同時期土壤節肢動物和飛行昆蟲的群落多樣性和群落組成，結果表明甲維鹽對總土壤節肢動物和飛行昆蟲（膜翅目Hymenoptera 昆蟲）多樣性指數無顯著影響，但對土壤節肢動物的有害動物多樣性指數有顯著影響，表明甲維鹽注干施藥對生態環境的影響是積極的。

本文基于高通量測序技術對馬尾松主干內生真菌的rDNAITS1 基因和內生細菌的16srRNA基因進行提取并測序，首次對甲維鹽注干前后馬尾松樹的內生真菌和內生細菌多樣性、群落組成特征進行研究，以期為馬尾松生長健康評價、生態安全評價、真菌和細菌的多樣性資源保育以及森林可持續經營管理等方面提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

試驗樣地于浙江省杭州市臨安區（30°29′ N，119°75′ E）海拔89 ～ 114 m 的針闊混交林內，面積約為0.33 hm2，當年無松材線蟲病致死的枯死木，相鄰山頭有松材線蟲病發生，馬尾松死亡率小于0.1%。隨機選擇20 株健康馬尾松，于2022 年4 月20 日打孔注干2.3%甲維鹽微乳劑（浙江錢江生物化學股份有限公司），其余健康馬尾松為對照。采樣時間為2022 年9 月20 日，隨機采集注藥處理3 株，依次編號為EB1、EB2 和EB3；對照3 株，依次編號為CK1、CK2 和CK3，采集樣品信息如表1。所采集馬尾松樣本均為20 ～ 35 年生，胸徑為14 ～ 25 cm，樹高為6.0 ～ 8.5 m。采集前對包裝袋、柴刀等采集工具進行滅菌，采集時先用柴刀劈掉鉆孔點樹皮，每次鉆孔前均用75%酒精對鉆孔點和鉆頭消毒20 ～ 30 s。同一株馬尾松隨機鉆孔三個點，鉆孔點距地面分別為0.5 m、1.0 m、1.5 m，鉆孔深度為10 cm，孔直徑為7 mm，取三個點的木屑混合均勻為一個樣本，立即密封冰盒保存，放于－80℃冰箱保存，待測。用高枝剪取6 株馬尾松樣株的枝條，枝長為20 cm，直徑為4 ～ 6 cm，向陽和背陰向各一枝，同時用斧頭劈開樹皮取主干質量約20 g 木屑，并做好標記，密封帶回。于室內剪碎取同等質量木屑，采用貝爾曼漏斗法進行線蟲分離，鏡檢并統計松材線蟲頭數。經檢測，所有樣本中均未檢出松材線蟲，如表1。

表1 馬尾松各樣本采集信息Tab. 1 Sampled P. massoniana in the sample plot

1.2 馬尾松內生真菌和內生細菌的高通量測序及分析

1.2.1 DNA 提取和PCR 擴增 基因組DNA 提取：使用TGuide S96 磁珠法土壤基因組DNA 提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司，型號：DP812］分別提取6 個樣本的總DNA，具體操作參照使用說明書。DNA 經1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測其濃度和純度。

聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction, PCR）擴增：以基因組DNA 為模板進行PCR 擴增。細菌16s rDNAV3+V4高變區使用通用擴增引物為338F-5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’和806R-5’-GGACTACHVGG GTWTCTAAT-3’；真菌ITS 擴增引物為ITS1F-5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’和ITS2-5’-GCTGCGTT CTTCATCGATGC-3’。采用TransStart FastPfu Fly DNA Polymerase，PCR 擴增（10 μL 反應體系：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，25 個循環，最后72 ℃延伸7 min；20 μL 反應體系：98 ℃預變性30 s，98 ℃變性10 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，10 個循環，最后72 ℃延伸5 min），擴增產物經電泳檢測、定量及混樣、純化后，利用Monarch DNA 膠回收試劑盒對目標片段進行回收。

