復(fù)合菌分解低品位磷礦研究

周 娜，胡錦剛，池汝安，肖春橋*

1. 武漢工程大學(xué)環(huán)境生態(tài)與生物工程學(xué)院，湖北 武漢 430205；

2. 武漢工程大學(xué)興發(fā)礦業(yè)學(xué)院，湖北 武漢 430074

磷是作物生長發(fā)育不可或缺的元素，全國第二次土壤普查結(jié)果顯示我國75%的土壤缺磷［1］。化學(xué)磷肥的主要來源為磷礦石作為我國重要的產(chǎn)業(yè)原料和支農(nóng)工業(yè)，磷礦資源在我國的經(jīng)濟發(fā)展中占據(jù)著重要地位［2-3］。

我國磷礦總量雖然位居世界第二，但多數(shù)品位不高［4-6］，中低品位磷礦占到80%以上，這些磷礦難以分選和加工而成為高濃度磷肥或復(fù)肥［7］。我國中低品位磷礦的利用主要有選礦法、濕法、熱法、微生物法等［8-12］。其中，傳統(tǒng)的化學(xué)方法對設(shè)備、技術(shù)水平要求較高，且工藝大都較為復(fù)雜，易造成嚴重的污染問題［13］。與化學(xué)方法相比，微生物浸礦具有對環(huán)境友好、易操作成本低等特點［14］。解磷微生物能夠通過分泌有機酸、質(zhì)子交換、酶解作用等機制將難溶性的磷轉(zhuǎn)為可溶性的磷［15］，因此解磷微生物能夠充分利用中低品位磷礦，避免資源的浪費，緩解精礦缺乏的難題［16］。

20 世紀90 年代，我國就開始使用具有解磷能力的菌劑，目前關(guān)于解磷微生物的研究包括有解磷微生物對難溶性磷的分解能力、機理及應(yīng)用等［17-19］。除了對環(huán)境友好、節(jié)約礦產(chǎn)資源之外，將解磷菌及磷礦粉施入土壤，能夠增加土壤中的磷素［20-22］。同時可以增產(chǎn)作物提高作物抗逆性，固定土壤重金屬等［23-25］。

但迄今為止大多數(shù)研究都針對單一菌種，對復(fù)合菌的研究較少。微生物之間具有多種相互作用如協(xié)同、競爭、拮抗和寄生等，在復(fù)合菌中一種菌株的代謝產(chǎn)物或可作為其他菌株的能源物質(zhì)相互促進生長，多種菌株共同作用能夠促進污染物降解［26］，相比于單菌，復(fù)合菌功能更加穩(wěn)定高效［27］。基于上述背景，本研究選用了4 株解磷菌進行組合，篩選出解磷效果最佳的復(fù)合菌，并對該復(fù)合菌分解磷礦粉的條件進行了優(yōu)化。為復(fù)合菌在高效分解磷礦粉的應(yīng)用提供了參考。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

1.1.1 低品位磷礦 磷礦粉：實驗中所用低品位磷礦粉為來自湖北省宜昌市，將磷礦石磨碎過篩后取粒徑為0.074~0.150 mm 之間的磷礦粉作為實驗磷礦粉。低品位磷礦組成如表1 所示。

表1 低品位磷礦粉的主要組成及質(zhì)量分數(shù)Tab.1 Main components and mass fractions of low-grade phosphate ore%

1.1.2 實驗菌株 實驗菌株為本實驗室從湖北省宜昌某磷礦廢棄地中篩選的解磷菌株，分別為假單胞菌LA（PseudomonasLA），棘孢木霉LZ1（Trichoderma aculeatusLZ1），巨大芽孢桿菌EC3（Bacillus megateriumEC3），沙雷氏菌LX1（SerratiaLX1）。為方便后續(xù)實驗，依次編號為A、B、C、D。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB 培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。PKO培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g，酵母浸粉0.5 g，（NH4）2SO40.5 g，KCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，CaCl21.0 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，Ca3（PO4）25 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。磷礦粉培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g，（NH4）2SO40.5 g，MgSO4?7H2O 0.3 g，KCl 0.3 g，NaCl 0.3 g，F(xiàn)eSO4?7H2O 0.03 g，磷礦粉10 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

