2021年貴州省遵義市李斯特菌血清型和PFGE分型分析

王銘 夏鑫 游旅 韋德琴 劉艷敏 劉英 韋小瑜

李斯特菌（Listeria）是一類革蘭陽性無芽孢無莢膜的短小桿菌，為人畜共患病病原菌[1]。大多數(shù)李斯特菌引起的感染是食源性的，牛奶、乳制品、肉類、蔬菜、沙拉、海產(chǎn)品和熟食是常見的感染源[2]。臨床表現(xiàn)為胃腸炎、腦膜炎、敗血癥、單核細(xì)胞增多和流產(chǎn)等癥狀[3]。主要感染者為免疫力低下的人群、孕婦和新生兒，食源性的李斯特菌發(fā)病率雖然不高，但死亡率可高達(dá) 20%～30%[4]。在歐洲和美國等發(fā)達(dá)國家，由單增李斯特菌感染引起的暴發(fā)或散發(fā)李斯特菌病均有報(bào)道[5]。我國 2011—2016 年共報(bào)道了19 個省的253 個李斯特菌病例，病死率為25.7%[6]。而貴州省近幾年關(guān)于李斯特菌病的相關(guān)研究較少。李斯特菌血清型分型是通過多重聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR），將其分為5 個血清組[7]。脈沖場凝膠電泳（pulse-field gel electrophoresis，PFGE）一直被廣泛用于李斯特菌的分子分型中，是李斯特菌病暴發(fā)溯源調(diào)查的“金標(biāo)準(zhǔn)”[8]。目前貴州省關(guān)于李斯特菌血清型和PFGE 分子分型相關(guān)研究較少。本研究對貴州省遵義市收集的242 份食品標(biāo)本進(jìn)行鑒定，分離出5 株李斯特菌進(jìn)行 PCR 鑒定，血清型分型和 PFGE 分子分型，為貴州省李斯特菌病防控提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

來自2021 年貴州省致病菌識別網(wǎng)遵義市網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測的食品樣本，樣品采集按照貴州省致病菌識別網(wǎng)監(jiān)測方案要求，以肉類、海鮮、乳制品、米面制品和涼拌菜為主。PFGE 參考菌株沙門菌 H9812 標(biāo)準(zhǔn)株來自國家致病菌識別網(wǎng)中心實(shí)驗(yàn)室[9]。

1.2 主要試劑和儀器

單增顯色培養(yǎng)基（法國 CHROMager 公司）、營養(yǎng)瓊脂平板（環(huán)凱生物有限公司）、 DNA 提取試劑盒、溶菌酶（西安天隆）； 2×Taq PCR MasterMix （含染料）（北京Tiangen）；蛋白酶 K、Xba Ⅰ（日本 TaKaRa）；限制性內(nèi)切酶 Asc Ⅰ （New England Bio-labs）。全自動核酸提取儀（西安天隆）；PCR 儀（美國 Thermo Fisher Scientific）；脈沖場凝膠電泳儀及配套設(shè)備、全自動凝膠成像儀、電泳儀（美國 Bio-Rad）。所有培養(yǎng)基和試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本的分離培養(yǎng)及初步鑒定

按照貴州省致病菌識別網(wǎng)監(jiān)測方案要求，同時(shí)根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)》（GB 4789—2016）的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)。225 mL LB1 增菌培養(yǎng)液中加入食品樣本25 g（mL），30 ℃培養(yǎng) 24 h，在10 mL LB2 增菌培養(yǎng)液中加入0.1 mL LB1 增菌培養(yǎng)液，30 ℃培養(yǎng) 24 h，將LB2增菌培養(yǎng)物接種于單增李斯特顯色平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落特征，用無菌接種環(huán)挑取典型菌落在營養(yǎng)瓊脂平板上進(jìn)行三區(qū)劃線，37 ℃培養(yǎng)24 h。用無菌生理鹽水將營養(yǎng)瓊脂平板生長的典型菌落制成菌懸液，采用質(zhì)譜微生物鑒定儀進(jìn)行初步鑒定。同時(shí)用菌懸液進(jìn)行革蘭染色鏡檢觀察結(jié)果。將初篩分離菌株保存至磁珠凍存管并送至貴州省致病菌識別網(wǎng)中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 模板的制備

取-80 ℃磁珠凍存管保存的李斯特菌，用李斯特菌顯色培養(yǎng)基復(fù)蘇培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取藍(lán)色有白色暈圈的菌落三區(qū)劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板，37 ℃純化培養(yǎng)24 h。用無菌拭子蘸取營養(yǎng)瓊脂平板上部分純菌，按照西安天隆科技細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒說明書，制成菌懸液，提取5 株李斯特菌總DNA，將DNA 模板放于-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 菌株 PC 鑒定