1.2.2 上機測序 6 個樣本DNA 委托北京百邁克生物科技有限公司完成測序，測序平臺為Illumina NovaSeq 6 000 高通量測序儀。

1.2.3 序列處理與分析 使用 Trimmomatic v0.33 軟件和Cutadapt 1.9.1 軟件對原始測序序列Raw Reads 進行質量過濾得到高質量序列Clean Reads；使用QIIME2 2020.6[23]中的dada2[24]方法聚類或去噪，經雙端序列拼接、去除嵌合體序列得到最終序列；在相似性97%水平上聚類，獲得運算分類單位（operational taxonomic units, OTUs），細菌以SILVA 為參考數據庫，真菌以UNITE 為參考數據庫，使用樸素貝葉斯分類器對特征序列進行分類學注釋，得到特征對應的物種分類信息，統計各樣品群落組成，利用QIIME 軟件生成不同分類水平上的物種豐度表，再利用R 語言等工具對物種豐度分布、Alpha 多樣性指數、稀釋性曲線、等級豐度曲線、主成分分析、相關性分析。以上分析均在北京百邁克生物科技有限公司BMKCloud 云平臺網站（http://console.biocloud.net/）完成。

1.3 數據處理

應用Excel 2016 軟件整理和匯總常規數據，用SPSS 20.0 軟件處理和統計分析相應數據。

2 結果與分析

2.1 高通量測序數據分析

2.1.1 高通量測序深度和OTUs 分析 對6 個樣本的高通量測序共獲得細菌480 050 對測序序列（Reads），經雙端Reads 質控、拼接后共產生479 354 條Clean Reads，每個樣品至少產生79 734 條，平均產生79 892 條。物種聚類結果為1 界27 門52 綱126 目206 科340 屬368 種細菌。共獲得真菌2 798 314 對Reads，經雙端Reads質控、拼接后共產生2 784 536 條Clean Reads，每個樣品至少產生396 521 條，平均產生464 089 條，物種聚類結果為1 界15 門48 綱117 目271 科594 屬941 種。

聚類共得到OTUs 細菌1 169 個、真菌7 250 個。未注藥組（Group 1，記為G1）為CK1、CK2 和CK3，注藥組（Group 2，記為G2）為EB1、EB2 和EB3。各樣本OTUs、共有數和組間共有數統計如表2。其中，細菌G1、G2 的OTUs 總數分別為686 個和623 個，共有OTUs 數分別為26 個和29 個，共有OTUs 數占總數的百分比分別為20.41%和22.47%，共有數組間變化不明顯，兩組共有OTUs 數為140 個；真菌G1、G2 的OTUs 總數分別為4 206 和3 595 個，共有OTUs 數分別為316 個和89 個，共有OTUs 數占總數的百分比分別為13.1%和15.33%，兩組共有OTUs 數為551 個。表明馬尾松不同樣本間的內生菌群落組成結構復雜，都具有特有的微生物多樣性。細菌OTUs、特有數和共有數在數量上無明顯差異，但在真菌中，注藥組G2 的OTUs、特有數和共有數在數量上明顯少于未注藥組G1，G1 的共有數是G2 的3.5 倍，與對照組相比，注藥處理組共有OTUs 數減少71.84%。表明注藥處理組對馬尾松內生細菌OTUs 數量影響不明顯，但注藥降低了馬尾松內生真菌中OTUs 共有數。

表2 各樣本OTUs 統計Tab. 2 OTUs of each sample

2.1.2 馬尾松主干內微生物群落的物種組成比較

（1）門水平的物種相對豐度。馬尾松樣本內生菌中優勢細菌和真菌在門水平的物種相對豐度如圖1。

圖1 門水平馬尾松細菌（A）和真菌（B）的相對豐度柱狀圖Fig. 1 Relative abundance of bacteria (A) and fungi (B) at phylum level in P. massoniana

