GLCCI1基因rs37973位點多態(tài)性對ICSs治療哮喘-慢性阻塞性肺疾病重疊效果的影響Δ

邱彥 ，董雅芬 ，于平 ，王建 ，卞曉嵐 #（.上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院藥劑科，上海 000；.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院藥劑科，上海 0005）

哮喘和慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）都是常見的慢性氣道炎癥性疾病。據(jù)統(tǒng)計，全球約有哮喘患者2.6億人、COPD患者2.1億人[1]，且部分患者既有COPD的臨床表現(xiàn)，又有哮喘的疾病特征。2014年，《慢性阻塞性肺病全球倡議（GOLD）》和《全球哮喘防治倡議（GINA）》聯(lián)合提出哮喘-COPD重疊綜合征（asthma-chronic obstructive pulmonary disease overlap syndrome，ACOS）的概念，即持續(xù)的氣流受限，并同時具備哮喘與COPD的多項臨床特征[2]，但ACOS作為單一疾病定義存在較大爭議。2017年，GOLD和GINA又共同提出“哮喘-COPD重疊（asthmachronic obstructive pulmonary disease overlap，ACO）”術(shù)語，用以描述同時具有哮喘和COPD疾病特征的患者[3]。與單純的哮喘或COPD相比，ACO患者的肺功能更差，急性加重更頻繁，呼吸道癥狀更嚴(yán)重，帶來的社會和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)更大[4—5]。

吸入性糖皮質(zhì)激素（inhaled corticosteroids，ICSs）聯(lián)合支氣管擴(kuò)張劑為治療ACO的推薦方案[6]。然而，不同患者對ICSs的應(yīng)答存在較大的個體差異[7]。一項全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome-wide association study，GWAS）表明，在非西班牙裔白種人中，GLCCI1基因rs37973位點突變與哮喘患者對ICSs的應(yīng)答顯著下降具有相關(guān)性[8]。近期研究表明，rs37973位點多態(tài)性不僅與哮喘患者使用ICSs的短期或長期臨床療效差異相關(guān)，還與COPD患者對ICSs的應(yīng)答差異相關(guān)[9—10]。目前，關(guān)于ACO患者基因特征相關(guān)性的報道較少[11]。為進(jìn)一步了解ACO患者的臨床疾病特點和遺傳學(xué)相關(guān)特征，本研究探討了GLCCI1基因rs37973位點多態(tài)性與ACO患者使用ICSs應(yīng)答反應(yīng)的相關(guān)性，旨在為ACO患者使用ICSs的療效預(yù)測及個體化治療方案的優(yōu)化提供參考。

1 資料與方法

1.1 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

本研究的主要納入標(biāo)準(zhǔn)包括：（1）年齡≥40歲，存在持續(xù)氣流受限[使用支氣管擴(kuò)張劑后，第1秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV1）與用力肺活量（forced vital capacity，F(xiàn)VC）比值＜0.70]；（2）吸煙史（或同等空氣污染暴露，如燃料煙霧、職業(yè)粉塵等）＞10年；（3）40歲以前診斷為哮喘或者使用支氣管擴(kuò)張劑后FEV1改善＞0.4 L。次要納入標(biāo)準(zhǔn)包括：（1）有特應(yīng)性疾病（如過敏性結(jié)膜炎、特應(yīng)性皮炎、過敏性鼻炎等）病史；（2）14 d內(nèi)支氣管舒張試驗陽性≥2次；（3）外周血嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)≥0.3×109L-1。滿足主要標(biāo)準(zhǔn)3項和次要標(biāo)準(zhǔn)至少1項者納入本研究[6]。

表1 ACO患者的基本資料

本研究的排除標(biāo)準(zhǔn)為：（1）14 d內(nèi)有急性加重事件（呼吸道癥狀急性惡化）者；（2）4周內(nèi)接受過系統(tǒng)性糖皮質(zhì)激素治療（口服或者靜脈用藥）者；（3）除COPD及哮喘外，合并其他慢性肺部疾病者。

1.2 研究對象

選取2019年4月1日至2020年12月31日就診于上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院并首次診斷為ACO的173例患者，其中，62例患者因各種原因（如中途要求退出、失訪、拒絕配合檢測等）未能完成24周的隨訪，最終納入111例。111例ACO患者中，男性75例（67.57%）、女性36例（32.43%），年齡（66.32±13.74）歲，體重指數(shù)（body mass index，BMI）（23.04±3.93）kg/m2，吸煙史（31.27±12.75）包年，78例（70.27%）患者吸煙史超過20包年。患者基本資料見表1。本研究方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)，倫理批件號為：prylz2020-079b。所有患者均簽署了知情同意書。