通過PCR 擴(kuò)增李斯特菌屬特異基因prs 和單增李斯特菌特異基因lmo2234 對菌株進(jìn)行鑒定，由北京天一輝遠(yuǎn)生物公司合成相關(guān)引物，相關(guān)引物序列及產(chǎn)物長度見參考文獻(xiàn)[10]。采用1.5%瓊脂糖對 5μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，Marker 采用DL1000，使用凝膠成像儀觀察電泳結(jié)果。

1.3.4 血清型分型

采用多重PCR 方法，擴(kuò)增李斯特菌的特異性基因lmo0737、lmo118、ORF2819、ORF2110 和 prs，對李斯特菌進(jìn)行血清分型，由北京天一輝遠(yuǎn)生物公司合成相關(guān)引物，其序列及產(chǎn)物長度[11]見表1。采用1.5%瓊脂糖對5 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，DL2000 作為 Marker，采用凝膠成像儀觀察電泳結(jié)果。

表1 單增李斯特菌血清型分組引物序列

表2 5 株李斯特菌樣本信息

1.3.5 PFGE 分型

參照《國家致病菌識別網(wǎng)技術(shù)手冊》中李斯特菌PFGE操作程序，對5 株李斯特菌進(jìn)行PFGE 分子分型，以沙門菌 H9812 作為標(biāo)準(zhǔn)菌株[10]，采用限制性內(nèi)切酶 Asc Ⅰ和 XabⅠ酶切，37 ℃ 4 h 后進(jìn)行電泳，電泳初始轉(zhuǎn)化時(shí)間：4 s；終末轉(zhuǎn)化時(shí)間 40 s ；電泳時(shí)間 18 h。經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)獲得 tif格式圖片，應(yīng)用 BioNumerics 8.0 軟件對獲得的 PFGE 電泳圖譜進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果

2.1 菌株分離鑒定結(jié)果

2021 年貴州省致病菌識別網(wǎng)遵義市網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室共采集242 份食品監(jiān)測標(biāo)本，成功分離出63 株菌株，根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果顯示，其中5 株為李斯特菌（湄潭縣2 例、匯川區(qū)1 例、紅花崗區(qū)1 例和正安縣1 例）分離率為2.07%（5/242），李斯特菌占比為7.94%（5/63）。5 株李斯特菌詳細(xì)菌株樣本信息見表 2。

2.2 PCR 鑒定結(jié)果

經(jīng)37℃ 24 h 培養(yǎng)，5 株分離株在李斯特菌顯色培養(yǎng)基上出現(xiàn)特異性藍(lán)色菌落，周圍有白色暈環(huán)，鏡檢結(jié)果為革蘭陽性小桿菌（圖1）。PCR 擴(kuò)增結(jié)果顯示，5 株分離株均擴(kuò)增出李斯特菌特異基因prs，結(jié)果為陽性，分離株 GZ-ZY2021-134、GZ-ZY2021-063、GZZY2021-035 和GZ-ZY2021-006 在 420 bp 處出現(xiàn)DNA條帶，擴(kuò)增出單增李斯特菌特異性基因lmo2234，即該4 株分離株為單增李斯特菌，而分離株GZ-ZY2020-111為李斯特菌，見圖2。

圖1 顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)情況及革蘭染色結(jié)果（×100）

圖2 5 株李斯特菌PCR 鑒定結(jié)果

2.3 血清型分型結(jié)果

利用多重PCR 方法擴(kuò)增李斯特菌的特異性基因lmo0737、lmo118、ORF2819、ORF2110 和 prs，進(jìn)行血清分型，PCR 擴(kuò)增結(jié)果顯示，分離株 GZ-ZY2021-006、GZ-ZY2021-063 和 GZZY2021-035 菌株在Lmo0733 特異性基因691 bp 處有擴(kuò)增條帶，為1/2 a、3a 血清型，屬于家系Ⅱ；分離株GZ-ZY2021-134 在ORF2110 特異性基因579 bp 處有擴(kuò)增條帶，為 4b、4d、4e 血清型，屬于家系Ⅰ。而分離株 GZ-ZY2020-111 結(jié)果為陰性，未檢測出其對應(yīng)的血清型（圖3）。

圖3 5 株李斯特菌多重PCR 血清型檢測結(jié)果

2.4 PFGE 分型結(jié)果

采用BioNumerics 8.0 軟件對5 株分離株的PFGE 電泳圖譜進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示經(jīng)限制性內(nèi)切酶 Asc Ⅰ酶切獲得5 種PFGE 帶型，相似性為 45%～85% 。其中分離株 GZ-ZY2021-063 和GZ-ZY2021-006 相似性為85%，分離株GZ-ZY2021-063 和GZ-ZY2021-035 相似性為77%，3 株李斯特菌血清型均為1/2 a、3a 血清型。而分離株GZ-ZY2021-134 血清型為4b、4d、4e，與分離株GZZY2021-006 和 GZ-ZY2020-111 相似性低于70%，見圖4。