由圖1 可知，6 個樣本中的微生物群落多樣性均較高，細菌和真菌的優勢門均達10 個門以上。細菌（圖1A）優勢菌門為藍藻門Cyanobacteria、細菌未分類門unclassified Bacteria、變形菌門Proteobacteria、厚壁菌門Firmicutes、放線菌門Actinobacteriota、酸桿菌門Acidobacteriota、擬桿菌門Bacteroidota、綠彎菌門Chloroflexi、芽單胞菌門Gemmatimonadota 和梭桿菌門Fusobacteriota，10 類菌門占細菌門總數相對豐度的96%以上。其中，藍藻門的相對豐度最高，占92.32% ～ 95.12%，其次是變形菌門，占2.33% ～ 2.84%。可見，藍藻門和變形菌門是所有樣本中的主要細菌類群，且注藥前后其相對豐度無明顯差異。真菌（圖1B）優勢菌門包括子囊菌門Ascomycota、擔子菌門Basidiomycota、真菌未分類門unclassified Fungi、被孢霉門Mortierellomycota、隱菌門Rozellomycota、壺菌門Chytridiomycota、毛霉門Mucoromycota、球囊菌門Glomeromycota、油壺菌門Olpidiomycota 和梳霉門Kickxellomycota，10 類菌門占真菌門總數相對豐度的90%以上。其中，子囊菌門的相對豐度最高，占56.69% ～64.27%，其次為擔子菌門，占19.11% ～ 25.82%。可見，子囊菌門和擔子菌門是所有樣本中的主要真菌類群，且注藥前后相對豐度無明顯差異。

（2）屬水平的物種相對豐度。馬尾松樣本內生菌中優勢細菌和真菌在屬水平的物種相對豐度如圖2。

樣本中優勢細菌屬（圖2A）包括藍細菌目未分類屬unclassified Cyanobacteriales、細菌未分類屬unclassified Bacteria、變形菌門未分類屬unclassified Proteobacteria、念珠藻科未分類屬（unclassified Nostocaceae）、α-變形菌綱未分類屬unclassified Alphaproteobacteria、大腸桿菌屬-志賀氏菌屬Escherichia-Shigella、腸桿菌科未分類屬unclassified Enterobacteriaceae、擬桿菌屬Bacteroides、奈瑟菌屬Neisseria和藍細菌綱未分類屬unclassified Cyanobacteriia。其中，藍細菌目未分類屬的相對豐度最高，占89.3% ～ 93.5%，其次為細菌未分類屬、變形菌門未分類屬、念珠藻科未分類屬和α-變形菌綱未分類屬。6 個樣本在各細菌屬水平下的相對豐度變化不明顯。真菌（圖2B）優勢菌屬包括真菌未分類屬unclassified Fungi、色二孢屬Diplodia、被孢霉屬Mortierella、子囊菌門未分類屬unclassified Ascomycota、腐質霉屬Humicola、鐮刀霉屬Fusarium、古根菌屬Archaeorhizomyces、枝孢霉屬Cladosporium、糞殼菌綱未分類屬unclassified Sordariomycetes 和青霉屬Penicillium。其中，色二孢屬的相對豐度在對照株樣品中最高，占8.9% ～ 14.6%，但在注藥處理株中僅占0.000 5% ～ 1.31%；被孢霉屬、鐮刀霉屬、古根菌屬、枝孢霉屬、青霉屬在所有樣品中分別占2.4% ～ 9.3%、1.3% ～ 5.2%、0.4% ～ 3.7%、0.8% ～ 5.5%、1.1% ～ 3.9%。可見色二孢屬、被孢霉屬、鐮刀霉屬、古根菌屬和枝孢霉屬是所有樣本中的主要真菌類群。

2.2 馬尾松主干內真菌和細菌α多樣性分析

2.2.1 α 多樣性及OTUs 豐度分析 將所有序列在97%的相似度水平進行OTUs 分類。經統計，各樣本在不同OTUs 中的豐度信息，即真菌和細菌群落Alpha 多樣性指數統計表（表3）。

表3 Alpha 多樣性指數統計Tab. 3 Alpha diversity index

由表3 和表4 可知，經Student t 檢驗，P值均大于0.05，G1 組（CK1、CK2、CK3）和G2 組（EB1、EB2、EB3）組間細菌和真菌的ACE、Chao1、辛普森指數、香農指數和多樣性指數差異不明顯，說明組間樣本真菌和細菌多樣性無明顯差異，主干施藥對馬尾松內生真菌和細菌多樣性影響不大。6 個樣本的覆蓋度均在0.999 9 以上，表明測序數據基本覆蓋6 個樣本中所有真菌和細菌的生物信息，測序結果能夠客觀真實地反映樣本中真菌和細菌的群落組成結構。

