槲皮素腹腔注射對大鼠視網膜缺血再灌注損傷的影響及其機制

于雯，陳肖君，肖正霞，孫艷，夏飛，李娜

1 濰坊醫學院附屬醫院臨床醫學院，山東濰坊 261000；2 濟南市第二人民醫院眼科

視網膜缺血再灌注損傷（RIRI）是青光眼、糖尿病性視網膜病變及缺血性視神經病變等眼科疾病的常見病理特征［1］，視網膜缺血后恢復血液供應會進一步導致組織受損，從而對患者的視力造成嚴重損傷。炎癥、氧化應激及細胞凋亡在缺血再灌注這一過程中起著重要作用［2］。視網膜高度依賴氧，在發生低灌注時，視網膜缺血造成其對氧和其他營養物質的超敏狀態，當血液供應恢復時活性氧大量增加，誘導細胞凋亡，導致RIRI的發生［3］。研究顯示，RIRI能夠引起視網膜神經節細胞凋亡，其機制涉及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）的激活，其中Csapase-3 是細胞凋亡的關鍵酶［4］。槲皮素（QU）廣泛存在于多種植物的花和葉中，具有抗凋亡、抗癌和抗炎活性［5-6］。研究發現，QU 可以通過其抗細胞凋亡作用對心肌、腎臟和腦組織的缺血再灌注損傷發揮抑制作用［7-9］，但其對RIRI是否具有改善作用尚未可知。2021 年10 月—2022 年10 月，本研究通過建立大鼠視網膜缺血再灌注模型，觀察QU 對大鼠RIRI的影響并探討其機制，以期為RIRI的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料 SPF 級無眼疾的Sprague-Dawley 成年雄性大鼠96 只，體質量（225 ± 25）g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，動物使用許可證號：SCXK（魯）20190003。本研究通過濰坊醫學院實驗動物倫理審查（2021SDL023），研究中對動物的處理符合動物倫理原則。QU粉末和二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma 公司，HE 染液購自上海經科化學科技有限公司，兔抗活性Caspase-3一抗購自三鷹生物技術有限公司，DAB 顯色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，TUNEL試劑盒購自瑞士羅氏公司。

1.2 動物分組及干預處理 96 只Sprague-Dawley大鼠采用隨機數字表法隨機分為對照組6 只，RIRI組、QU 組及陰性對照組各30 只。QU 組在建模前連續7 d腹腔注射QU，每天1次，劑量為每只50 mg/kg，并于建模前10 min加注1次；RIRI組、陰性對照組分別腹腔注射等量生理鹽水及DMSO，方法同QU 組；對照組不作任何處理。

1.3 RIRI 模型建立 除對照組外，RIRI 組、QU 組及陰性對照組均采用升高眼壓法［10］建立RIRI 模型。腹腔注射100 g/L水合氯醛麻醉大鼠，生理鹽水垂直平面150 cm 處懸掛可產生14.67 kPa（110 mmHg）的眼內壓力，將帶有小兒頭皮針的輸液器連接好后沿大鼠右眼顳側角鞏膜緣刺入前房并用膠帶固定針頭于鼠耳，打開輸液器開關，此時可見大鼠前房深度明顯增加且眼球變硬，使用直接檢眼鏡可見大鼠視網膜呈灰白色，提示已達缺血狀態，持續60 min后將輸液瓶降至眼平面高度，見大鼠眼底視網膜血供恢復，表示RIRI建模成功。

1.4 視網膜組織標本制作 分別于建模后6、12、24、48、72 h給予各組大鼠腹膜內注射過量水合氯醛（100 mg/kg）麻醉處死，摘除右眼眼球，4%多聚甲醛、通用型組織固定液固定眼球5 d 后取出，沿角膜緣環形剪除角膜并去除晶狀體，4%多聚甲醛再次固定剩余眼球組織24 h，將固定好的視網膜取出，放置于提前配制好的PBS液中浸泡2 h，經過脫水透明后進行石蠟包埋，置于切片機上平行于視神經進行切片，所選切片均取自于視乳頭顳上方2 mm 處，厚度為4 μm。

1.5 視網膜組織形態觀察及內層厚度測量 采用HE 染色觀察大鼠視網膜組織形態變化。將制作好的視網膜切片經過脫蠟與水化后，蘇木素染色3～5 min，自來水沖洗干凈；鹽酸水溶液分化視網膜組織后滴加氨水水溶液返藍，沖洗干凈；伊紅染色5～10 min，沖洗干凈后繼續沖洗5 min；脫水封片后，在光學顯微鏡下觀察視網膜組織的結構并拍照。采用計算機圖像分析系統測量視乳頭顳上方2 mm 動脈下從內界膜到外叢狀層內層的厚度。

