敲低S100A9對大鼠腦缺血再灌注損傷、炎癥反應的影響及其機制

楊越，潘燕，叢麗娜，白楊

新疆醫科大學附屬第五醫院神經內科，烏魯木齊 830001

腦缺血再灌注損傷是由缺血腦組織的血液再灌注引起炎癥因子大量釋放所致，多發生于缺血性疾病的治療階段，可加重腦組織損傷，導致長期殘疾甚至死亡［1］。S100是一組具有相似結構和功能的低分子量修飾結合蛋白，家族成員S100A9參與機體細胞凋亡、免疫炎癥反應和胚胎發育，并可通過觸發特定的信號通路，導致炎癥因子如白細胞介素6（IL-6）、IL-1β 及腫瘤壞死因子α（TNF-α）的上調［2-3］。有研究發現，S100A9 在大腦中動脈閉塞（MCAO）模型大鼠腦組織中顯著上調，觸發TLR-4 或RAGE 介導的多種炎癥通路，加劇腦缺血灌注再損傷［4］。作為炎癥反應和免疫調節的主導信號途徑，NF-κB 信號通路由介導多種細胞過程的重要轉錄因子組成，在典型的NF-κB 信號通路中，炎癥細胞因子和趨化因子的多種刺激可激活p65、p50 及cRel 亞基［5］。MyD88作為一種保守的細胞內受體，在先天免疫系統中發揮重要作用，其可向toll樣受體及IL-1受體下游傳遞信號，激活NF-κB信號通路，維持不同階段的免疫強度和免疫穩態［6］。然而，缺血性腦卒中后S100A9 表達升高調控炎癥反應的相關通路以及具體機制仍有待進一步研究。2022 年2 月—11 月，本研究通過敲低MCAO 模型大鼠腦組織中S100A9表達，觀察其對大鼠神經功能、腦梗死體積、腦組織炎癥細胞因子及NF-κB 信號通路相關蛋白的影響，以期為進一步明確腦缺血再灌注損傷的作用機制提供實驗證據。

1 材料與方法

1.1 主要材料 SPF 級SD 雄性大鼠30 只，體質量180～220 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供；TTC 染料、SYBR green qPCR、Western blotting實驗相關試劑及IL-6、IL-1β、TNF-α ELISA檢測試劑盒（武漢默沙克）；p65、磷酸化p65（p-p65）、MyD88及GAPDH抗體（北京中山金橋）；PVDF膜（德國默克）；生理記錄儀（美國BioPac）；腦立體定位儀（美國Stolelting）；實時熒光定量PCR（qPCR）儀（美國Thermo Fisher Scientific）；Western blotting 實驗相關的全套電泳儀、電泳槽、標準濕式轉膜裝置（美國Bio-Rad）；裂解緩沖液（美國Cell Signaling Technology）；細胞核和細胞質提取試劑盒（上海Beyotime Biotechnology）。

1.2 動物分組與MCAO 模型制備 大鼠隨機分為假手術組（6 只）、模型組（6 只）、Lsh-NC 組（9 只）、Lsh-S100A9 組（9 只）。模型組、Lsh-NC 組、Lsh-S100A9 組采用線栓法制備MCAO 模型，大鼠在手術前禁食12 h之后，經腹腔注射10%水合氯醛（300 mg/kg）麻醉大鼠。將大鼠固定在仰臥位，通過頸正中切口暴露并分離右側頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈。將一根2.5 號尼龍單絲通過頸總動脈插入頸內動脈內，阻塞右側大腦動脈。隨后移除尼龍單絲，閉塞2 h后再灌注24 h。假手術組不插栓，僅暴露頸總動脈及埋線處理。

1.3 大鼠腦組織慢病毒轉染 在造模24 h 后將S100A9 敲低慢病毒及空載體分別注入Lsh-S100A9組、Lsh-NC 組大鼠腦內，注入速度為0.2 μL/min，總量為3 μL。定位坐標為前囟后3.6 mm，側向2.0 mm，背向2.8 mm。每當針頭定位后或是準備拔出前都停留1 min，注射結束后縫合傷口。

1.4 大鼠腦組織S100A9 mRNA 檢測 采用RTqPCR 法。慢病毒轉染30 min 后，3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，取腦組織100 mg，TRIzol法提取組織總RNA，微量核酸測定儀檢測總RNA 的純度、濃度。按照M-MLV 試劑盒說明書操作將總RNA 進行逆轉錄合成cDNA，qPCR 實驗進行擴增反應，具體參照qPCR 擴增試劑盒說明配制反應體系。引物序列：S100A9 上游引物5'-GCAGCATAAGCACCATCATCAAT-3'，下游引物5'-ACTTTCCCATCAGCATCATACACTC-3'；GAPDH 上游引物5'-GCCTTCCGTGTTCCTACCCC-3'，下 游 引 物 5'-CGCCTGCTTCACCACCTTCT-3'。以GAPDH 為內參，按2-ΔΔCt計算S100A9 mRNA相對表達量。