表4 屬水平Metastats 統計分析組合Tab. 4 Metastats analysis at genus level

表4 Alpha 多樣性指數組間差異分析Tab. 4 Difference analysis on Alpha diversity index

2.2.2 稀釋性曲線和等級豐度曲線分析 稀釋性曲線可用來檢驗測序數據量能否反映樣本中物種多樣性和豐富程度，等級豐度曲線解釋樣品所含物種的豐富度和均勻度。由圖3A 和3B 顯示，隨著樣本測序條數增加，稀釋性曲線急劇上升，當細菌測序條數達40 000 條左右時，真菌測序條數達124 000 條左右時，稀釋曲線趨于平緩，當測序數量再增加時，OTUs 數量增加不明顯。表明所測序樣本中已涵蓋絕大多數的微生物物種信息，測序結果可以反映馬尾松主干內真菌群落結構。由細菌的等級豐度曲線顯示（圖4A），6 個樣品曲線寬度、平坦度均相近，表明樣品中（細菌）物種的組成豐富度、均勻度相似。但圖4B 顯示，注藥組EB1 和EB2 的曲線寬度、平坦度均低于未注藥組和EB3，說明注藥馬尾松整體在真菌上的物種組成豐富度、均勻度低于未注藥馬尾松。

圖3 細菌（A）和真菌（B）的Alpha 指數稀釋性曲線Fig. 3 Alpha index dilution curve of bacteria (A) and fungi (B)

圖4 細菌（A）和真菌（B）的等級豐度曲線Fig. 4 Rank abundance curve of bacteria (A) and fungi (B)

2.3 馬尾松主干內真菌和細菌Beta 多樣性分析

主坐標分析（PCoA）主要展現多個樣品間的分類關系，基于杰卡德距離（Binary jaccard）算法，在所采集的6 個樣本中的細菌（圖5A）和真菌（圖5B）中，PC1 和PC2 兩個主坐標軸分別累計解釋了物種變異信息的42.45%和46.78%。由圖5A 顯示，G1 樣本間相對離散，G2 樣本間相對聚集，表明G1 組樣本間細菌群落差異明顯，而G2 組樣本間細菌群落差異不明顯。由圖5B 顯示，G1 樣本間相距較近，G2 樣本間相對離散，表明G1 馬尾松中內生真菌群落差異不明顯，相似性高，但G2 馬尾松中內生真菌群落差異較大。另外，G1 與G2 分別分布在PCoA 左軸和右軸，兩組數據簇完全分開，并相距較遠，說明注藥馬尾松與未注藥馬尾松真菌群落結構存在明顯差異。

圖5 細菌（A）和真菌（B）的PCoA 分析Fig. 5 Principal component analysis on bacteria (A) and fungi (B)

2.4 馬尾松主干內真菌和細菌群落結構與胸徑和生長狀況的關系

RDA(Redundancy analysis)基于線性模型分析微生物群落與環境因子胸徑（Diameter at Breast Height, DBH）和注藥（Drug injection, DI）之間的變化相關性，如圖6。

由圖可知，細菌RDA 分析得出前2 個排序軸累積貢獻率為35.58%，真菌RDA 分析得出前2 個排序軸累積貢獻率為51.63%。在細菌群落結構中（圖6A），DI（R2=0.970 5，P=0.1）與變形菌門未分類屬呈正相關，但與大腸桿菌屬-志賀氏菌和α-變形菌綱未分類屬呈負相關；DBH（R2=0.974 8,P=0.01）與奈瑟菌屬呈負相關。在真菌群落結構中（圖6B），DBH（R2=0.891 8,P=0.03）與Humicola屬和Mortierella屬呈正相關，但與糞殼菌綱未分類屬、真菌未分類屬和芽枝霉屬呈負相關；DI（R2=0.992 0，P=0.1）與鐮刀霉屬和青霉屬呈正相關，但與色二孢屬和子囊菌未分類屬呈負相關。整體來說，影響馬尾松主干內真菌和細菌群落結構的主要因素是DI和DBH，DBH 影響差異顯著。

