基于網絡藥理學探究防己茯苓湯治療腎病綜合征的成分與機制

楊長游，湯婷婷，劉秋美，黃遵楠

廣東醫科大學東莞市計算機輔助藥物設計重點實驗室，廣東 東莞 523808

腎病綜合征（nephrotic syndrome，NS）是指各種原因導致的、以大量蛋白尿（＞3.5 g/d）和低蛋白血癥（＜30 g/L）為主要癥狀的一組臨床癥候群，常常伴有水腫和高脂血癥。其流行病學顯示全球18歲以下兒童NS 發病率為（2~7）×10-5，微小病變型腎病是兒童NS 的主要類型（77%~85%）［1］。相關研究表明NS 的發病機制尚未完全明確，可能與免疫功能紊亂或腎小球足細胞損傷有關［2］。目前針對NS，糖皮質激素（glucocorticoid，GC）和免疫抑制劑是西醫用于治療的主要藥物，但長期使用會造成嚴重副作用，如感染、骨髓抑制、高脂血癥等［3］。因此，研究和開發具有顯著療效并能夠減輕激素副作用的藥物具有重要的診療意義。

中醫藥在治療NS 上具備獨特的作用，復方藥物遵循“君臣佐使”的經典配伍原則，能通過藥物間協同效應來減輕激素副作用和減緩疾病高復發率［4］。防己茯苓湯（fangji fuling decoction，FJFL）來自中醫古代藥典《金匱要略》，由茯苓、防己、黃芪、桂枝、甘草五味草藥加水煎煮而成，具有消除水腫，減輕蛋白尿的功效［5］。防己-茯苓是復方的核心組合，其成分具有利水消腫和改善腎臟病變的作用。 如Hattori 等［6］發現茯苓提取物pachyman 對大鼠原代抗腎小球基底膜的抗腎炎作用；Yu 等［7］發現防己成分中的粉防己堿能夠通過阻斷TRPC6 高表達減輕足細胞損傷。然而，盡管復方中相關成分具有一定的療效已被證實，但臨床上大多應用湯劑治療NS，復方整體治療NS的機制尚未明確。

網絡藥理學是研究中藥治療機制的新方法，它將經典的“單基因-單藥物-單疾病”的研究模式轉向為“多藥物-多靶點-多通路”的新模式，其基于靶點網絡的綜合分析與中藥配伍之間的協同作用和整體理念不謀而合［8］。本研究采用網絡藥理學與分子對接相結合的方法，通過對FJFL 的活性成分和作用靶點進行分析，探究其治療NS 的物質基礎和潛在藥理機制，為臨床治療提供理論依據；此外，天然化合物藥理網絡的構建和共同靶點的確定對探索FJFL 的“異病同治”和“同病異治”提供一定參考。

1 實驗部分

1.1 中藥復方活性成分的獲取

使用中藥系統藥理學數據庫TSCMP（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php），根據口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥ 30% 且藥物類藥性（drug likeness，DL）≥0.18 為標準［9］，篩選出防己茯苓湯（fangji fuling，FJFL）的相關活性成分。

1.2 復方靶標網絡的構建

利用TCMSP 數據庫中獲取FJFL 的活性成分靶標，對于沒有靶標的化合物，在PubChem 數據庫下載其化合物2D 結構，于SwissADME（http：//www.swissadme.ch/）進行藥物代謝動力學分析，滿足“Lipinski's Rule of Five”規則（分子量≤500；脂水分配系數≤5；氫鍵供體≤5；氫鍵受體≤10）后利用SwissTargetPrediction 分子預測平臺（http：//www.swisstargetprediction.ch/）進行靶點預測［10］，隨后使用Cytoscape（v3.7.2，https：//cytoscape.org/）軟件構建了FJFL 的“ 草藥-活性化合物- 靶點”（herbs-compounds-targets，HCT）網絡。

1.3 獲取疾病相關靶標

使用DisGenet 數據庫（https：//www.disgenet.org/home/），以“Nephrotic Syndrome”為關鍵詞收集NS 疾病靶點。另外，在基因表達綜合數據庫GEO（gene expression omnibus，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）檢索NS 基因表達數據，結果獲得來自平臺：GPL19983，系列：GSE108109，得到一個包含6 個健康人樣本的正常組和一個包含90個多種病理類型樣本的NS 組。選取該系列中正常組和NS 組之間腎小球mRNA 轉錄組差異表達的系列矩陣數據，利用GEO2R 分析差異基因，通過p< 0.05 且|log2 fold change（FC）|> 1 的標準篩選，獲取NS 的差異表達芯片［11］，再利用R 語言（v4.0.2，https：//www.r-project.org/）進行可視化。最終將兩個數據庫中獲得的靶點基因進行合并得到NS 靶點基因。

