商業化試劑構建熒光探針用于肼的檢測及防偽識別

南齊鈺，熊知萌，梁文杰，陳杜剛，余響林，閆志國

武漢工程大學化工與制藥學院，湖北 武漢 430205

肼（N2H4），又名聯胺，是一種無色有刺激性氣味的油狀液體［1］。其分子結構包含兩個帶孤對電子的氮原子和四個活潑的氫原子，具有強還原性和親核性，主要用作抗氧化劑、催化劑、醫藥中間體和火箭燃料等［2-3］。但是，其在生產、運輸、使用和處理過程中，一旦發生泄漏，很容易造成嚴重的環境污染［4-5］。同時，肼具有較好的水溶性和高毒性，易通過呼吸吸入和皮膚滲透方式進入人體內，造成肝、肺、腎及中樞神經的損傷［6-7］。中國國家衛生計生委及世界衛生組織認為肼是一種可能引發癌癥的潛在的環境污染物，并規定單位體積內肼濃度不得超過0.06 mg/m3，短時間接觸肼的容許濃度不得超過0.13 mg/m3［4，8］。因此，實現環境中肼含量的高效準確檢測有利于污染防控和改善相關工作人員的工作環境。

目前，常用的肼檢測方法有色譜- 質譜聯用法、滴定法、分光光度法［9］和電化學方法［10］。這些方法受儀器價格昂貴、制樣程序繁瑣及檢測周期長等因素限制，不利于實時實地的檢測環境中的肼含量。相對而言，熒光分析法在降低檢測成本的同時，表現出靈敏度高、選擇性好、操作簡單等特點［11］，在環境檢測和疾病診斷領域中得到廣泛關注［12］。因此越來越多用于肼檢測的熒光探針得到報道，如：Lan 等［13］以喹啉衍生物為骨架構建強給- 受體結構的紅色熒光探針QMM，肼與受體二氰基乙烯鍵發生加成反應后，分子中的受體強度顯著減弱，從而導致探針的發射藍移，產生綠色熒光，實現了肼的比率型檢測；Liu 等［14］以香豆素為熒光團，以1-溴丁酰基為識別基團構建熒光探針，肼先與溴發生取代反應，接著與C=O 發生分子內的縮合反應，將識別基團從分子中脫除，從而開啟香豆素的綠色熒光，實現肼的選擇性檢測；Jung等［15］以四苯乙烯為熒光團，通過肼與雙鍵的縮合反應，改變分子原有的熒光淬滅效果，于橙光區實現熒光增強。已報道的用于肼檢測的熒光探針分子主要以香豆素［16-18］、半花菁［19］、熒光素［20］、黃酮［21-22］等結構為母體，通過基團修飾，實現對肼的檢測。然而，這些熒光探針依然有值得改進之處：（1）探針分子化學結構復雜，合成過程繁瑣，危險化學試劑使用頻率高，與當前提倡的“綠色化學”、“綠色合成”理念不符；（2）部分熒光探針在檢測肼時，吸收和發射位于紫外或藍光區域［16］，背景干擾大，且Stokes 位移較小［17］，易受到“自吸收”效應的干擾，降低檢測靈敏度；（3）部分熒光探針［18］必須在高含量有機溶劑中才能檢測肼，且極易受到其他化合物的干擾［22］，降低檢測結果的準確性。

為解決上述問題，本工作尋找了一種結構簡單的商業化試劑作為探針，用于環境中肼含量的測定，在降低檢測成本的同時，還具有響應速度快、選擇性好、靈敏度高等特點。該探針為2-羥基-4- 甲氧基苯甲醛（2-hydroxy-4-methoxybenzaldehyde，代號XN），以醛基作為肼識別位點（圖1）。在水環境中，醛基與肼發生快速的縮合反應，所得產物能形成分子內氫鍵，在激發態發生分子內質子轉移（excited-state intramolecular proton transfer，ESIPT）作用，從而開啟強的熒光信號，實現對肼的選擇性檢測。同時，我們制備了負載探針XN 的試紙條，成功檢測了氣相中肼的含量，并且建立了只有在肼溶液噴涂的情況下才能發光成像的防偽識別模型。

