子宮頸癌組織中白細胞介素33、腫瘤發生抑制蛋白2表達變化分析

張玉蓮，朱玥潔，王碧輝，阿迪萊·扎克爾，陳志芳

1 新疆醫科大學第一附屬醫院婦科中心，烏魯木齊 830054；2 省部共建中亞高發病成因與防治國家重點實驗室；3 新疆醫科大學第一附屬醫院生殖助孕中心

子宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤，其發生發展是一個慢性的持續過程，由人乳頭瘤病毒（HPV）感染形成子宮頸上皮內瘤變（CIN），進一步發展為浸潤癌［1］。有研究表明，HPV 感染機體后，免疫細胞因子在激活免疫系統及清除病毒過程中發揮重要作用。白細胞介素33（IL-33）屬于IL-1基因家族成員，是一種組織來源的核細胞因子，在正常人體組織中的內皮細胞及上皮細胞核中表達。當內皮或上皮細胞受損時，IL-33 快速分泌或釋放，作為危險信號發揮其警報作用，構成抵御病原體的第一道防線［2-4］。腫瘤發生抑制蛋白2（ST2）是IL-33 的特異性受體，IL-33 通過與ST2 結合形成的異二聚體受體復合物來觸發下游信號，介導多種生理病理過程中的生物學效應［5-6］。近年來，IL-33/ST2 信號通路已被報道在越來越多的疾病發病機制中起關鍵作用，特別是在腫瘤微環境中具有雙重作用，但兩者是否參與子宮頸癌的發生發展過程尚不清楚?；诖耍狙芯坑^察了子宮頸癌組織中IL-33、ST2 蛋白及mRNA 表達變化，并初步探討其與子宮頸癌患者臨床病理特征的關系，以期為深入探究IL-33/ST2 信號通路在子宮頸癌發生發展中的機制提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 經新疆醫科大學第一附屬醫院倫理委員會批準（20210226-18），選取2021 年1 月—2022年1月就診于我院行手術治療或病理活檢的子宮頸病變患者作為研究對象。納入標準：經病理診斷確診為CIN 或子宮頸癌；子宮頸癌組織學類型屬鱗狀細胞癌；簽署知情同意書。排除標準：合并其他惡性腫瘤；有嚴重心肺、腎臟疾病或免疫性疾病史；臨床資料不完整。共選取140 例子宮頸病變患者，其中CINⅠ級20 例、CINⅡ～Ⅲ級30 例、子宮頸癌50 例；另選取在我院因良性子宮肌瘤進行子宮全切并且病理診斷為子宮肌瘤患者40例作為對照。

1.2 子宮頸病變及正常組織樣本獲取 子宮頸癌、CIN 及子宮肌瘤患者分別在行手術治療或病理活檢時取子宮頸癌、CIN 及正常子宮頸組織樣本，樣本離體后分為兩份，一份迅速置于液氮或-80 ℃凍存用于RT-qPCR 檢測，一份在4%多聚甲醛浸泡24 h 后石蠟包埋切片用于免疫組織化學染色。

1.3 子宮頸病變及正常組織IL-33、ST2 蛋白檢測采用免疫組織化學染色。將石蠟包埋的4 μm 厚度子宮頸癌、CIN及正常子宮頸組織切片，60 ℃烤片2 h，在二甲苯中脫蠟，然后在分級乙醇中水化，蒸餾水溶液沖洗3 次，每次5 min。在pH 9.0 的Tris-EDTA 抗原修復液中進行微波修復，PBS 緩沖液沖洗3 次，每次5 min，將切片用0.3% Triton X-100 室溫孵育10 min，PBS 緩沖液沖洗3 次，每次5 min，然后用3%過氧化氫溶液常溫孵育10 min，PBS 緩沖液沖洗3 次，每次5 min。分別加入稀釋至1∶200 的IL-33、ST2 抗體（武漢Proteintech），4 ℃冰箱濕盒過夜。第二天復溫1 h，PBS 緩沖液沖洗3 次，每次5 min，與HRP 偶聯的二抗（武漢Proteintech）室溫下孵育30 min，DAB 顯色2 min，蘇木素染色、鹽酸乙醇分化后用梯度乙醇脫水，二甲苯透明、中性樹膠封片后，光學顯微鏡（×400）下隨機選取5 個不同視野，依照陽性細胞百分比及染色強度對切片進行評分。染色強度評分：不著色為0 分，淺黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3分。陽性細胞百分比評分：＜10%為0分，10%～＜25%為1分，25%～＜50%為2分，50%～＜80%為3 分，≥80%為4。將兩項評分相乘，乘積＜4 分為IL-33、ST2陰性，≥4為IL-33、ST2陽性。