1.5 神經功能缺損程度評價 采用NSS 評分標準對大鼠神經功能缺損程度進行評價。0 分：神經功能正常；1 分：輕度神經功能缺損（提尾時左前肢屈曲）；2 分：中度神經功能缺損（行走時向左側轉圈）；3分：中度神經功能缺損（向左側傾斜）；4分：無自發行走，意識減退；5分：死亡。

1.6 大鼠腦組織梗死體積測算 采用TTC 染色。各組麻醉后打開其胸腔，用4%多聚甲醛從心尖部灌注。接下來，將灌注后的大腦在4%多聚甲醛中固定2 d，浸入30%的蔗糖溶液中。用切片機切出30 μm的切片，-20 ℃冰箱保存。在黑暗中于37 ℃下用1% TTC染色15～20 min。將TTC染色的大腦在室溫下用4%甲醛固定24 h，并用數碼相機拍照。使用Image J 軟件分析梗塞體積，遵循雙盲原則。計算公式：梗死體積百分比=100%×（左側半球正常腦容積-右側半球正常腦容積）/左側半球正常腦容積。

1.7 大鼠腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α 檢測 采用ELISA 法。由缺血處腦組織獲得實驗樣本后進行全蛋白提取，收集培養物上清液，保存在-80 ℃冰箱直至使用。ELISA 法檢測各組大鼠腦組織內IL-1β、IL-6、TNF-α 用于評估炎癥水平，各項操作嚴格按照ELISA試劑盒的說明進行。

1.8 大鼠腦組織p65、p-p65 及MyD88 蛋白檢測采用Western blotting 法。使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解緩沖液裂解和提取Lsh-NC 組及Lsh-S100A9 組缺血側腦組織的蛋白質，使用細胞核和細胞質提取試劑盒提取細胞核和細胞質蛋白。蛋白質通過10%～12% SDS-PAGE 分離并轉移至PVDF 膜，在室溫下用TBST 中的5%脫脂奶粉封閉1.5 h 后，將膜與一抗在4 ℃下孵育過夜。在次日用TBST洗膜，滴加對應二抗，室溫1 h。使用Image J軟件分析條帶灰度值，以GAPDH 作為內源性對照，以目的條帶與對照條帶灰度比值作為目的蛋白相對表達量。

1.9 統計學方法 采用GraphPad Prism7 統計軟件。計量資料采用Shapiro-Wilk 法行正態性檢驗，呈正態分布的數據以-x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組S100A9 mRNA 表達比較 假手術組、模型組、Lsh-NC 組、Lsh-S100A9 組S100A9 mRNA 表達分別為0.84 ± 0.22、1.56 ± 0.35、1.47 ± 0.48、0.33 ±0.23；S100A9 表達模型組、Lsh-NC 組＞假手術組＞Lsh-S100A9組（P均＜0.05）。

2.2 各組神經功能缺損程度評分比較 假手術組、模型組、Lsh-NC 組、Lsh-S100A9 組神經功能缺損程度評分分別為（0.00 ± 0.00）、（4.00 ± 0.82）、（4.33 ±0.47）、（1.33 ± 0.47）分；神經功能缺損程度評分模型組、Lsh-NC 組＞Lsh-S100A9 組＞假手術組（P均＜0.05）。

2.3 各組腦梗死體積比較 模型組、假手術組、Lsh-NC 組、Lsh-S100A9 組缺血側腦梗死體積分別為48.95% ± 2.82%、0.00% ± 0.00%、48.41% ±6.96%、26.94% ± 3.92%；缺血側腦梗死體積模型組、Lsh-NC 組＞Lsh-S100A9 組＞假手術組（P均＜0.05）。

2.4 各組腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α 表達比較 腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α 表達模型組、Lsh-NC 組＞Lsh-S100A9組＞假手術組（P均＜0.01）。見表1。

表1 各組腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α表達比較（）

表1 各組腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α表達比較（）

注：與假手術組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

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2.5 Lsh-NC 組、Lsh-S100A9 組腦組織p65、p-p65 及MyD88 蛋白表達比較 Lsh-S100A9 組腦組織pp65、MyD88 蛋白表達低于Lsh-NC 組（P均＜0.01），兩組腦組織p65表達差異無統計學意義。見表2。