圖1 探針XN 對肼的識別機制Fig.1 Recognition mechanism of XN to hydrazine

1 實驗部分

1.1 主要儀器和試劑

DHG-9246A 電熱恒溫鼓風干燥箱（鞏義市予華儀器），FA2014 分析天平（上海舜宇），Lambda 365 紫外分光光度計（日本島津），F-7600 熒光光譜儀（日本日立）。

二甲基亞砜、四氫呋喃、水合肼、氯化銨、三乙胺、氨水和氫氧化鈉（分析純，中國武漢申試化工）；次氯酸鈉、苯胺（安徽安慶安耐吉）。

1.2 溶液配制

將探針XN 用DMSO 配制成濃度為1 mmol/L的母液。市售水合肼經過標定后濃度為16.7 mol/L，使用去離子水梯度稀釋至1 mol/L，以及100、50、20、10 mmol/L，且每次使用時重新配制。三乙胺、氨水和次氯酸鈉溶液配制方法：將市售溶液稀釋至濃度為10 mmol/L 的儲存液；苯胺、氯化銨和氯化鈉配制方法：稱取相應質量的固體溶解在一定體積的去離子水中配制成濃度為10 mmol/L 的儲存液。測試體系配制：量取200 μL 乙醇和800 μL去離子水混合制成V（EtOH）：V（去離子水）＝2∶8混合測試體系。

1.3 光譜性質測試

光譜性質測試過程中，將10 μL 探針XN 母液和10 μL 水合肼儲存液（10 mmol/L）一同添加至1 mL 含體積分數20%EtOH 的去離子水混合測試體系，室溫條件下孵育10 min，于紫外分光光度儀中測得紫外-可見吸收圖譜和熒光發射圖譜；熒光滴定測試過程中，于測試體系中分別加入10 μL 探針XN 母液和不同體積（0~10 μL）的水合肼儲存液（10 mmol/L），室溫中孵育10 min 后測得熒光發射圖譜；選擇性測試過程中，于測試體系中分別加入10 μL 探針XN 母液和10 μL 不同干擾物的儲存液，室溫中孵育10 min 后測得熒光發射圖譜。

1.4 試紙條制備

將探針XN 溶解在丙酮溶液中，配制成濃度為20 μmol/L 的儲存液。將裁剪好的濾紙條（1 cm寬）浸沒在上述儲存液內5 s，取出于通風處晾干后再次浸沒在上述儲存液中。重復操作4 次。得到試紙條在熒光燈下觀察，若未顯示出明顯熒光，即滿足后續測試要求。

1.5 防偽識別

首先使用工具蘸取已配制的濃度為20 μmol/L的XN 四氫呋喃溶液，在濾紙上寫下“WIT”字樣，通風處晾干，至無任何肉眼可見痕跡。然后將100 mmol/L 的水合肼溶液噴灑至濾紙上，靜置5 min 后用熒光燈照射，觀察發光情況。

2 結果與討論

2.1 光學性能測試

2.1.1 探針分子結構和肼的識別機制 2-羥基-4-甲氧基苯甲醛（XN）本身分子的共軛比較小，分子內給受體系不強，熒光信號很弱，但與肼能快速發生縮合反應，所得產物能形成分子內的氫鍵，進而發生ESIPT 作用，有望開啟強的熒光信號（圖1）。為驗證XN 對肼的識別機制，我們將1 mmol 的探針與10 mmol 的肼混合攪拌，并通過核磁共振氫譜分析產物結構。如圖2 所示，探針與肼反應后，原有的醛基信號峰（c，9.72）消失，而在8.59 處出現新的信號峰（c’），且與3.92（a，-OCH3）處信號峰的積分比值為2∶3，符和伯氨氫與甲氧基上氫原子數目之比，故認為探針XN 對肼的識別機制如圖1 所示。這樣，在肼的檢測過程中，背景干擾小，信噪比高。相比較已有的報道［16-20］，熒光探針XN還具有以下特點：（1）探針XN 為商業化試劑，來源簡單，成本低廉；（2）ESIPT 作用的發生，能得到較大的Stokes 位移，減少自吸收，進一步提高檢測的靈敏度。