1.2 實驗方法

1.2.1 解磷復(fù)合菌篩選 將假單胞菌LA（PseudomonasLA），棘孢木霉LZ1（Trichoderma aculeatusLZ1），巨大芽孢桿菌EC3（BacillusmegateriumEC3），沙雷氏菌LX1（SerratiaLX1），分別在LB 培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)至對數(shù)期，按照表2 復(fù)合菌株組合方案，取菌液總量為4 mL，各菌株間菌液體積比為1∶1，接入至含50 mL PKO 培養(yǎng)液的錐形瓶中，將錐形瓶置于恒溫搖床中，30 ℃、165 r/min培養(yǎng)7 d，在第3、5、7 d 取樣測量pH、可溶磷質(zhì)量濃度，重復(fù)3 次。

表2 菌株的組合方案Tab.2 Schemes of strain's combination

1.2.2 不同復(fù)合菌組合方式對復(fù)合菌解磷效果的影響 組合方式：①先培養(yǎng)后組合：將各菌株先在不同LB 培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)至對數(shù)期，再各取1 mL菌液進行混合，接入含50 mL PKO 培養(yǎng)基的錐形瓶中培養(yǎng)；②先組合再培養(yǎng)：將各菌株接入同一LB培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)期，再取等量混合培養(yǎng)菌液至含50 mL PKO 培養(yǎng)基的錐形瓶中培養(yǎng)。選取3 組解磷效果最好的解磷復(fù)合菌進行上述實驗，30 ℃、165 r/min 培養(yǎng)7 d，每天取樣測量可溶磷質(zhì)量濃度。

1.2.3 碳源和氮源對復(fù)合菌解磷效果的影響 以PKO 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，選取解磷效果最佳的復(fù)合菌，控制單一變量，分別在不同碳源（葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉和果糖）和不同氮源（尿素、硫酸銨、氯化銨和蛋白胨）條件下，將篩選出的最佳解磷復(fù)合菌于30 ℃、165 r/min 恒溫搖床中培養(yǎng)7 d，測定可溶磷質(zhì)量濃度。

1.2.4 復(fù)合菌分解低品位磷礦的條件優(yōu)化 單因素實驗：以解磷效果最佳的復(fù)合菌進行實驗，在不同接種量（4%、10%、15%、20%和25%）、初始pH（5、6、7、8和9）、碳源質(zhì)量濃度（0、5、10、15和20 g/L）和氮源質(zhì)量濃度（0.2、0.3、0.4、0.5 和0.6 g/L）條件下，于30 ℃，165 r/min 將解磷復(fù)合菌在磷礦粉培養(yǎng)基種培養(yǎng)7 天，測定可溶磷質(zhì)量濃度。正交實驗：根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選取對復(fù)合菌解磷影響較大的因素設(shè)計正交實驗，具體見表3。

表3 復(fù)合菌解磷條件優(yōu)化正交實驗設(shè)計Tab.3 Orthogonal experimental design for optimization of phosphate solubilizing conditions by complex bacteria

1.3 測試方法

用梅特勒Seven Compact pH 計S210 測量待測樣的pH 值；利用釩鉬酸銨比色法檢測可溶磷質(zhì)量濃度；用Excel 2019、SPSS 18.0 和Origin 2019 進行了數(shù)據(jù)分析和作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 解磷復(fù)合菌篩選

由表4 可知，復(fù)合菌AB、AC 和ABC 在第5 d的適合可溶磷質(zhì)量濃度分別為354.30、397.86 和347.51 mg/L，均高于單菌，菌株ABC 間具有良好的協(xié)同作用。同時，復(fù)合菌的解磷效果并不都優(yōu)于單菌株。菌株D 與菌株ABC 復(fù)合時，可溶磷質(zhì)量濃度均低于單菌，表現(xiàn)出強的拮抗作用。由此并不是組合內(nèi)的菌株越多，解磷效果就越好［28］，這與菌株間的相互作用有關(guān)，需要進一步研究。

表4 不同組合復(fù)合菌解磷效果Tab.4 Phosphate solubilizing effects of different complex bacteria

利用相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)可溶磷質(zhì)量濃度和pH 之間呈顯著負相關(guān)（r=-0.840，p<0.01）。菌液中的pH 值越低，解磷效果相對越好。通過分泌有機酸來分解難溶性磷酸鹽是解磷微生物的主要解磷途徑之一，這與秦利均等［29］的研究結(jié)果一致，分解程度與酸度密切相關(guān)，即菌株產(chǎn)酸能力越強，酸度越大，可溶磷質(zhì)量濃度越高，反之越低。