1.4 PPI作用分析與網絡構建

將復方FJFL 預測靶點和NS 疾病靶點進行交聯得到“FJFL-NS”的共同靶點，是FJFL 治療NS 的潛在靶點。使用String 數據庫（v11.0，https：//string-db.org/）獲得靶點蛋白質互作PPI（proteinprotein interaction）網絡。將結果導入Cytoscape軟件并使用其MCODE 插件對PPI 網絡進行模塊聚類分析，獲取網絡中最密集且具備潛在生物意義的蛋白質復合體，作為FJFL 治療NS 的核心網絡［12］。

1.5 KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）和GO（gene ontology）分析

將核心網絡靶點數據導入DAVID 數據庫（v6.0，https：//david.ncifcrf.gov/），進行GO 功能注釋和KEGG 通路富集分析［13］。GO 分析通過生物過程（biological process，BP），細胞組分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）3 個途徑對核心靶點基因進行注釋，了解基因富集的定位、途徑和功能。KEGG 分析用來探究核心靶點富集的潛在生物學信號通路，進一步了解FJFL 的治療機制。

1.6 分子對接

在“草藥-活性化合物- 靶點”HCT 網絡中，根據拓撲學參數Degree 值計算排名前五的核心化合物作為配體，分子配體結構來自PubChem 數據庫，使用ChemDraw 3D 軟件通過最小能量優化處理。將核心靶點網絡中所有靶點作為對接受體，于RCSB PDB 數據庫檢索和下載關鍵靶蛋白的3D結構文件，并進行蛋白質脫水、加氫、去除殘基等處理，再利用AutoDock Vina 軟件進行分子對接［14］。最后，通過結合自由能大小來評價“配體-受體”的結合程度，相關研究表明受體與配體之間低于-5.00 kcal/mol 的結合自由能具有較好的相互作用［15］，用Pymol（v2.5.0，https：//pymol.org/2/）軟件對最優的配體靶點對接姿勢進行可視化。

1.7 基于網絡的藥物-藥物關系鄰近度測量

藥物模塊是藥物發揮效應的基礎，兩種藥物及其靶點之間基于網絡的關系將有助于闡明有效藥物組合的作用機制。選擇基于人類PPI 網絡的高質量藥物組合測量基礎上使用分離度量（separation measure）來測量5 個核心化合物目標模塊的網絡接近度［4，16］。

其中：dAA和dBB代表目標模塊內的最短距離，dAB表示草藥A 和草藥B 目標對之間的最短距離，SAB表示草藥A 和草藥B 的網絡鄰近度。

2 結果與分析

2.1 成分與復方靶點網絡

TCMSP 數據庫中獲取到116 個復方活性化合物，包含茯苓14 個、防己6 個、桂枝7 個、甘草74個、黃芪15 個，刪除共同成分后，最終確定了106個活性化合物。對于復方化合物的預測靶標，刪除重復后獲得309 個。根據“草藥-活性化合物-靶點”HCT 網絡（圖1），絕大部分化合物包含2 個或以上的靶點（平均個數為17.3，從1~151 不等），具有較高的靶點集中趨勢，其中PTGS2 是Degree 值最高的靶點。根據拓撲學計算結果，排名前五的分別是槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、7-甲氧基-2- 甲基異黃酮（7-methoxy-2-methyl isoflavone）、芒柄花素（formononetin）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）。圖1 中GC 表示甘草，FL 代表茯苓，GZ 代表桂枝，HQ 代表黃芪，FJ 表示防己；菱形代表靶點，正方形代表草藥，圓形代表化合物。

圖1 草藥-化合物-靶點網絡Fig.1 Herbal-compound-target network

2.2 疾病的靶標與分析

通過GEO 數據庫中基因芯片GSE108109，確定了與NS相關的1 494個差異表達基因［圖2（a）］。此外，利用DisGenet 數據庫得到384 個與NS 相關靶點，合并兩個數據庫分析給出的基因并消除重復后得到NS 的1 835 個靶點。最后，將FJFL 的藥物靶點與NS 的309 個疾病靶點進行交聯，得到72個共同靶點［圖2（b）］。