圖2 探針XN 與肼反應前后的核磁氫譜圖Fig.21H NMR spectra of XN in absence and presence of hydrazine

2.1.2 紫外和熒光光譜性質 如圖3（a）所示，熒光探針XN 本身在250 nm 以上的范圍里沒有明顯的吸收；而在加入100 μmol/L 肼之后，在280 nm和370 nm 處分別出現明顯的吸收峰，表明熒光探針XN 與肼發生了化學反應，產生了新的化合物，吸收系數顯著增強。如圖3b 所示，未添加肼時，熒光探針XN 在485 nm 處只表現出微弱的熒光發射峰。而在加入肼之后，485 nm 處的熒光強度增強了20 多倍，Stokes 位移高達115 nm，進一步說明XN 與肼發生反應，并通過ESIPT 作用發射強的熒光信號。這些結果表明探針XN 有望用來可視化檢測肼的含量。

圖3 探針分子XN（20 μmol/L）對肼（100 μmol/L）反應前后的吸收圖譜（a），發射圖譜（b），λex=370 nmFig.3 Absorption（a）and fluorescence spectra（b）of XN（20 μmol/L）in absence and presence of hydrazine（100 μmol/L），λex=370 nm

2.1.3 選擇性測試 生態環境是一個復雜的系統，有可能含有多種潛在的干擾物質，尤其是與肼官能團相似的無機氨和有機胺類，理論上也能與探針分子XN 發生反應。為了驗證熒光探針XN 對肼分子的高選擇性，我們分別測試探針XN 在含有肼、苯胺、氯化銨、三乙胺、氨水、氯化鈉和次氯酸鈉的水溶劑體系中的熒光信號變化情況［圖4（a），濃度均為100 μmol/L］，并繪制成柱狀圖［圖4（b）］。如圖4（a）所示，在幾種干擾物質存在條件下，只有氨水能夠造成輕微的熒光信號增強，而其他物質均不會改變溶液熒光的信號。這是因為氨水（NH3·H2O）有類似于肼（NH2-NH2）的伯胺結構，具有較強的親核性，也能夠與苯甲醛發生化學反應；但是其親核能力卻明顯弱于肼，可能由于氨水在溶液中部分形成共軛酸NH4+，降低了反應活性，所以添加氨水的測試體系的熒光強度只有肼的1/3。同時，也測試了在干擾物共存下探針的檢測性能，如圖4（c）所示，在檢測肼時探針顯示出了良好的抗干擾能力。這些結果表明熒光探針XN 能夠選擇性地檢測環境中的肼，尤其是可用于生產或使用肼的相關工廠水樣中肼殘余濃度的監測。

圖4 探針XN（20 μmol/L）對肼（100 μmol/L）測定的選擇性和抗干擾能力實驗結果圖：（a）熒光圖譜，（b）和（c）相對熒光強度直方圖Fig.4 Selectivity and anti-interference of XN（20 μmol/L）during detection of hydrazine（100 μmol/L）：（a）fluorescence spectra，（b）and（c）histograms of relative fluorescence intensity

2.1.4 線性范圍及檢測限 為探究熒光探針XN對肼的檢測靈敏度，我們在混合溶劑體系中進行了熒光滴定實驗。如圖5（a）所示，隨著加入肼的濃度逐漸增加，溶液的熒光也逐漸增強。當肼的濃度達到100 μmol/L 時，熒光強度達到最大值并飽和。之后，繼續添加肼，熒光也不再變化。以探針XN 的相對熒光強度Fi/F0（Fi：添加肼后485 nm處熒光強度；F0：未添加肼時485 nm 處熒光強度）對肼的濃度作線性關系圖，發現在10~100 μmol/L范圍內，Fi/F0對肼濃度呈良好的線性關系［圖5（b）］，擬合方程為：y=0.218x+0.157（R2=0.989）。依照3σ/κ的方法計算探針XN 的檢測極限為69 nmol/L。表明熒光探針XN 能夠高靈敏地檢測溶液中肼的含量。