2.2 不同復(fù)合菌組合方式對復(fù)合菌解磷效果的影響

從圖1 中可以看出，先培養(yǎng)后組合解磷效果明顯優(yōu)于先組合后培養(yǎng)（p<0.01）。圖1（a）中，復(fù)合菌AB 以方式①進行復(fù)合，可溶磷質(zhì)量濃度最高達到263.05 mg/L；以方式②進行復(fù)合，可溶磷質(zhì)量濃度最高為248.03 mg/L；且在相同培養(yǎng)時間內(nèi)，方式①的可溶磷質(zhì)量濃度均高于方式②。圖1（b）中，復(fù)合菌ABC 以方式①進行復(fù)合，其可溶磷質(zhì)量濃度最高達到276.74 mg/L；以方式②進行復(fù)合，可溶磷質(zhì)量濃度最高為160.52 mg/L。圖1（c）中，復(fù)合菌AC 以方式①進行復(fù)合，可溶磷質(zhì)量濃度最高達到360.53 mg/L；以方式②進行復(fù)合，可溶磷質(zhì)量濃度為327.89 mg/L；且在相同培養(yǎng)時間內(nèi)，按方式①組合的復(fù)合菌的可溶磷質(zhì)量濃度均高于方式②。這可能是因為菌株在營養(yǎng)充足的條件下單獨培養(yǎng)至對數(shù)期，再接入解磷培養(yǎng)基，此時各菌株的生長狀態(tài)較好［30］，各菌株的接種比例較易控制，接種量相對平衡，解磷效果較好。將各菌株先共同培養(yǎng)，各菌株的接種量難以控制，且可能會因為在生長初期競爭營養(yǎng)成分，各菌株生長情況不穩(wěn)定，解磷效果相對較差。同時研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合菌AC 的解磷效果最好，且效果穩(wěn)定。結(jié)合表4，后續(xù)實驗以復(fù)合菌AC 為研究對象。

圖1 菌株不同接入方式對可溶磷質(zhì)量濃度的影響：（a）復(fù)合菌AB，（b）復(fù)合菌ABC，（c）復(fù)合菌ACFig.1 Effects of different inoculation methods on soluble phosphate mass concentrations of complex AB（a），complex ABC（b），complex AC（c）

2.3 碳源和氮源對解磷復(fù)合菌溶磷效果的影響

由圖2（a）可知，當以蔗糖為碳源時，復(fù)合菌AC 的解磷效果最佳，培養(yǎng)液中可溶磷質(zhì)量濃度為355.63 mg/L。其次是以葡萄糖為碳源時，培養(yǎng)液中可溶磷質(zhì)量濃度為341.94 mg/L。以可溶性淀粉和果糖為碳源時，復(fù)合菌AC 仍有一定的解磷效果，培養(yǎng)液中可溶磷質(zhì)量濃度分別為246.15 和229.97 mg/L。以蔗糖和葡萄糖為碳源時，其溶磷效果差異不顯著，但考慮到蔗糖價格低于葡萄糖，選用蔗糖為復(fù)合菌AC 的碳源。

圖2 不同碳源和氮源對可溶磷質(zhì)量濃度的影響Fig.2 Effects of different carbon and nitrogen sources on mass concentration of soluble phosphate

由圖2（b）可知，當以硫酸銨和蛋白胨為氮源時，培養(yǎng)液中可溶磷質(zhì)量濃度分別為338.13 和329.05 mg/L，差異不顯著。以氯化銨和尿素為氮源時，復(fù)合菌AC 的解磷效果不佳，培養(yǎng)液中可溶磷質(zhì)量濃度分別為260.76 和161.42 mg/L。可能是因為氯離子對微生物的有一定的毒性［31］，且復(fù)合菌AC 對尿素的利用率不高。綜合成本考慮，選用硫酸銨作為復(fù)合菌AC 的氮源。