圖2 NS 差異表達基因和潛在治療靶點：（a）NS 疾病組差異表達基因圖，（b）FJFL 與NS 靶點映射圖Fig.2 Differentially expressed genes and potential therapeutic targets of NS：（a）differentially expressed genes in NS disease，（b）targets mapping of FJFL to NS

2.3 PPI網絡分析

根據PPI 網絡分析得到一個包含71 個節點的PPI 網絡和一個游離網絡外的靶點（GABRA2）。MCODE 插件對PPI 網絡聚類分析后得到3 個重要模塊：一個包含30 個節點，397 條線的網絡，MCODE 得分為27.379；另外兩個均是包含3 個節點，3 條線的網絡，MCODE 得分均為3。最終選擇得分最高的模塊網絡作為FJFL 治療NS 的核心治療網絡（圖3），30個靶點被認定為核心靶點（表1）。

表1 核心靶點信息Tab.1 Core target information

圖3 FJFL 治療NS 的模塊分析結果圖Fig.3 Result diagram of module analysis of FJFL for treatment of NS

2.4 GO 功能分析和KEGG 通路分析

GO 富集分析確定了核心目標涉及生物過程215 個，細胞組分14 個，分子功能28 個（p<0.05）。結果顯示：生物過程富集于RNA 聚合酶II 啟動子轉錄的正調控、血管生成、炎癥反應等；細胞組分包括細胞外間隙、細胞質、細胞膜等；分子功能涉及細胞因子活性、生長因子活性等。將GO 分析生物過程前15 個分析結果進行可視化（圖4）。KEGG 富集分析確認30 個核心靶點參與84 條信號通路（false discovery rate，FDR＜0.05），將前20條信號通路可視化（圖5）。根據查閱與NS 相關研究，最終得到與NS 高度相關的21 條通路，主要是VEGF 信號通路、NF-κB 信號通路和HIF-1 信號通路等，涉及缺氧、細胞凋亡、炎癥因子等多種生理模塊，對結果構建“核心化合物-核心目標-信號通路”網絡圖（圖6）。值得一提的是，靶點NR3C1 游離該網絡之外。

圖4 FJFL 治療NS 的GO 分析圖Fig.4 Gene Ontology analysis of FJFL

圖5 FJFL 治療NS 的KEGG 通路分析圖Fig.5 Diagram of KEGG pathway analysis of FJFL

圖6 核心化合物-核心靶點-信號通路圖Fig.6 Diagram of core compounds-targets-signaling pathway

2.5 分子對接

分子對接結果表明5 個核心化合物與核心網絡靶點都具有很好的結合活性（見表2），各化合物最優對接結果分別為NOS3_quercetin，其結合能為-9.6 kcal/mol；7-Methoxy-2-methyl isoflavone_PTGS2，其 結 合 能 為 -8.4 kcal/mol；Beta-Sitosterol_MAPK1，其結合能為-9.1 kcal/mol；formononetin_PTGS2，其結合能為-9.5 kcal/mol。另外化合物kaempferol的最優對接結果有兩個，分別是Kaempferol_PTGS2 和Kaempferol_NOS3，其結合能均為-9.4 kcal/mol。這6 個配體和靶點的對接姿勢請見圖7。

表2 FJFL 治療NS 的核心成分與關鍵靶點分子對接結果表Tab.2 Molecular docking results of core compounds and key targets of FJFL in treatment of NS kcal/mol

圖7 5 個核心化合物最優對接姿勢圖：（a）槲皮素和NOS3 蛋白，（b）山奈酚和PTGS2 蛋白，（c）山奈酚_NOS3，（d）7-甲氧基-2-甲基異黃酮和PTGS2 蛋白，（e）芒柄花素和PTGS2 蛋白，（f）β-谷甾醇和MAPK1 蛋白Fig.7 Best docking pose diagrams of five core compounds：（a）quercetin_NOS3，（b）Kaempferol_PTGS2，（c）kaempferol_NOS3，（d）7-methoxy-2-methyl isoflavone_PTGS2，（e）formononetin_PTGS2，（f）Beta-Sitosterol_MAPK1

2.6 基于網絡的鄰近度測量

在經實驗驗證的藥物-靶點相互作用的公開數據中包含核心化合物中的quercetin（DrugBank_ID：DB04216）和 kaempferol（DrugBank_ID：DB01852），其分別有58 和19 個潛在靶標，它們間共同靶標達13 個。選定以quercetin-kaempferol為例，探究兩種核心化合物之間是否具備這種分子相關性。經過計算得到quercetin-kaempferol 的S（AB）為-0.054，這表明它們在人類PPI 網絡中的網絡鄰近度較高（圖8）。