1.4 子宮頸病變及正常組織IL-33、ST2 mRNA檢測采用RT-qPCR法。取凍存的子宮頸癌、CIN及正常子宮頸組織樣本，每50～100 mg 組織剪碎后加入1 mL TRIzol用組織研磨儀研磨后取上清，加入200 μL氯仿4 ℃離心15 min后加入到新的EP管，加入500 μL異丙醇室溫靜置10 min，離心10 min棄上清，加入用DEPC水配置的75%乙醇1 mL，離心5 min清洗兩次，干燥后加入50～100 μL RNA-free 水溶解RNA 沉淀。用NanoDrop2000測定RNA 樣品濃度，按照逆轉錄試劑盒（日本TaKaRa）操作首先去除RNA中的DNA，37 ℃15 min、85 ℃ 5 s反轉錄為cDNA。參照實時定量PCR試劑盒（日本TaKaRa）擴增DNA，反應體系為10 μL，引物濃度為0.4 μmol/L。引物由上海歐易生物醫學科技有限公司合成，引物序列：IL-33上游引物5'-CTGTGGAGTGCTTTGCCTTT-3'，下游引物5'-TCCTTGTTGTTGGCATGCAA-3'；ST2 上游引物5'-ATGTGATGACTGAGGACGCA-3'，下游引物5'-CTTGCTCATCCTTGACCGTG-3'；GAPDH 上游引物5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAG-3'，下游引物5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。PCR 擴增條件：95 ℃30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環。以GAPDH為內參，以2-ΔΔCt計算IL-33、ST2 mRNA相對表達量。

1.5 統計學方法 采用SPSS26.0 及GraphPad Prism9.5.0 統計軟件。計量資料采用Kolmogorov-Smirnov進行正態性檢驗，Bartlett法進行方差齊性檢驗，方差齊且呈正態分布的數據以-x±s表示，組間兩兩比較采用獨立樣本t檢驗；計數資料以n（%）表示，組間比較行χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 子宮頸病變及正常組織IL-33、ST2蛋白表達比較 子宮頸癌、CIN及正常子宮頸組織IL-33陽性表達率分別為35.60%、28.00%、8.06%，ST2陽性表達率分別為28.63%、17.65%、6.58%；IL-33、ST2蛋白表達子宮頸癌組織＞CIN組織＞正常子宮頸組織（P均＜0.05）。

2.2 子宮頸病變及正常組織IL-33、ST2 mRNA表達比較 子宮頸癌、CIN 及正常子宮頸組織IL-33 mRNA 相對表達量分別為1.74 ± 0.25、1.42 ±0.18、1.01 ± 0.01，ST2 mRNA 相對表達量分別為1.84 ± 0.18、1.55 ± 0.22、1.01 ± 0.01；IL-33、ST2 mRNA 表達子宮頸癌組織＞CIN 組織＞正常子宮頸組織（P均＜0.05）。

2.3 不同臨床病理特征子宮頸癌患者癌組織IL-33、ST2 蛋白表達比較 不同腫瘤肌層浸潤深度分化及淋巴結轉移情況的子宮頸癌患者癌組織IL-33、ST2 蛋白表達比較差異具有統計學意義（P均＜0.05），不同年齡、腫瘤大小、分化程度及FIGO 分期的子宮頸癌患者癌組織IL-33、ST2 蛋白表達比較差異均無統計學意義。見表1。