1.6 視網膜組織細胞凋亡情況觀察 采用TUNEL法。視網膜組織切片脫蠟脫水、修復與破膜后，將TUNEL 試劑盒內的TdT 試劑和dUTP 試劑按照1∶9的比例均勻混合后滴加在視網膜組織表面，置于37 ℃的水浴鍋孵育2 h，在阻斷內源性過氧化物酶后加試劑3和DAB顯色，經過復染、脫水及封片后在顯微鏡下觀察各組各時點的凋亡細胞數。

1.7 視網膜組織Caspase-3 檢測 采用免疫組織化學染色。視網膜組織石蠟切片經二甲苯脫蠟、無水乙醇脫水后放置于檸檬酸抗原修復緩沖液的修復盒中加熱進行抗原修復，經過阻斷內源性過氧化物酶、血清封閉后加入兔抗活性Caspase-3（1∶200），4 ℃孵育過夜，滴加山羊抗兔IgG 聚合物（HRP 標記）置于室溫中孵育50 min，經過DAB 顯色、復染、脫水及封片后在光鏡下觀察各組各時點Caspase-3 陽性細胞數。

1.8 統計學方法 采用SPSS26.0 統計軟件。計量資料采用Shapiro-Wilk 進行正態性檢驗，當資料符合正態性且方差齊時，數據以-x±s表示，組間兩兩比較采用Bonferroni檢驗，多組比較采用單因素方差分析；當方差不齊時，組間兩兩比較采用Tamhane's T2法，多組比較采用近似F檢驗的Welch法，重復測量數據采用重復測量的方差分析；計數資料以n（%）表示，組間比較行χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組視網膜形態比較 對照組大鼠視網膜細胞形態及各層分界均正常。RIRI 組、陰性對照組大鼠建模6 h后視網膜呈高度水腫，水腫主要表現在神經節細胞層、神經纖維層及內叢狀層，視網膜神經節細胞呈空泡化；12 h后視網膜神經節細胞數目減少，空泡化加重，神經節細胞及內核層細胞排列紊亂，各層分界模糊，細胞間隙增寬；24 h后視網膜水腫較前有所減輕，但細胞結構遭到進一步破壞，神經節細胞、內核層細胞、外核層細胞排列雜亂、細胞空泡化嚴重；48 h 后可見視網膜水腫基本消失且神經節細胞數、內核層細胞數減少。QU組在各時點視網膜組織結構較RIRI 組及陰性對照組更完整，細胞損傷程度更輕。見OSID碼圖1。

2.2 各組視網膜內層厚度比較 建模后6、12 h視網膜內層厚度RIRI組、陰性對照組＞QU組＞對照組，建模后24 h視網膜內層厚度QU組＞RIRI組、陰性對照組＞對照組，建模后48、72 h視網膜內層厚度對照組＞QU組＞RIRI組、陰性對照組（P均＜0.05）。見表1。

表1 建模后不同時點各組視網膜內層厚度比較（μm，-x ± s）

2.3 各組視網膜組織細胞凋亡情況比較 對照組視網膜組織偶見凋亡細胞表達；RIRI 組、陰性對照組視網膜組織凋亡細胞數在建模6、12、24 h 逐漸升高，于建模24 h 至高峰，并于建模48、72 h 逐漸降低；QU 組各時點視網膜組織凋亡細胞數變化趨勢與RIRI 組、陰性對照組相同，但均低于同時點RIRI 組、陰性對照組（P均＜0.05）。見表2。

表2 建模后不同時點各組視網膜組織凋亡細胞數比較（個/毫米2，-x ± s）

2.4 各組視網膜組織Caspase-3 表達比較 對照組視網膜組織偶見Caspase-3 陽性細胞表達；RIRI 組、陰性對照組視網膜組織Caspase-3 陽性細胞數在建模6、12、24 h 逐漸升高，于建模24 h 至高峰，并于建模48、72 h 逐漸降低；QU 組各時點視網膜組織Caspase-3陽性細胞數變化趨勢與RIRI組、陰性對照組相同，但均低于同時點RIRI 組、陰性對照組（P均＜0.05）。見表3。