表2 各組腦組織p65、p-p65及MyD88蛋白表達比較（-x ± s）

3 討論

腦卒中是導致中老年人死亡和殘疾的主要原因之一，具有起病急、發展迅速、預后差的特點。對于高致殘率和高病死率的腦卒中疾病，常以恢復血液供應為主要治療手段，然而，恢復血液供應過程中不可避免地會引起腦缺血再灌注損傷［7］。因此，尋找新的治療方法、有效的生物標志物以及新的干預靶點非常有必要。本研究結果顯示，S100A9 mRNA 在MCAO 模型腦組織中上調，可通過增加腦梗死體積和損傷神經功能來促進大腦發生缺血再灌注損傷，這與之前研究一致［2，8］。本研究同時發現，抑制S100A9 的表達可以有效降低腦缺血再灌注損傷引起的炎癥，減少腦梗死體積，降低神經功能缺損評分，提示S100A9能夠通過升高炎癥因子的表達發揮促炎作用。S100A9 作為一種低分子量修飾結合蛋白，可介導許多炎癥反應的調控，具有促炎作用，與之前報道一致［9-10］。

越來越多的證據表明，炎癥反應會導致腦缺血再灌注后發生繼發性腦損傷［11］。來自大腦皮層的免疫效應細胞會產生并釋放大量促炎因子，如IL-1β、TNF-α 和IL-6等。這些促炎因子會啟動并加重炎癥反應，進一步加重腦損傷［12］。因此，減少促炎因子的產生和釋放是減輕缺血再灌注損傷的有效治療手段［13］。有研究表明，在缺血性腦損傷期間上調TNF-α、IL-1β 皆可加重腦損傷，而在使用相應的中和抗體后，損傷程度明顯降低［3，14］。研究顯示，S100A9能夠誘導MyD88 受體復合物從細胞質轉移到細胞膜，并與活性受體相互作用，從而激活NF-κB信號通路，刺激炎癥因子產生［15］。近期研究發現，S100A9可通過誘導RAGE 受體的表達并與其結合，激活NF-κB 信號通路，介導炎癥因子的產生，在免疫、炎癥反應中起到關鍵作用［16］。p65 及MyD88 作為NF-κB 通路的關鍵因子能夠很好地反映S100A9 對NF-κB 通路的調控作用。p65 在細胞內定位于細胞質中，并與IκB蛋白結合在一起，形成非激活狀態的NF-κB復合物，當NF-κB 通路被激活時，p-p65 的表達升高［5-6］；而信號分子MyD88 通過觸發IκB 的降解，促使NF-κB 復合物進入細胞核并激活特定的基因，從而調控免疫和炎癥反應。

本研究通過構建大鼠MCAO 模型發現，造模引起大鼠腦梗死體積增多，大鼠神經功能缺損程度升高；而與Lsh-NC 組比較，S100A9 慢病毒干預可顯著降低MCAO大鼠腦梗死體積和大鼠神經功能缺損評分。采用ELISA 法檢測炎癥因子水平可見，與假手術組比較，MCAO模型大鼠腦組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 表達升高，而Lsh-S100A9 組中炎癥因子表達降低。qPCR 結果顯示，相較于假手術組，S100A9 表達在模型組中上調，S100A9 敲低慢病毒干預后腦組織中S100A9表達降低。上述結果提示，在腦缺血再灌注損傷發生后，S100A9 表達升高，敲低S100A9表達可以抑制炎癥因子表達，改善大鼠腦缺血再灌注損傷。我們進一步采用Western blotting法檢測Lsh-NC 組和Lsh-S100A9 組大鼠腦組織中p-p65、p65 及MyD88 的蛋白表達，發現與LSh-NC 組比較，LSh-S100A9 組大鼠腦組織中p-p65、MyD88 蛋白表達下調，提示S100A9可能通過上調促炎細胞因子促進腦缺血再灌注損傷并可能通過調控NF-κB信號通路影響炎癥。

綜上所述，S100A9 在MCAO 模型大鼠腦組織中表達升高，敲低S100A9 可減輕腦組織炎癥、神經功能缺損程度及梗死體積，減輕大鼠腦缺血再灌注損傷，其機制可能與調控NF-κB 信號通路影響炎癥反應有關。S100A9 或可成為腦缺血再灌注損的潛在治療靶點發揮作用。但是，本研究只進行了敲低S100A9 對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織影響的體外實驗，存在一定的局限性，未對S100A9 如何通過NF-κB信號通路影響炎癥反應的具體生物學行為做更深入的探討，這些問題我們將在后續實驗中更進一步進行研究。