1.3 用藥方法

所有患者均使用沙美特羅替卡松吸入粉霧劑（法國Glaxo Wellcome Production，批準(zhǔn)文號H20150325，每泡含昔萘酸沙美特羅50 μg與丙酸氟替卡松500 μg，遞送劑量為昔萘酸沙美特羅47 μg與丙酸氟替卡松460 μg），每天2次，每次1吸，持續(xù)24周。

1.4 觀察指標(biāo)

采用MS-Diffusion型肺功能儀（德國Jeager公司）測定肺功能，肺功能指標(biāo)包括FEV1、FVC、FEV1% pred[12]。以ICSs治療后肺功能指標(biāo)與基線指標(biāo)的差值作為肺功能改善指標(biāo)，分別用ΔFEV1和ΔFEV1% pre表示。

1.5 基因型檢測方法

采集患者外周靜脈血2 mL，采用基因組DNA提取試劑盒（德國QIAGEN公司）提取DNA，于-80 °C保存。rs37973位點多態(tài)性檢測采用MassARRAY DNA質(zhì)譜陣列基因分析系統(tǒng)（美國Agena Bioscience公司）完成分型。引物序列如下：前引物（1st-PCRP）ACGTTGGATGCACGAGCAGACCAATTTGAC；后引物（2nd-PCRP）ACGTTGGATGCGGGAGCAATTAATGTAAGG；單堿基延伸反應(yīng)物（UEP_SEQ）GGCAATTAATGTAAGGATCTTCATC。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）條件為：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，72 ℃最終延伸5 min，共45個循環(huán)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。等位基因頻率通過Hardy-Weinberg平衡檢驗比較實際分布與理論分布的差異，采用χ2檢驗。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，計數(shù)資料以例數(shù)及構(gòu)成比（%）表示。計量資料兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA），組間兩兩比較采用Bonferroni檢驗（假定方差齊性）和Tamhane’sT2檢驗（假定方差不齊）。檢驗水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 患者GLCCI1基因rs37973位點基因分型結(jié)果

GLCCI1基因rs37973位點AA型患者有42例（37.84%），AG型有52例（46.85%），GG型有17例（15.32%），符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。結(jié)果見表1。

2.2 治療前患者的基線肺功能

2.2.1 治療前患者基線肺功能指標(biāo)的總體情況

治療前，患者的基線總體FEV1、FEV1% pred、FEV1/FVC分別為（1.39±0.35）L、（49.71±12.22）%、0.50±0.09。各基因型患者的基線肺功能指標(biāo)及外周血嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表1。

2.2.2 治療前不同吸煙史患者的基線肺功能指標(biāo)比較

治療前，吸煙史≤20包年患者的基線總體FEV1和FEV1% pred分別為（1.55±0.22）L、（54.92±7.82）%，均顯著優(yōu)于吸煙史＞20包年患者[FEV1和FEV1% pred分別為（1.33±0.37）L、（47.51±13.09）%，P＜0.05]。但二者的基線總體FEV1/FVC[吸煙史≤20包年患者為（0.50±0.08），吸煙史＞20包年患者為（0.49±0.09）]比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2.3 治療前不同吸煙史各基因型患者的基線肺功能指標(biāo)比較

治療前，吸煙史≤20包年患者中，AA+AG型患者的基線FEV1和FEV1% pred均顯著優(yōu)于GG型患者（P＜0.05）（圖1A、圖1B），但二者的基線FEV1/FVC（AA+AG型為0.51±0.08，GG型為0.49±0.08）比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。吸煙史＞20包年患者中，AA+AG型患者的基線FEV1、FEV1% pred與GG型患者比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖1C、圖1D）；而AA+AG型患者的基線FEV1/FVC顯著優(yōu)于GG型患者（AA+AG型為0.51±0.09，GG型為0.45±0.07，P＜0.05）。

圖1 治療前不同吸煙史各基因型患者的基線肺功能

2.3 治療后患者的肺功能

2.3.1 治療后患者肺功能指標(biāo)的總體情況

治療12周后，患者的總體FEV1、FEV1% pred、FEV1/FVC分別為（1.57±0.37）L、（55.22±12.84）%和0.52±0.09；治療24周后，患者的總體FEV1、FEV1% pred、FEV1/FVC分別為（1.64±0.35）L、（57.67±12.45）%和0.53±0.09，上述肺功能指標(biāo)總體情況均顯著優(yōu)于治療前患者的基線肺功能指標(biāo)總體情況（P＜0.05）。