表3 建模后不同時點各組視網膜組織Caspase-3陽性細胞數比較（個/毫米2，-x ± s）

3 討論

RIRI 是青光眼、糖尿病性視網膜病變及缺血性視神經病變等相關眼部疾病的共同病理基礎，可導致視力不同程度的下降甚至致盲。RIRI 發生發展的分子機制復雜，研究顯示氧自由基損害、鈣超載、炎癥反應、基因調控變化等多種因素介導的細胞凋亡是其主要病理機制［11］。現階段，臨床上對于RIRI的治療方法較少，因此尋找有效的防治方案具有重要意義。

細胞凋亡是一個程序化的細胞自我破壞過程，需要蛋白質合成及特定的細胞信號參與，特別是Caspases 信號級聯［12］。在缺血時，線粒體的通透性轉換孔開放，細胞色素C從線粒體中釋放出來，與凋亡蛋白激活因子1、Caspase-9 前體及ATP 組合形成凋亡復合物，該復合物激活Caspase-9 前體，造成Caspase-9 活化，活化的Caspase-9 使下游Caspase-3、Caspase-7 在dATP 存在下裂解，導致細胞凋亡［13］。Caspase 的激活是細胞凋亡早期和晚期最好的生化標志，與Caspases 家族的其他成員比較，Caspase-3位于Caspase級聯反應的末端，是一種凋亡執行蛋白酶［14］，被認為是凋亡的關鍵蛋白。檢測細胞和組織中活性Caspase-3 是觀察凋亡信號誘導凋亡的重要方法，因此，我們將Caspase-3 作為本次研究的測量指標［15］。

QU 是黃酮類化合物，具有抗凋亡作用，在多種植物中以糖苷的形式大量存在［5］。既往研究表明，QU 具有抗凋亡及細胞保護作用。WANG 等［16］研究發現，在心肌缺血再灌注損傷中，QU 可以通過降低Caspase-3 活性發揮抗凋亡作用。而在蛛網膜下腔出血大鼠腦缺血再灌注損傷的研究中發現，早期給予QU 處理可抑制大鼠腦組織Caspase-3 活性，使腦水腫得到改善［17］。此外，ZHOU 等［18］采用鞏膜上靜脈電凝法制備慢性青光眼大鼠模型，發現QU 可逆轉慢性青光眼所致的光性陰性反應下降，并可通過增加對視網膜神經節細胞的抑制性神經傳遞、減少興奮性神經傳遞減輕視網膜細胞損傷。在純化的原代大鼠神經節細胞培養物及人視網膜色素上皮細胞培養物中發現，QU對凋亡和壞死途徑中的Caspase-3活性有抑制作用［19-20］，抑制Caspase-3 活化是減輕缺血再灌注后細胞凋亡的有效途徑。由上可見，QU可以在心腦組織缺血再灌注損傷中起到改善作用，本研究進一步探討QU 預處理是否對RIRI 具有改善作用。

本研究結果顯示，RIRI 早期大鼠視網膜高度水腫，視網膜內層厚度增加，RIRI 晚期視網膜細胞數量減少且視網膜萎縮變薄，視網膜水腫及組織損傷主要集中在內層視網膜，外層視網膜受損較輕；陰性對照組各時點的視網膜組織病理改變與RIRI 組相似，提示陰性對照溶劑DMSO 對RIRI 影響不大；而經QU 干預的大鼠在再灌注后6、12 h 這兩個時點視網膜細胞水腫程度輕于RIRI 組，在24、48、72 h 視網膜萎縮變薄程度輕于RIRI 組，提示QU 可以改善缺血再灌注后的視網膜細胞形態，尤其是可以減輕由于視網膜內層受損而引起的視網膜萎縮，對保護視網膜細胞及維持視網膜厚度有一定的作用。RIRI組大鼠視網膜缺血再灌注后6 h 有少量凋亡細胞和Caspase-3陽性細胞表達，12 h較前凋亡增多，24 h到達峰值，隨后凋亡細胞數逐漸下降，這與相關文獻［21-22］報道結果吻合。QU 組在RIRI 模型建立后各個時點凋亡細胞數及Caspase-3 陽性細胞均少于RIRI 組，提示視網膜細胞缺血后可能是通過激活Caspase-3 蛋白從而啟動細胞凋亡，而QU 可以通過下調Caspase-3 陽性表達以減少RIRI 引起的細胞凋亡。

綜上所述，我們初步認為QU 對于RIRI 具有一定的抑制作用，其機制可能與下調Caspase-3表達抑制細胞凋亡有關，這為擴展QU 在RIRI 的臨床應用提供了新思路。本研究的不足之處是未進行QU 預處理后視網膜電生理實驗，另外本研究只探討了QU通過減少細胞凋亡改善RIRI的機制，對于RIRI的其他機制還需進一步研究。