2.3 復(fù)合菌分解低品位磷礦的條件優(yōu)化

2.3.1 單因素實驗結(jié)果 單因素實驗結(jié)果表明，接種量、初始pH、碳源質(zhì)量濃度及氮源質(zhì)量濃度對復(fù)合菌AC 解磷效果均有影響。如圖3（a）所示，隨著接種量的增加，培養(yǎng)液中可溶磷質(zhì)量濃度先增大后減少，在接種量為10%時，解磷效果最佳，可溶磷質(zhì)量濃度為359.37 mg/L。這可能是菌株的接種量較大時，更早到達穩(wěn)定期，從而消耗培養(yǎng)液中的可溶磷，導(dǎo)致可溶磷質(zhì)量濃度的降低。如圖3（b）所示，可溶磷質(zhì)量濃度隨著pH 的增加而減少，pH越低，解磷效果越好。在培養(yǎng)液初始值為5 時，解磷效果最佳，為315.93 mg/L。如圖3（c）所示，隨著碳源質(zhì)量濃度的增加，培養(yǎng)液中可溶磷質(zhì)量濃度先增加后減小，在碳源質(zhì)量濃度為10~15 g/L時，解磷效果較好，最高為329.92 mg/L。這可能是適量的碳源質(zhì)量濃度對微生物的生長有促進作用，過高的碳源可能會對微生物的生長產(chǎn)生抑制［32］。如圖3（d）所示，隨著氮源（硫酸銨）質(zhì)量濃度的增加，可溶磷質(zhì)量濃度先增加后減小，在氮源質(zhì)量濃度為0.5 g/L 時，解磷效果最佳，可溶磷質(zhì)量濃度為347.37 mg/L。氮源質(zhì)量濃度過高，會導(dǎo)致培養(yǎng)液中的游離氨濃度升高，從而抑制菌株活性［33］；而過低又無法提供充足的生長條件。因此，需要選擇適量的氮源質(zhì)量濃度。

圖3 單因素實驗結(jié)果：（a）接種量，（b）pH，（c）碳源質(zhì)量濃度，（d）氮源質(zhì)量濃度Fig.3 Single-factor experiment results：（a）inoculation amount，（b）pH，（c）carbon source mass concentration，（d）nitrogen source mass concentration

2.3.2 正交實驗結(jié)果 為了優(yōu)化復(fù)合菌株AC 分解磷礦粉的最佳條件，根據(jù)以上單因素實驗，結(jié)合正交實驗，所得結(jié)果如表5。可以看出對可溶磷質(zhì)量濃度的影響順序為：接種量>碳源質(zhì)量濃度>氮源質(zhì)量濃度>初始pH，其中最優(yōu)方案組合為復(fù)合菌AC 的接種量（10%）、碳源質(zhì)量濃度（10 g/L）、氮源質(zhì)量濃度（0.5 g/L）、初始pH 5。

表5 復(fù)合菌培AC 養(yǎng)條件正交實驗結(jié)果Tab.5 Results of orthogonal experiment of complex bacteria culture conditions

3 結(jié) 論

（1）復(fù)合菌AB、AC 和ABC 在第5 d 的可溶磷質(zhì)量濃度達到最高，分別為354.30、397.86 和347.51 mg/L，均高于單菌，菌株ABC 間具有良好的協(xié)同作用。復(fù)合菌的解磷效果并不都優(yōu)于單菌株。菌株D 與菌株ABC 復(fù)合時，其可溶磷質(zhì)量濃度均低于單菌，表現(xiàn)出強的拮抗作用。菌株的解磷能力與菌株的產(chǎn)酸能力顯著相關(guān)。

（2）不同復(fù)合菌組合方式對復(fù)合菌解磷效果有顯著影響。以先培養(yǎng)后組合的方式組合的復(fù)合菌解磷效果明顯優(yōu)于以先組合再培養(yǎng)的復(fù)合菌解磷效果。復(fù)合菌AC 解磷效果最佳，且解磷效果最穩(wěn)定。

（3）篩選出了解磷效果最佳且最穩(wěn)定的復(fù)合菌株AC，即假單胞菌LA（PseudomonasLA），巨大芽孢桿菌EC3（Bacillus megateriumEC3）。該組復(fù)合菌株在第5 d可溶磷質(zhì)量濃度可達397.86 mg/L，后續(xù)實驗表明其解磷效果穩(wěn)定。同時，復(fù)合菌AC的最適碳源和氮源分別為蔗糖和硫酸銨。

（4）單因素實驗表明初始接種量、初始pH、碳源質(zhì)量濃度和氮源質(zhì)量濃度對復(fù)合菌AC 解磷效果有顯著影響。綜合正交試驗分析發(fā)現(xiàn)，影響復(fù)合菌AC 解磷效果的影響因子主次順序為：接種量>碳源質(zhì)量濃度>氮源質(zhì)量濃度>初始pH，復(fù)合菌分解低品位磷礦的最優(yōu)條件為：復(fù)合菌接種量10%、蔗糖質(zhì)量濃度10 g/L、硫酸銨質(zhì)量濃度0.5 g/L、初始pH 5。