2.5 馬尾松主干內真菌和細菌物種間相關性分析

6 個馬尾松主干樣本物種相關性分析結果顯示（圖7A、7B），內生細菌中，豐度較高的藍細菌未分類屬與細菌未分類屬和念珠藻科未分類屬呈負相關，但與大腸桿菌屬-志賀氏菌屬、鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas和CandidatusUdaeobacter 屬呈正相關，細菌未分類屬與鯨桿菌屬Cetobacterium和乳桿菌屬Lactobacillus呈負相關，但與MND1 屬和unclassified Vicinamibacteraceae 呈正相關。卷毛菇屬Floccularia與色二孢屬呈正相關，嗜熱真菌屬Thermomyces與被孢霉屬呈負相關，Comoclathris與鐮刀霉屬呈正相關，漢納酵母屬Hannaella與枝孢菌屬正相關，裂殼菌屬Schizothecium與青霉屬呈負相關，索狀霉屬Hormonema與Pezoloma呈正相關。

2.6 組間微生物群落Metastats 分析

利用Metastats 軟件對組間的物種豐度數據進行t 檢驗，得到P值。屬分類學水平下的組間差異顯著性分析統計結果如表4。從表4 可知，在真菌群落中，二叉毛殼屬Dichotomopilus、Cystodendron、Leptospora、刺孢菌屬Subulicystidium、Pseudosigmoidea、亞側耳屬Hohenbuehelia和Microscypha只存在于G1 中。屬水平豐度最高的色二孢屬，在G1 中的豐度為12.1%，在G2 中豐度為0.44%，組間差異極顯著。在細菌群落中，腸球菌屬Enterococcus、擬普雷沃菌屬Alloprevotella和理研菌科RC9 腸道群RikenellaceaeRC9 gut group 在兩組間存在極顯著差異，表現為腸球菌屬和理研菌科RC9 腸道群在G2 中相對豐度較高，而擬普雷沃菌屬則在G1 中相對豐度較高。整體表明注藥馬尾松中的真菌在屬水平上的相對豐度顯著低于未注藥馬尾松，而在細菌群落中影響相對較小。

3 結論及討論

本文基于高通量測序研究了甲維鹽注干使用后馬尾松內生真菌和細菌群落結構的變化。甲維鹽注干使用后，松樹內生細菌和真菌在門、屬水平上群落結構差異不明顯，但顯著降低了松樹中真菌色二孢屬的相對豐度。

研究發現，甲維鹽注干使用后對松樹中的色二孢屬致病真菌有顯著影響。色二孢屬是世界性分布的病原真菌，是包括松樹在內的木本植物的主要病原菌，在松樹上可導致新梢枯死、壞死、小枝枯萎、冠層稀疏透光和樹干潰瘍等癥狀[25]。婁德釗[26]發現致病菌相對豐度升高與感病程度和發病階段顯著相關。甲維鹽注干施藥后，真菌群落組成中色二孢屬的相對豐度顯著降低，推測是甲維鹽的間接作用。趙曉佳等[27]發現單獨使用甲維鹽對松材線蟲攜帶致病細菌的AMA3-1 沒有抑制作用，但甲維鹽和高效抗生素環丙沙星、米諾環素混合使用可提高松材線蟲病的防治效果。內生菌群落組成和其相對豐度等的變化將直接或間接影響植物的健康[3-7]。松樹致病菌相對豐度降低，有利于松樹健康。

采用高通量測序方法，更利于得到馬尾松主干內生真菌和細菌真實的群落結構。魏珂[28]采用室內平板分離培養法分離鑒定了可培養的真菌和細菌，共鑒定出細菌12 屬、真菌16 屬，發現健康馬尾松優勢種群細菌為芽孢桿菌，真菌為擬盤多毛孢和青霉；溫曉健等[29]共鑒定出細菌11 屬、真菌19 屬，發現優勢菌群細菌為腸桿菌屬Enterobacter，真菌為木霉屬Trichoderma。本研究采用高通量測序鑒定出細菌340 屬、真菌594 屬，屬水平的數量上遠遠高于室內平板分離鑒定所得到的，并發現優勢內生菌為藍細菌目未分類屬和色二孢屬真菌，補充了室內不可培養的真菌和細菌類群，但藍細菌目細菌相對豐度占比高于90%，推測部分物種注釋特征來源于樹干質體和葉綠體的基因。

甲維鹽注干施用一定程度上改變了松樹內的微生物多樣性，降低了松樹致病菌色二孢屬真菌的相對豐度，有助于提高松樹抗病能力，有利于松樹健康。