圖4 5 株李斯特菌PFGE 分型結(jié)果

3 討論

李斯特菌是一種食源性人畜共患病原菌，人和動物一般通過攝入污染該菌的食物繼而感染李斯特菌病[12]。李斯特菌屬目前包括17 個李斯特菌種：6 個常見種和11 個新發(fā)現(xiàn)的種，其中單增李斯特菌和伊氏李斯特菌為致病性李斯特菌[13]。單增李斯特菌是導(dǎo)致人和動物李斯特菌病的主要病原體，而伊氏李斯特菌主要引發(fā)在嚙齒類動物[2]。在很多發(fā)達(dá)國家，由李斯特菌污染的食品而導(dǎo)致的患病率及死亡人數(shù)不斷上升，大量暴發(fā)事件備受關(guān)注。尤其以即食食品最為常見，包括即食熟肉、涼拌蔬菜、奶制品和水果等。有研究表明，2012—2014 年我國14 個省份，24 個城市的1 036 份蔬菜、生肉、乳制品等零售食物樣本，共分離到248 株單增李斯特菌[14]。本研究對242 份食品監(jiān)測標(biāo)本進(jìn)行分離培養(yǎng)鑒定，分離出的5 株李斯特菌主要來源于肉類、乳制品和米面制品，分離率為 2.07%，與全國主要污染食品一致，但分離率低于我國 2012—2014 年李斯特菌分離率。貴州省李斯特菌分離率較低可能與各地區(qū)飲食習(xí)慣不同以及檢測標(biāo)本較少有關(guān)。來自遵義市正安縣分離株GZ-ZY2020-111 為乳制品，經(jīng)PCR 鑒定非單增李斯特菌種屬，而其血清型分型失敗，提示貴州省可能出現(xiàn)李斯特菌其他種屬，需進(jìn)一步結(jié)合毒力基因檢測和全基因組測序結(jié)果共同進(jìn)行進(jìn)一步分析。

李斯特菌可分為13 種血清型，4 個家系[2]，根據(jù)流行病學(xué)資料發(fā)現(xiàn)，95%的李斯特菌病由血清型 1/2a、1/2b、4b菌株引起[15]。家系Ⅰ菌株多引起李斯特菌病的暴發(fā)和散發(fā)，主要包括血清型 1/2b 和 4b 菌株；家系Ⅱ菌株與食品及食品加工環(huán)境污染相關(guān)，主要包括1/2a 和 1/2c；家系Ⅲ和Ⅳ菌株較為罕見，主要和動物致病相關(guān)。本研究通過多重 PCR 法對遵義市5 株分離株進(jìn)行血清型分型，獲得的李斯特菌優(yōu)勢血清型主要為 1/2a、3a 血清型，其次是4b、4d、4e 血清型。其結(jié)果與北京市、重慶市等國內(nèi)的研究報(bào)道李斯特菌污染食品檢出的優(yōu)勢血清型為4b、1/2a 和1/2b 結(jié)果一致[16]，提示貴州省李斯特菌主要以食品污染為主，有人間感染的可能性。

PFGE 是基于細(xì)菌的 DNA 特征進(jìn)行分析通過電泳條帶比對菌株親緣關(guān)系，對于細(xì)菌的溯源，協(xié)助傳染病監(jiān)測、追蹤感染來源及識別暴發(fā)具有重要的意義[2]。為了進(jìn)一步了解貴州省遵義市分離的李斯特菌分子流行病學(xué)特征，本研究采用PFGE 分型方法將5 株李斯特菌分為5 種PFGE 帶型，相似性為45%～85%。結(jié)合血清型分型結(jié)果顯示，分離株 GZ-ZY2021-063 和GZ-ZY2021-006 相似性為85%，分別來自遵義市湄潭縣和遵義市紅花崗區(qū)，分離的食品來源分別為肉類制品和米面制品；而分離株GZ-ZY2021-063 和GZ-ZY2021-035 相似性為77%，均來自遵義市湄潭縣且均分離自肉類制品，該兩株分離株血清型均為1/2 a、3a 血清型，提示湄潭縣肉類食品可能存在食品污染情況。

綜上所述，2021 年貴州省遵義市食品環(huán)境中具有多種類型的李斯特菌，且可能隨著地區(qū)間食品運(yùn)輸和銷售鏈等途徑進(jìn)行擴(kuò)散傳播，但并未形成流行或聚集性病例，而是高度散發(fā)。由于本研究涉及的樣本數(shù)量較少，因貴州省2021 年尚無人間感染病例，監(jiān)測地區(qū)較為單一，結(jié)果是否具有代表性，還需要擴(kuò)大監(jiān)測樣本數(shù)量，加強(qiáng)人間病例監(jiān)測，擴(kuò)大監(jiān)測地區(qū)，通過全基因組測序方法、毒力基因檢測和耐藥基因研究進(jìn)行進(jìn)一步分析，以提供更全面的李斯特菌實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測數(shù)據(jù)。