圖8 基于網絡的鄰近度測量圖：（a）槲皮素和山奈酚靶點網絡，（b）槲皮素中靶點最短距離，（c）山奈酚中靶點最短距離，（d）槲皮素與山奈酚最小網絡鄰近度Fig.8 Network based proximity measure plots：（a）target network of quercetin and kaempferol，（b）minimum distance between targets in quercetin，（c）minimum distance between targets in kaempferol，（d）minimum network proximity between quercetin and kaempferol

3 討 論

NS 是美國終末期腎病的主要病因之一，大多數NS 患者疾病后期會出現對皮質類固醇耐藥，繼而導致疾病反復發作，極大程度上地降低了患者生活質量并增加了腎臟疾病進展惡化的風險［17］。FJFL 在NS 治療中可顯著改善NS 患者的臨床癥狀，促使腎功能恢復。相關實驗表明，防己茯苓湯能顯著降低ANP、β2-微球蛋白、Cys C 水平來保護病損腎臟［18］。然而，FJFL 治療NS 的具體機制仍待明確。本研究采用網絡藥理學和分子對接方法探究“復方-靶點-疾病”之間的關系，揭示FJFL 對NS 的潛在治療機理。

藥物與疾病之間的共同靶點是聯系兩者的關鍵橋梁，多靶點藥物聯合治療成為新的趨勢。本研究結果顯示HCT 網絡有超過87 個化合物的靶點集中于PTGS2、ESR1、MAPK14，且同時包含三者的化合物達33 個，而PPI 網絡分析結果表明PTGS2、ESR1、MAPK14 同樣隸屬于核心靶點網絡。環氧合酶2（PTGS2/COX-2）在腎臟生理學中起重要作用，COX-2 的過表達易導致腎小球足細胞損傷，而COX-2 抑制劑可以減少腎病實驗模型中的蛋白尿［19］。ESR1 是雌激素受體，雌激素與其受體ESR1 結合能抑制小鼠腎足細胞PTPRO 表達，使JAK/STAT 信號通路失活，而促進腎小球足細胞增殖達到減輕NS 的效果，針對雌激素信號通路來預防NS 已成為一個新的熱點［20］。MAPK14和MAPK1 同屬于絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶家族，能通過激活炎癥通路等途徑引起蛋白尿，p38 MAPK 抑制劑在體外和體內實驗對減少足細胞損傷和蛋白尿中發揮重要作用［21-22］。進一步對靶點進行KEGG 富集分析，結果表明FJFL 治療NS 的機制可能與VEGF 、NF-κB 和HIF-1 信號通路有關。 其中血管內皮因子（vascular endothelial growth factor ，VEGF）與NS 密切相關，足細胞中VEGF164的過表達誘導nephrin 和MMP9 下調將導致小鼠出現蛋白尿和腎小球損傷［23］。炎癥因子的激活會加重NS 的腎損傷，NF-κB 在NS 幼鼠體內的高表達促進了炎癥因子IL-1、IL-6 等增加，加重腎損傷，而抑制NF-κB 表達可以減輕蛋白尿和腎損傷［24-25］。 缺氧誘導因子（hypoxia-inducible factor ，HIF）主要存在于足細胞和內皮細胞中，抑制HIF-1 信號通路而導致HIF 的降解對腎臟具有保護作用［26］。綜上，FJFL 極大可能通過效應關鍵靶點或激活靶點富集的信號通路等方式發揮治療作用。