2.3.2 治療后各基因型患者肺功能指標(biāo)比較

治療12、24周后，AA型患者FEV1、FEV1% pred均顯著高于GG型患者（P＜0.05）；AA型與AG型、AG型與GG型患者的FEV1、FEV1% pred及各基因型患者的FEV1/FVC比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表2。

表2 治療后各基因型患者肺功能指標(biāo)結(jié)果（±s）

表2 治療后各基因型患者肺功能指標(biāo)結(jié)果（±s）

a：與GG型比較，P＜0.05。

肺功能指標(biāo)FEV1/L rs37973位點分型治療時間12周24周12周24周12周24周FEV1% pred/%FEV1/FVC GG 1.35±0.31 1.39±0.33 48.15±10.84 49.45±11.42 0.49±0.09 0.50±0.09 AA 1.67±0.40 a 1.75±0.36 a 59.39±14.24a 62.51±12.81a 0.52±0.10 0.54±0.11 AG 1.57±0.32 1.64±0.31 54.16±11.12 56.46±10.85 0.53±0.08 0.54±0.10

2.3.3 治療后各基因型患者肺功能改善情況

治療12周后，各基因型患者的肺功能改善情況比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。治療24周后，AA型、AG型患者的肺功能改善情況均顯著優(yōu)于GG型，且AA型患者的ΔFEV1% pred顯著優(yōu)于AG型（P＜0.05）。結(jié)果見圖2。

圖2 治療后各基因型患者的肺功能改善情況

2.3.4 治療后不同吸煙史各基因型患者的肺功能改善情況

治療12、24周后，吸煙史≤20包年患者的肺功能總體改善情況均顯著優(yōu)于吸煙史＞20包年患者（P＜0.05）。治療12、24周后，吸煙史≤20包年患者中，僅AA型患者的ΔFEV1% pred顯著優(yōu)于AG型（P＜0.05）；其他各基因型患者的肺功能改善情況比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。治療12周后，吸煙史＞20包年患者中，AA型和AG型患者的ΔFEV1、ΔFEV1% pred均顯著優(yōu)于GG型，且AA型患者的ΔFEV1% pred顯著優(yōu)于AG型（P＜0.05）；治療24周后，AA型和AG型患者的ΔFEV1、ΔFEV1% pred均顯著優(yōu)于GG型（P＜0.05）。結(jié)果見表3。

表3 不同吸煙史各基因型患者肺功能改善情況（±s）

表3 不同吸煙史各基因型患者肺功能改善情況（±s）

a：與吸煙史＞20包年比較，P＜0.05；b：與AG型比較，P＜0.05；c：與GG型比較，P＜0.05。

吸煙史≤20包年肺功能改善指標(biāo)ΔFEV1/L治療時間12周24周12周24周12周24周12周24周總體0.24±0.08a 0.29±0.11a 7.58±3.20a 9.64±4.17a 0.16±0.16 0.23±0.16 4.64±5.85 7.26±5.98 rs37973位點分型GG 0.17±0.14 0.19±0.09 6.15±5.04 7.03±3.45 0.01±0.21 0.06±0.19 0.45±7.61 1.98±6.81 ΔFEV1% pred/%＞20包年ΔFEV1/L ΔFEV1% pred/%AA 0.27±0.05 0.34±0.09 9.39±1.87b 11.94±3.05b 0.17±0.18c 0.27±0.17c 6.29±6.54bc 9.63±6.11c AG 0.24±0.05 0.30±0.11 6.70±2.65 8.83±4.47 0.18±0.10c 0.25±0.12c 4.55±3.88c 6.92±4.50c

3 討論

20世紀(jì)50年代，醫(yī)學(xué)工作者發(fā)現(xiàn)某些患者可能同時患有哮喘和COPD的情況[13]。1961年，“荷蘭假說”被提出，該假說認(rèn)為哮喘和COPD是同一氣道阻塞性疾病在不同階段的表現(xiàn)[6，14]，但這個假說在學(xué)術(shù)界存在爭議。2014年，GOLD和GINA聯(lián)合提出ACOS后，截至2020年，關(guān)于此類患者的研究較2014年前增加了5倍之多[15]。