表1 不同臨床病理特征子宮頸癌患者癌組織IL-33、ST2蛋白表達比較

3 討論

子宮頸癌是女性常見惡性腫瘤，發病率及病死率均較高。盡管目前普及了子宮頸癌篩查和疫苗接種，但是子宮頸癌高發病風險依然存在，并且晚期子宮頸癌的存活率較低［7］。得益于靶向免疫治療研究的發展，近年來免疫分子的在腫瘤治療中的作用越來越受到重視［8］。IL-33 是近年來頗受關注的多效性免疫分子，因為具有與其他IL-1 家族成員相似的三維結構，所以被定義為IL-1 家族的成員［9］。研究發現，IL-33在Th2細胞上表達，并且可以激活Th1細胞、Ⅱ型固有淋巴（ILC2）細胞、Treg 細胞、CD8+T 淋巴細胞及NK 細胞等免疫細胞，其在屏障組織上皮細胞和淋巴器官成纖維細胞網狀細胞中具有強烈的核表達，當機體感染或屏障受損時，IL-33 釋放起到警示作用。IL-33 能夠驅動細胞因子發揮Th1 細胞介導的抗病毒免疫應答保護［10］；也可作為2 型免疫反應的誘導劑，通過腫瘤微環境驅動2型免疫，介導腫瘤的發生發展［11］。研究表明，IL-33與多種疾病的免疫機制有關，包括過敏、纖維化、感染及腫瘤等。

ST2 作為IL-33 的特異性受體，在ILC2 細胞、CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、嗜堿性粒細胞及巨噬細胞等多種免疫細胞中表達。IL-33 可以與其受體ST2 及共受體IL-1 受體輔助蛋白（IL-1RAP）形成的異二聚體結合，通過IL-1RAP 的TIR 結構域進行信號傳導，激活核因子κB 及MAP 激酶，并驅動體外極化Th2 細胞產生Th2 相關細胞因子來發揮其活性。相關研究表明，IL-33/ST2信號通路可以通過激活免疫抑制細胞重塑腫瘤微環境，促進癌癥的發展。XU 等［12］研究發現，IL-33/ST2 軸能夠通過調節巨噬細胞改變腫瘤微環境，介導線粒體自噬及其極化來影響腫瘤生長。EISSMANN 等［13］通過建立IL-33 缺乏ST2-/-小鼠模型證明IL-33/ST2 信號缺乏可以降低小鼠胃腫瘤的生長，且小鼠在100 日齡時總體腫瘤負荷顯著降低，提示IL-33/ST2 信號通路激活可能促進腫瘤的發生發展。

本研究首先通過免疫組織化學染色發現，IL-33、ST2 在子宮頸癌組織中的表達高于CIN 組織和正常子宮頸組織，而在正常子宮頸組織中幾乎未檢測到IL-33、ST2陽性表達，并且腫瘤肌層浸潤深度深、淋巴結轉移的子宮頸癌患者癌組織中IL-33、ST2 表達更高，提示IL-33、ST2可能參與了子宮頸癌的發生發展過程，IL-33/ST2信號通路的激活與子宮頸癌的惡性進展有關。但目前關于IL-33/ST2 信號通路參與調控子宮頸癌發病的免疫學機制尚不清楚，需要體外實驗和小鼠模型研究其在子宮頸癌及其腫瘤微環境中如何通過介導免疫細胞因子發揮促癌作用。

綜上所述，IL-33、ST2在子宮頸癌組織中表達升高，其表達與子宮頸癌患者肌層浸潤深度及淋巴結轉移情況有關，提示IL-33、ST2 可能參與了子宮頸癌的發生發展，其異常表達可能與子宮頸病變的惡性進展存在相關性，且在腫瘤形成后可能促進了子宮頸癌的遠處轉移。我們計劃在日后的研究中通過進一步的實驗分析IL-33/ST2 信號通路如何通過激活腫瘤微環境中的多種免疫相關細胞發揮促癌或抑癌作用。