靶點NR3C1 是30 個關鍵靶點中唯一一個游離在“核心化合物-核心靶點-信號通路”之外（表2，圖6），但不表明其不重要。NR3C1 是表達糖皮質激素受體（glucocorticoid receptor，GR）的基因原件，屬于核受體家族。糖皮質激素（glucocorticoid，GC）是臨床上治療NS 的最主要藥物，一方面，GC與GR 結合選擇性啟動GC 依賴性基因網絡來發揮效應；但另一方面，GC 也能通過結合GR 片段GRα引起反式激活并以此介導副作用發生，如骨質疏松癥等［27］。因此不能忽略NR3C1 是復方發揮效應的重要機制。同時，天然化合物存在通過影響GR 的表達來達到減弱GC 介導的不良反應的作用；與人工合成化合物相比，天然植物化合物具備很少的副作用，更有可能通過反式阻遏的方式在發揮抗炎的同時減弱GC 的副作用，是選擇性GR調節劑的更好替代物［28-29］。更重要的是，中藥是靶向GR 天然化合物的重要來源，許多文獻中表明中藥對GC 介導的受體下調具有改善調節作用，如Ling 等［30］發現人參皂甙可逆轉地塞米松誘導的GR 下調，Sun 等［31］發現淫羊藿苷能通過促進GRα核轉位和上調GRα 表達抑制LPS 誘導的細胞炎癥反應，Liu 等［32］發現黃芪甲苷IV 在體內和體外都被證實能直接與GR 結合，并積極激活GR 介導的信號通路。因此，本研究進一步利用核心化合物和陽性治療藥物（皮質醇，cortisol）與GR 分子對接來對比分析核心化合物是否能通過與GR 有效結合進而發揮效應。PDB ID_ 4P6X 是PDB 數據庫中Cortisol 與GR 的結合復合物的晶體結構，描述了GC 與GR 結合的對接姿勢［33］。Cortisol 與GR上氨基酸位GLN-570、THR-739、GLN-642、ASN-564、ARG-611 產生氫鍵作用［圖9（a）］。在“Cortisol_GR”的活性結合口袋里，核心化合物中的kaempferol能夠與GR 較好的結合，且結合能達-9.0 kcal/mol，其局部相互作用力發現，kaempferol能夠與GR 上氨基酸位GLN-570、THR-739、MET-604 產生氫鍵作用［圖9（b）］。因此，Cortisol 和kaempferol 共享了與GLN-570 和THR-739 氨基酸位點的氫鍵結合。上述研究結果表明kaempferol能夠與GR 較好的結合，有潛力成為GR 的天然調節劑，但其是否在復方中通過減弱GC 介導的不良反應或上調GR 受體活性的機制產生的治療效果還有待進一步驗證。

圖9 分子對接局部作用圖：（a）皮質醇和糖皮質激素受體，（b）山奈酚和糖皮質激素受體Fig.9 Molecular docking local interaction maps：（a）Cortisol_GR，（b）Kaempferol_GR

Quercetin、Kaempferol、7-Methoxy-2-methyl isoflavone、Formononetin、Beta-sitosterol 是FJFL 起關鍵療效的核心化合物。不過臨床上并未使用單一化合物治療NS，復方的整體應用是發揮藥物間協同效應的關鍵。兩個藥物-靶標模塊之間的網絡鄰近度（SAB）能夠充分反映兩者的生物學和藥理學關系，明顯優于傳統的化學信息學和生物信息學方法。在基于人類PPI 互作內SAB提供了可靠的藥物-藥物關系（圖8），當S（AB）< 0 時，兩種藥物的靶點位于同一個網絡鄰域內，它們具備療效相似性；而對于S（AB）≥0，兩個藥物靶點在網絡拓撲上是分開的［4，16］。 本研究中Quercetin-Kaempferol 的計算結果為-0.054，這有效地說明了Quercetin 和Kaempferol 之間藥物-靶標模塊的效應重疊，表明它們很可能在化學特性、生物學功能和臨床特征方面具有相關性。除此之外，相關研究表明槲皮素和山柰酚是黃酮醇類物質的重要代表，在人癌細胞系中具備協同抗增殖作用［34］，這一研究與我們網絡藥理學分析認為兩者之間具備協同作用的結果相符。因此，雖然在臨床實驗和FDA 批準藥物中并未證明兩者可以作為藥物對使用，但基于這種分析模式認為在分子網絡上被證明是可行的，它們之間具備生物學和藥理學相似性。

4 結 論

本研究通過網絡藥理學初步探究FJFL 治療NS 的作用機制。通過確立了復方中quercetin，kaempferol，7-Methoxy-2-methyl isoflavone，formononetin，beta-sitosterol 等5 種成分為治療的核心化合物；通過PPI 網絡分析發現PTGS2、ESR1、MAPK14 等30 個靶點組成的核心治療網絡最有可能是治療NS 的機制網絡，主要涉及VEGF、NF-κB和HIF-1 等多條信號通路。分子對接顯示核心化合物和核心靶點具備很好的結合活性；通過對比Cortisol_GR 和Kaempferol_GR 的分子對接結果表明Kaempferol 與GR 受體結合域能良好結合，有潛力成為天然調節劑。對核心化合物Quercetin 和Kaempferol 進一步基于網絡的測量表明在化學特性、生物學功能和臨床特征方面具有很高的相關性，有成為藥物對使用的潛力。本研究為進一步探究FJFL 作用于腎病綜合征的潛在藥理機制提供了新思路，可供臨床應用提供參考，不過，但具體結論仍需要后續相關實驗進行證明。