圖5 探針XN 熒光滴定圖譜（a）及曲線（b）Fig.5 Fluorescence titration spectra（a）and curve（b）of XN in presence of hydrazine

2.2 應用實驗

2.2.1 肼蒸汽檢測 肼的易揮發特性，導致其在泄漏時不僅容易造成水源污染，同時也會造成空氣污染，因此我們設計肼蒸汽檢測實驗［圖6（a）］來考察熒光探針XN 對氣相中肼含量的檢測能力。將市售水合肼溶液用四氫呋喃稀釋，得到濃度為100、50、20、10 和0 mmol/L 的水合肼儲存液。將不同濃度的水合肼儲存液傾倒至展缸中（約20 mL），于避光處靜置1 h，以保證展開缸內充滿肼蒸汽。將制備好的含熒光探針XN 的試紙條懸掛在展開缸內，于避光處靜置10 min 后取出，通風處晾干，并在熒光燈下觀察發光情況［圖6（b）］。如圖6（c）所示，經不同濃度肼蒸汽浸潤后的試紙條，在日光下肉眼觀察并無明顯區別，而在便攜式紫外燈（365 nm）的照射下，則表現出明顯的熒光強度差異。比如未在肼蒸汽中浸潤的試紙條，在日光下為白色，而在熒光燈下顯示藍色熒光；在肼蒸汽中浸潤的試紙條，在日光下為白色，而在熒光燈下顯示綠色熒光。當空氣中肼含量升高時，綠色熒光也逐漸增強［圖6（c）］，說明負載XN 的試紙條有能力實現便捷式檢測空氣中肼的含量。

圖6 （a）負載探針分子XN 的試紙條的制備和檢測肼蒸汽的示意圖，（b）試紙條在熒光燈下發光情況，（c）負載探針分子XN 的試紙條經不同濃度肼蒸汽浸潤后的比色圖和熒光圖Fig.6 （a）Schematic illustrations of preparation of XN-loaded paper strip；（b）Luminescence of paper strip under UV-lamp；（c）Colorimetric and fluorescent detection of hydrazine vapor with paper strip

2.2.2 防偽識別 當今社會假冒現象無處不在，廣大消費者及諸多企業飽受坑害，因此防偽技術的研究具有十分重要的社會安全意義。目前，紙幣和發票上常用的防偽材料包括有機染料、聚合物納米材料、半導體納米材料、稀土摻雜發光納米材料、碳量子點等［23-24］，主要通過在特定條件下產生特殊標志實現防偽鑒別，鑒于探針XN 在肼的作用下能夠發射強熒光，與傳統防偽機理有異曲同工之妙，它也有望用于防偽標識。如圖7 所示，以XN 的四氫呋喃溶液（20 μmol/L）為墨，在濾紙上書寫“WIT”標志，通風處晾干后，濾紙并看不到任何變化；但是再將肼溶液（100 mmol/L）噴涂在濾紙上，在便攜式紫外燈的照射下，則能夠觀察到明顯的發射綠色熒光的“WIT”標志，說明可以通過探針XN 與肼的反應實現防偽鑒別。

圖7 防偽實驗示意圖及熒光成像結果Fig.7 Schematic illustration of anti-counterfeiting identification

3 結 論

本工作將熒光探針技術與環境監測的需求緊密結合，報道了一種成本低廉的商業化試劑作為肼的熒光探針，該探針來源廣泛、響應速度快、靈敏度高、選擇性好，在水環境中對肼檢測限低至69 nmol/L。同時還成功制備出了負載探針XN 的試紙條，借助便攜式紫外燈，通過人眼敏感的綠色熒光信號，實現了氣相中肼蒸氣的梯度檢測。最后，利用探針XN 對肼的高選擇性，建立了一個簡便的防偽模型，展現了探針在防偽識別中的應用潛力。