GLCCI1位于第7號染色體短臂2區(qū)1帶第3亞帶（7p21.3），在全身多個組織器官中均有表達(dá)。糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄蛋白1抗體（glucocorticoid induced transcript 1，GLCCI1）可被糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)，被認(rèn)為是糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)凋亡的早期標(biāo)志物之一[8，16]。位于GLCCI1基因啟動子區(qū)域的rs37973位點單核苷酸突變，可能會下調(diào)GLCCI1基因的表達(dá)，減少炎癥細(xì)胞因子凋亡，從而導(dǎo)致機(jī)體對ICSs的治療反應(yīng)較差[8]。此外，GLCCI1基因突變被認(rèn)為是肺功能下降（FEV1每年下降≥30 mL）的危險因素之一[17]。rs37973位點多態(tài)性顯性模型（AA+AG vs.GG）分析結(jié)果表明，采取類似的治療措施，GG型哮喘患者肺功能下降更快[7—9]。本研究發(fā)現(xiàn)，雖然治療前各基因型患者肺功能指標(biāo)未見顯著性差異，但在吸煙患者中，AA+AG型患者的部分肺功能指標(biāo)優(yōu)于GG型，表明吸煙、基因型可能是影響患者肺功能的因素。在COPD患者中，rs37973位點多態(tài)性也可能是預(yù)測患者對ICSs治療反應(yīng)的潛在因子[10]。目前認(rèn)為，可能存在同時影響哮喘和COPD的遺傳學(xué)因素和環(huán)境因素[18]。本研究結(jié)果顯示，各基因型患者的基線肺功指標(biāo)無明顯差異，但治療24周后，AA型和AG型患者的肺功能改善情況均顯著優(yōu)于GG型，這提示野生純合子（AA型）和雜合子（AG型）患者對ICSs的治療反應(yīng)優(yōu)于突變純合子（GG型）患者，位點基因多態(tài)性與ICSs治療的療效相關(guān)。在24周的隨訪中，除個別患者出現(xiàn)口咽部不適、聲音嘶啞外，未見嚴(yán)重不良反應(yīng)發(fā)生。

既往研究表明，吸煙狀態(tài)與肺功能加速惡化有關(guān)[19]。本研究中發(fā)現(xiàn)，吸煙史對各基因型患者的基線肺功能指標(biāo)和ICSs治療反應(yīng)均有影響。吸煙史≤20包年患者的基線總體FEV1和FEV1% pred均顯著優(yōu)于吸煙史＞20包年患者；治療12、24周后，吸煙史≤20包年患者的肺功能總體改善情況顯著優(yōu)于吸煙史＞20包年患者。此外，治療12、24周后，吸煙史＞20包年患者中的AA型和AG型患者的肺功能改善情況均優(yōu)于GG型。這提示，在合并重度吸煙史的患者中，AA型和AG型患者對ICSs應(yīng)答較GG型更好。

本研究的局限性為：（1）ACO尚無統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)，這可能會增加納入患者之間的差異性。在ACO患者中，有兩種亞型被提出，一種是吸煙相關(guān)的COPD合并2型輔助性T細(xì)胞（type 2 helper T，Th2）介導(dǎo)的Th2型炎癥表現(xiàn)患者，稱為Th2型COPD（或者嗜酸性粒細(xì)胞型COPD）；一種是哮喘患者有吸煙史或者長期空氣污染暴露，逐步表現(xiàn)出COPD的臨床特征[20]。目前尚無法明確區(qū)分這兩種亞型，而這兩種亞型的患者對ICSs的應(yīng)答可能存在差異，從而增加研究結(jié)果的偏倚。（2）在ACO患者中尚缺乏關(guān)于ICSs療效的GWAS研究。本研究僅關(guān)注了單核苷酸多態(tài)性，納入的樣本量較少，不能完全解釋ICSs應(yīng)答的個體差異，且ACO患者經(jīng)ICSs治療的臨床獲益機(jī)制還需進(jìn)一步研究。（3）基于藥物的易獲得性，本研究以沙美特羅替卡松代表ICSs，所得結(jié)果是否可外推到其他ICSs暫不清楚。（4）支氣管擴(kuò)張劑聯(lián)合ICSs治療可能會影響ICSs的療效。在后續(xù)研究中，本課題組將進(jìn)一步完善GLCCI1基因rs37973位點單倍型研究和體外熒光素酶報告基因試驗，并評價突變位點對GLCCI1基因表達(dá)及炎癥細(xì)胞因子凋亡的影響，以探索不同基因型對ICSs應(yīng)答差異的機(jī)制。

綜上所述，GLCCI1基因rs37973位點GG型ACO患者對ICSs的治療反應(yīng)較其他基因型差，其中吸煙史＞20包年的患者反應(yīng)更差。